СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТИРЕОПЕРОКСИДАЗЫ В ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЕ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/48 

Область применения: Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, патологической анатомии, гистологии, может использоваться для дифференциальной диагностики заболеваний щитовидной железы. Известно, что гормоны щитовидной железы содержат аминокислоту тирозин и атомы йода. Последние поставляются путем расщепления йодидов в цитоплазме фолликулярных тироцитов. Далее эти компоненты переходят в коллоид и связываются с глобулином с образованием белкового комплекса-тиреоглобулина. В последующем он захватывается тироцитами, где, расщепляясь, выделяет гормон (J 1-4 + Тирозин), который поступает в циркуляцию. В этих процессах роль поставщика атомов йода, путем расщепления йодидов, выполняет фермент - тиреопероксидаза (ТПО). Следовательно, надо полагать, что продукция тиреоидных гормонов находится в зависимости от активности фермента.

Существует ряд гистохимических методов определения цитохимической активности ТПО: 1. По де Робертису (1946) и Манчини (1970), где используются последовательно растворы молибдата аммония и насыщенный раствор бензидина в 0.9% NaCL; 2. По Ван-Дейну (1955), где используются последовательно: насыщенный раствор хлористого аммония, раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты и насыщенный раствор бензидина.

Суть указанных методов в том, что криостатные срезы из свежезамороженных кусочков органа инкубируются в указанных растворах, а далее переносятся на предметные стекла с последующим заключением в определенные среды.

Критика аналогов

При попытке использовать указанные методы были обнаружены следующие недостатки.

1. Трудно перенести криостатные срезы в раствор из-за быстрого их сворачивания при перемене температурного режима.

2. При инкубации в растворах теряется активность фермента, поскольку при этом значительная часть продуктов реакции смывается со структур и переходит в жидкость.

3. Весьма трудно, а чаще невозможно, перенести срезы с раствора на стекла и расправить их.

Таким образом, при постановке реакции указанными методами объективная оценка содержания фермента в структурах органа не представляется возможным.

Прототип изобретения.

В качестве прототипа взят метод по де Робертису, который заключается в следующем.

1. Криостатные срезы толщиной 20-40 мк, сделанные и свежих тканей, поместить в 0,85% раствор NaCl при 4° на 3 мин.

2. Поместить препараты в 0.1% раствор молибдата аммония в 0,85% растворе NaCl на 5 мин.

3. Перенести срезы в насыщенный раствор бензидина в 0,85% растворе NaCl, к которому перед употреблением добавляют 3% перекись водорода (1 каплю на 2 мл). При помощи стеклянной палочки перемешивают срезы в инкубационной среде до тех пор, пока не появится синяя окраска (30-40 сек). Оставить срезы в растворе, чтобы общая продолжительность инкубации составила 2 мин.

4. Промыть в 0,85% растворе NaCl.

5. Заключить в глицерин-желатину.

Критика прототипа

1. При неоднократном переносе в растворы срезы сворачиваются, и расправить их на предметных стеклах не представляется возможным.

2. Процесс переноса срезов в растворы, а далее на стекла, приводит наряду с потерей активности фермента, к деформации и разрушению структур.

3. Последующее заключение в среды приводит к существенному обесцвечиванию окрашенных продуктов реакции, что сводит на нет возможность количественной оценки активности фермента.

Цель изобретения

Целью изобретения является выявление активности тиреопероксидазы (ТПО) в фолликулярных тироцитах, а также определение ее количественного содержания для установления функционального состояния щитовидной железы.

Описание изобретения

1. Взятый свежий (послеоперационный) материал необходимо в течение 10-15 мин. перенести в морозильную камеру холодильника до подготовки криостата к необходимому температурному режиму. Это в тех случаях, когда нет возможности пользоваться криостатом сразу после взятия материала. Проведенные серии экспериментов показали, что без существенной потери активности материал можно хранить 1 сутки. Тут важно отметить, что перенести материал из холодильника в криостат следует без момента размораживания.

2. Полученные срезы толщиной 15-20 мк переносятся на предметные стекла и хранятся 2 часа с целью высушивания.

3. Предметные стекла со срезами покрывают 0.3% раствором молибдата аммония на 5 минут. Криостатные срезы переносят на предметные стекла и оставляют на 2 ч для высушивания при температуре воздуха 18° по Цельсию, после этого срезы покрывают 0,3% раствором молибдата аммония на 5 мин, затем сливают раствор и покрывают срезы инкубационной средой, приготовленной из 1 мл насыщенного раствора бензидина с добавлением 1 капли 0,3% раствора перекиси водорода и переносят на столик микроскопа с фотонасадкой, через 15 мин проводят съемки.

4. После слива предыдущего раствора стекла покрывают инкубационной средой на 15 минут.

Инкубационная среда готовится следующим образом: в бюксик наносится 1 мл насыщенного раствора бензидина и добавляют 1 каплю 0.3% раствора перекиси водорода (раствор рассчитан на 3-4 стекла).

5. По истечении времени инкубации стекла с инкубационной средой переносят на столик микроскопа с фотоприставкой (для этих целей очень удобен немецкий микроскоп EVOS с экраном) и сразу же делают съемки. Оптимальное увеличение, при котором удается четко видеть окрашенные структуры - 400. При использовании предлагаемого способа в местах локализации фермента на голубоватом фоне цитоплазмы фолликулярных тироцитов образуются темно-синие гранулы. При этом четко очерчены неокрашенные ядра тироцитов.

