СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ТИРЕОТОКСИКОЗА И КОЛЛОИДНОГО ЗОБА Российский патент 2009 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии.

Одним из необходимых условий успешного решения поставленных задач в экспериментальной фармакологии является использование достоверных моделей изучаемого заболевания, способных наиболее полно и объективно отразить суть происходящих патофизиологических сдвигов в организме подопытного животного.

Известные в настоящее время способы моделирования экспериментального гипертиреоза заключаются в экзогенном введении подопытным животным препаратов одного из тиреоидных гормонов (например, трийодтиронина). Такая модель гиперфункции щитовидной железы позволяет воспроизвести клиническую картину тиреотоксикоза и изучить влияние избытка тиреоидных гормонов в крови на периферические органы и системы организма (сердечно-сосудистую, нервную систему, печень, скелетную мускулатуру, уровень половых гормонов).

Однако следует отметить, что при выраженном функциональном гипертиреозе в крови повышено содержание общего Т₄, которое коррелирует с уровнем общего Т₃. Известно, что оба тиреоидных гормона способны вызывать ряд фармакологических эффектов, поскольку обладают собственными рецепторами в некоторых клетках-мишенях. Поэтому для воспроизведения наиболее полной клинической картины экспериментального гипертиреоза необходимо, чтобы гормональный статус был повышен за счет обоих тиреоидных гормонов.

Кроме того, следует отметить, что при способе моделирования гиперфункции щитовидной железы с использованием экзогенного введения тиреоидных гормонов по механизму обратной связи в тиреоидной паренхиме развивается клиническая картина, не характерная для моделируемой патологии в других тканях организма. При моделировании экспериментального гипертиреоза (тиреотоксикоза) организм в короткий срок насыщается экзогенными тиреоидными гормонами, что приводит к ингибированию тиреотропной активности гипофиза, и щитовидная железа лишается фактора, стимулирующего ее секреторную активность. Следствием этого является развитие морфологической картины гипотиреоза в тканях щитовидной железы, в то время как в периферических органах можно наблюдать функциональный гипертиреоз.

Моделирование структурной тиреоидной патологии также представляет значительный интерес, поскольку нарушения функции щитовидной железы всегда сопровождаются характерным изменением ее структуры. Поскольку наиболее распространенной формой структурной патологии щитовидной железы является коллоидный зоб, то изучение влияния лекарственных средств на процессы восстановления морфофункционального состояния зобноизмененной щитовидной железы является крайне информативным и позволяет определить характер тиреотропного действия изучаемого лекарственного средства.

Известно множество способов получения экспериментальной модели гипертиреоза на лабораторных крысах, отличающихся между собой как используемым тиреоидным гормоном, так и среднесуточной дозой, продолжительностью и способом его введения. Чаще всего для этой цели используют препараты одного из синтетических тиреоидных гормонов. Гораздо реже в настоящее время применяют органические препараты гормонов щитовидной железы (тиреоидин).

Известен способ моделирования тиреотоксикоза, включающий внутрижелудочное введение тиреоидина экспериментальному животному в течение 7 дней и дважды в сутки подкожно изадрина в дозе 0,04 г/кг (ав. св. СССР №1735892). На 8 сутки определяют массу тела, регистрируют электрокардиограмму, определяют ректальную температуру и потребление кислорода. Сопоставление полученных результатов с исходными данными показывает снижение массы тела на 26,5%, увеличение частоты сердечных сокращений на 98 ударов в мин, повышение ректальной температуры на 2,8°С и потребление кислорода на 0,019 л/100 г массы тела за 1 час, что свидетельствует о развитии тиреотоксикоза у экспериментальных животных.

Недостатком данного способа является развитие органотоксических эффектов тиреоидина, содержащего неочищенные тиреоидные гормоны. По этой причине тиреоидин в настоящее время имеет крайне ограниченное применение как в экспериментальной, так и в клинической фармакологии.

Также известен способ моделирования гиперфункции щитовидной железы с использованием тироксина в дозе 50 мг/100 г в течение 10 дней /1/, о развитии гиперфункционального состояния авторы судили по содержанию в сыворотке крови Т4, Т3 и ТТГ.

При изучении влияния экспериментального гипертиреоза на ацетилхолинэстеразу и активность (Na(+), К(+))- и Mg(2+)-АТФазы использовали внутрижелудочное введение тироксина в дозе 25 мг/100 г в течение 14 дней /3/.

При изучении антиоксидантной системы крыс с экспериментальным гипертиреозом, использовали для моделирования патологии трийодтиронин в дозе 20 мг/100 г в течение 1, 3 и 5 дней /5/. Недостатком данных методов является неполноценность клинической картины тиреотоксикоза, поскольку повышение уровня гормонов происходит только за счет вводимого гормона.

При изучении активности ферментов сердечной мышцы при экспериментальном тиреотоксикозе для моделирования патологии использовали тироксин, который крысы получали в концентрации 12 мг/л с питьевой водой /2/. Недостатком данного метода является отсутствие возможности точно дозировать вводимый тиреоидный гормон и контролировать индивидуальное введение препарата животному.

Наиболее близким техническим решением является способ моделирования тиреотоксикоза и коллоидного зоба, включающий внутрижелудочное введение экспериментальному животному тиреоидных гормонов, в частности тиреотома /6/. При изучении тиреотропной активности настойки баякона для моделирования экспериментального гипертиреоза использовали препарат тиреотом, содержащий комбинацию обоих тиреоидных гормонов, который вводился экспериментальным животным в дозе 20 мг/100 г в течение 8 недель. Клиническая картина патологии при этом способе моделирования была характерна для функционального гипертиреоза. Недостатком этого метода является опасность гибели животных (особенно молодых животных) при длительном введении большой дозы тиреоидных гормонов.

Задача изобретения - разработка способа моделирования гипертиреоза у лабораторных животных, отражающего получение полной клинической характеристики гипертиреоидного состояния (гиперфункция щитовидной железы или тиреотоксикоз), получение достоверной модели коллоидного зоба, а также повышение эффективности исследований за счет экономии лабораторно-диагностических средств и биологического материала.

Целью явилось создание в рамках одного эксперимента такой модели патологии щитовидной железы, которая позволяет получить в крови и периферических органах клиническую картину гиперфункции щитовидной железы, а в тиреоидной паренхиме создать патологию коллоидного зоба.

Указанный технический эффект достигается за счет использования способа моделирования тиреотоксикоза и коллоидного зоба, включающего внутрижелудочное введение экспериментальному животному тиреотома с последующим определением функциональной активности щитовидной железы. Тиреотом вводят в еженедельно возрастающей дозе, начиная с 25 мкг/кг до 200 мкг/кг, в течение 6 недель.

Экспериментальные исследования проводились на 60 белых нелинейных крысах-самцах массой 200-270 г. Все животные содержались в стандартных условиях вивария ВИЛАР на сбалансированном пищевом рационе с полноценным содержанием йода (1,00 мг/кг корма).

Модель экспериментального тиреотоксикоза получали путем ежедневного перорального введения препарата Тиреотом (Берин-Хеми, Германия), в еженедельно возрастающей дозе 25, 50, 100, 150, 200 мкг/кг. Препарат вводили в виде водной взвеси в течение 6 недель. После чего, с целью подтверждения патологии тиреотоксикоза, 10 крыс были забиты декапитацией, со взятием крови для определения уровня тироидных гормонов в сыворотке и выделением щитовидных желез для определения их массы и морфологического анализа ткани.

После четырехнедельного перерыва 40 животных с экспериментальным тиреотоксикозом использовали для последующего изучения влияния исследуемых лекарственных средств на восстановление функции щитовидной железы.

Контролем нормофункции щитовидной железы служили 10 интактных крыс, которые получали дистиллированную воду.

Для оценки функционального состояния щитовидной железы крыс использовали методы, имеющие наибольшую диагностическую значимость: радиоиммунологическое определение содержания тиреоидных гормонов в сыворотке крови и морфологический анализ тканей щитовидной железы.

Радиоиммунологический анализ (РИА) свободных трийодтиронина (Т₃) и тироксина (Т₄) в сыворотке крови крыс проводили с использованием наборов Total Т₄ RIA KIT и Total Т₃ RIA KIT фирмы Immunotech, Bekman (Чехия). Концентрацию гормонов расчитывали автоматически по калибровочной кривой на γ-счетчике фирмы LKB (Швеция). Для морфологического анализа обе доли щитовидной железы крыс сразу после отделения взвешивались на торсионных весах с определением абсолютной массы (в мг) с точностью до 0,01 г. и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Гистологическую обработку проводили общепринятыми методами (Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники / Г.А.Меркулов. - М.: Медицина, 1969. - 423 с). Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм готовили на микротоме Reichert (Австрия). Окраску образцов проводили по традиционной методике гемотоксилин-эозином (Волкова О.В. Основы гистологии с гистологической техникой / О.В.Волкова, Ю.К.Елецкий - М.: Медицина, 1971. - 271 с).

Для объективной оценки морфофункционального состояния щитовидной железы использовали количественные методы анализа тканевых компонентов, в том числе разработанные для эндокринных органов (О.К.Хмельницкий, 2002; В.Л.Быков, 1975; К.Ташкэ, 1980; Г.Г.Автандилов, 1990). Стереоскопическим методом точечного счета с помощью компьютерной программы на гистологических срезах определяли относительную площадь тканевых компонентов щитовидной железы: фолликулярного эпителия, коллоида, интерфолликулярных островков, десквамированного эпителия, соединительной ткани, лимфатической инфильтрации и сосудистого русла.

С помошью окуляр-микрометра определяли параметры фолликулов щитовидной железы: среднюю высоту фолликулярного эпителия (h), среднюю площадь ядер тироцитов (d), средний диаметр фолликулов (D). Произведен подсчет доли (%) фолликулов разной величины диаметров в общей выборке. В вариационном ряду диаметров принимали за мелкие - фолликулы до 50 мкм, средние - до 100 мкм и крупные - свыше 100 мкм. Проводили не менее 100 измерений в 40 фолликулах каждого образца, всего проводили не менее 400 измерений для каждого показателя.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ статистического анализа Statistica 6,0 (StatSoft, США). Использовались критерий Манна-Уитни для сравнения независимых выборок, тест Вилкоксона для сравнения связанных выборок. Для оценки значимости отличий между выборками с распределением, приближающимся к нормальному, использовался t-критерий Стьюдента.

В таблицах 1 и 2 представлены данные о тиреоидном статусе, изменении массы тела и щитовидной железы, а также морфофункциональные характеристики тканей щитовидной железы крыс при моделировании экспериментального тиреотоксикоза.

Согласно результатам радиоиммунологического анализа, при способе моделирования гиперфункции щитовидной железы с использованием возрастающих доз тиреотома, уровень обоих тиреоидных гормонов в сыворотке крови экспериментальных животных был повышен. Так, содержание тироксина и трийодтиронина составило соответственно 117% и 122% от среднего значения этих показателей в сыворотке крови у интактных крыс, а значение индекса дейодирования было приближено к норме. При этом отмечено также значительное снижение массы тела животных, а также уменьшение абсолютной и увеличение относительной массы щитовидной железы по сравнению с интактными животными (р<0,05) (табл.1).

Результаты морфологического анализа тканей щитовидной железы крыс, получавших тиреотом, показали наличие полиморфопластического коллоидного зоба. В структуре щитовидной железы крыс преобладали фолликулы среднего (56,8%) и мелкого (26,6%) размера и максимальное число крупных фолликулов (16,6%) по сравнению с этим показателем во всех других группах исследованных животных. Вариабельность размеров фолликулов была в диапазоне от 20,84 до 259,37. При этом по периферии долей выявлялись значительно увеличенные фолликулы, занятые уплотненным коллоидом и тенденцией к образованию тиреокомплексов, а в центре органа фолликулы меньшего размера.

В большинстве гистологических препаратов щитовидной железы крыс наблюдался низкий фолликулярный эпителий, средняя высота которого составила 6,2±3,68 мкм. Ядра тироцитов были уплощенной формы, средней площадью 11,1±3,39 мкм², что меньше среднего значения этого показателя в группе интактных крыс (р<0,05). Общепризнано, что снижение высоты тиреоидного эпителия и уменьшение площади ядер тироцитов указывает на снижение функциональной активности щитовидной железы, что в данном случае связано с длительным введением тиреоидных гормонов и блокированием собственной гормональной продукции щитовидной железы.

Эти результаты подтверждает также морфометрический анализ тканевых компонентов щитовидной железы крыс, получавших тиреотом. Так, установлено, что при введении тиреотома у крыс более половины объема железы было занято коллоидом 54,1±16,89% (у интактных 39,9±13,26%), при этом средний диаметр фолликулов составил 74,3±38,02, что выше среднего значения этого показателя у интактных животных (р<0,05).

О снижение функциональной активности щитовидной железы свидетельствует уменьшение относительного объема фолликулярного и интерфолликулярного тиреоидного эпителия, на который приходилось соответственно 20,8±11,27% и 4,1±5,47% объема железы, значения этих показателей у интактных крыс составляли 33,7±9,11% и 8,1±9,27% соответственно.

Следует отметить наличие некоторых некротических проявлений, наблюдаемых в паренхиме щитовидной железы крыс, получавших тиреотом в возрастающей дозе. Так, отмечено увеличение относительного объема десквамированных клеток 5,8±11,31% (у интактных 1,3±2,60%), который имел обратную корреляцию с объемом фолликулярных тироцитов (r=-0,54) и в меньшей степени с объемом интерфолликулярных тиреоидных клеток (r=-0,28). По всей видимости, избыток тироидных гормонов приводил к деструктивным процессам в фолликулах, затрагивающим не только междольковые перегородки, но и стенки фолликулов, в конечном счете, приводящим к их частичной фрагментации. Вследствие этого, в некоторых участках органа наблюдались очаги лимфоцитарной и макрофагальной инфильтрации, относительный объем которых составлял 0,9±2,82%, что выше значения этого показателя у интактных животных (0,1±0,43%). На деструктивные процессы в строме органа указывают также и кровоизлияния, связанные, скорее всего с разрушением стенки сосудов. Изучение сосудистого русла показало наличие очагов кровоизлияния, при этом относительная площадь сосудистого русла составила 5,1±2,48%, что значительно ниже, чем в группе интактных животных (11,8±4,80%). Также отмечено увеличение относительного объема соединительной ткани, в этой группе животных 8,9±10,42% против 5,0±4,07% у интактных крыс (табл.2). Однако следует отметить, что это увеличение имеет прямую корреляционную связь с количеством десквамированных тироцитов (r=0,43), и согласно морфологической картине стромы сопровождается не процессами склерозирования щитовидной железы, а наличием воспаления, отека и некротического процесса соединительной ткани, на это указывает также и незначительное количество клеток фибробластического ряда в строме.

Можно заключить, что морфологическая картина тканей щитовидной железы крыс, получавших возрастающие дозы тиреоидных гормонов характерна для выраженной патологии гипотиреоза с полиморфопластическим типом строения коллоидного зоба.

Таким образом, разработана экспериментальная модель тиреотоксикоза у крыс, наиболее полно отражающая клиническую картину функционального гипертиреоза с повышенным содержанием обоих тиреоидных гормонов Т₃, Т₄ в сыворотке крови подопытных животных, при этом в тиреоидной паренхиме получена морфологическая картина выраженной тиреоидной гипофункции с полиморфопластическим типом строения коллоидного зоба.

Преимуществами предложенного способа моделирования тиреотоксикоза являются:

1) возможность воспроизвести наиболее характерную картину гормональной перестройки, наблюдающуюся в большинстве случаев гиперфункции щитовидной железы, что позволяет использовать данную модель для изучения влияние избытка тиреоидных гормонов в крови на органы и системы подопытного животного (сердечно-сосудистую, нервную систему, печень, мышечную ткань и т.д.);

2) использование возрастающих доз тиреотома позволяет получить морфологическую картину коллоидного зоба у крыс, которую можно использовать для изучения терапевтического влияния лекарственных средств на процессы восстановления функциональной активности щитовидной железы в условиях зобной патологии с гипофункциональным коллоидным типом строения железы;

3) использование возрастающих доз тиреотома является безопасным и позволяет сократить гибель животных в ходе эксперимента.

Источники информации

1. Aragao CN, Souza LL, Cabanelas A, Oliveira KJ, Pazos-Moura CC. Effect of experimental hypo- and hyperthyroidism on serum adiponectin.: Metabolism. 2007 Jan; 56(1): 6-11.

2. Araujo AS, Ribeiro MF, Enzveiler A, Schenkel P, Fernandes TR, Partata WA, Irigoyen MC, Llesuy S, Bello-Klein A. Myocardial antioxidant enzyme activities and concentration and glutathione metabolism in experimental hyperthyroidism // Mol Cell Endocrinol. 2006 Apr 25; 249(1-2): 133-9.

3. Carageorgiou H, Pantos C, Zarros A, Stolakis V, Mourouzis I, Cokkinos D, Tsakiris S. Effects of hyper- and hypothyroidism on acetylcholinesterase, (Na(+), К (+))- and Mg (2+)-ATPase activities of adult rat hypothalamus and cerebellum. Metab Brain Dis. 2007 Mar; 22(1): 31-8.

4. Ozdemir S, Yucel R, Dariyerli N, Toplan S, Akyolcu MC, Yigit G, Hatemi H. The effects of experimental hyperthyroidism on hemorheology and plasma fibrinogen concentration // Endocrine. 2006 Oct; 30(2): 203-5.

5. Sahoo DK, Roy A, Bhanja S, Chainy GB. Experimental hyperthyroidism-induced oxidative stress and impairment of antioxidant defence system in rat testis // Indian J Exp Biol. 2005 Nov; 43(11): 1058-67.

6. Влияние настойки баякон на функцию щитовидной железы при экспериментальном гипо- и гипертиреозе у крыс / Л.С.Васильева, В.Г.Изатуллин, Е.С.Манюк, А.А.Семенов // Химико-фармацевтический журнал: научно-технический и производственный журнал. - 2005. - Том 39, N5. - С.23-25.

Таблица 1.
Показатели функциональной активности щитовидной железы крыс в условиях экспериментального тиреотоксикоза и в норме. Показатели Ед. измерения интактные тиреотом T₄ нмоль/л 39,95 [27,63; 49,84] 46,80 [25,41; 55,05] Т₃ 0,73 [0,60; 0,77] 0,89 [0,58; 1,30] Индекс дейодирования T₃/T₄ 0,022±0,0141 0,023±0,0068 Масса тела животного г 366,7±30,31 174,4±26,97 масса щитовидной железы мг 21,6±3,75 15,4±3,02* Относительная масса щитовидной железы мг/кг 6,2±0,89 8,8±2,31* * - обозначаются статистически значимые отличия групп (t-критерий Стьюдента). Таблица 2.
Морфофункциональные изменения щитовидной железы крыс в условиях введения тиреотома. показатели Ед. измерения интактные тиреотом Фолликулярные тироциты % 33,7±9,11 20,9±11,27 коллоид % 39,9±13,26 54,1±16,89 строма % 5,1±4,07 8,9±10,42 Интерфолликулярные тироциты % 8,1±9,27 4,1±5,47 Десквамированные тироциты % 1,3±2,60 5,9±11,30 сосуды % 11,8±4,8 5,2±2,48 лейкоциты % 0,1±0,43 0,9±2,82 Диаметр фолликула мкм 59,0±24,83 74,2±38,02 Высота эпителия мкм 8,2±2,69 6,1±1,89 Площадь ядер тироцитов мкм² 14,1±3,45 11,1±3,39

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к моделированию тиреотоксикоза. Для этого внутрижелудочно вводят животному тиреотом в еженедельно возрастающей дозе, начиная с 25 мкг/кг до 200 мкг/кг, в течение 6 недель с последующим определением функциональной активности щитовидной железы. Способ обеспечивает создание такой патологии щитовидной железы, которая позволяет получить в крови и периферических органах клиническую картину гиперфункции щитовидной железы, а в тиреоидной паренхиме создать патологию коллоидного зоба. 2 табл.

Способ моделирования тиреотоксикоза и коллоидного зоба, включающий внутрижелудочное введение экспериментальному животному тиреотома с последующим определением функциональной активности щитовидной железы, отличающийся тем, что тиреотом вводят в еженедельно возрастающей дозе, начиная с 25 до 200 мкг/кг, в течение 6 недель.