Предлагаемый способ иллюстрируют фото срезов.

Фото 1. Щитовидная железа больных с клиническим диагнозом: а - диффузный токсический зоб 4 ст., б - диффузно-узловой эутиреоидный зоб 3 ст., в - узловой эутиреоидный зоб 3 ст., г - узловой эутиреоидный зоб 2 ст. Реакция на ТПО (ув. 400).

Функциональное состояние щитовидной железы, установленное на основании результатов предлагаемого способа, где на фото 1

поз. а - тиреотоксикоза тяжелой степени,

поз. б - тиреотоксикоза средней степени тяжести,

поз. в – эутиреоза,

поз. г - гипотиреоза.

Технический результат

Предлагаемый способ выявления активности ТПО в щитовидной железе, который позволяет судить и о количественном ее содержании, даст возможность хирургам и терапевтам назначить адекватное послеоперационное лечение в зависимости от установленного функционального состояния органа. Кроме того, результаты предлагаемого способа позволят патологоанатомам расширить гистологическое заключение функционально в плане установления состояния тиреотоксикоза, эутиреоза или гипотиреоза.

Примеры конкретного выполнения способа

1. Больной Р. поступил в отделение эндокринной хирургии РКБ 26.10.15 г. с диагнозом «диффузный токсический зоб тяжелой степени». Жалобы на опухолевидное образование на передней поверхности шеи, затруднение дыхания при быстрой ходьбе и физической нагрузке, тахикардию, раздражительность, головные боли, слабость.

Содержание тиреоидных гормонов в крови: Т4 св - 15,15 пмоль/л (9,0-22,0); ТТГ - 0,039 мЕд/л (0,4-4,0).

Клинический диагноз: Многоузловой токсический зоб 4 степени. Медикаментозный эутиреоз. Проведена операция - субфасциальная тиреоидэктомия.

Гистозаключение: Базедофицированный микро- и макрофолликулярный диффузный коллоидный зоб.

Реакция на ТПО, проведенная по предлагаемому способу. Фото 1, поз. а. Активность в стенке фолликулов (в цитоплазме фолликулярных тироцитов) высокая. В крупных фолликулах много интрафолликулярных впячиваний. Имеются очаги пролиферации фолликулов с высоким содержанием продуктов реакции.

Гистохимическое заключение: Признаки диффузно-узлового токсического зоба тяжелой степени, состояние выраженного тиреотоксикоза).

2. Больная Ш. поступила в отделение эндокринной хирургии РКБ 21.10.15 г. с диагнозом «Диффузно-узловой эутиреоидный зоб 3-й степени». Жалобы на опухолевидное образование на передней поверхности шеи, головные боли, дискомфорт в шее.

Содержание тиреоидных гомонов в крови: Т4 об. - 21,8 (59-153) нмоль/л, Т3 об. - 13.7 (0,56-1,88) нг/мл, ТТГ - 0,1 мЕд/л (0,4-4,0).

Клинический диагноз: Диффузно-узловой эутиреоидный зоб 3 степени. Проведена операция - субфасциальная тиреоидэктомия.

Гистозаключение: На фоне коллоидного зоба узлы фолликулярной аденомы, с очаговой лимфоцитарной инфильтрацией.

Реакция на ТПО, проведенная по предлагаемому способу. На фото 1, поз. б, преобладают очаги пролиферативной активности (фолликулярная аденома) с высокой и умеренной активностью. Фолликулы в основном малых размеров, в стенке умеренная и высокая активность. Признаки аутоиммунного тиреоидита (АИТ).

Гистохимическое заключение: Тиреотоксикоз при АИТ, состояние умеренного тиреотоксикоза.

3. Больная М. поступила в отделение эндокринной хирургии РКБ 3.10.15 г. с диагнозом «Узловой эутиреоидный зоб 3 степени». Жалобы на опухолевидное образование на передней поверхности шеи, головные боли, дискомфорт в шее.

Содержание тиреоидных гормонов в крови: ТТГ - 0,05 (0,4-4,0) мЕд/л, Т4 св. - 13,6 (10,3-24,5) пмоль/л, AT к ТПО - <10 (0-35) ме/мл.

Клинический диагноз: Узловой эутиреоидный зоб 3 степени. Проведена операция - субфасциальная тиреоидэктомия.

Гистозаключение: Паренхиматозно-коллоидный зоб с расстройством кровообращения.

Реакция на ТПО, проведенная по предлагаемому способу. На фото 1, поз. в, преобладают фолликулы средних и малых размеров, в стенке умеренная и слабая активность. Преобладают фолликулы со слабой активностью. Очаги лимфоидной инфильтрации.

Гистохимическое заключение: Эутиреоз при АИТ. Состояние функционального эутиреоза.

4. Больная С. поступила в отделение эндокринной хирургии РКБ 29.10.15 г. с диагнозом «Узловой эутиреоидный зоб 2 степени». Жалобы на опухолевидное образование на передней поверхности шеи, затрудненное дыхание при физической нагрузке, дисфагию, чувство дискомфорта в области шеи, головные боли, слабость.

Содержание тиреоидных гомонов в крови: Т4 св. - 13,4 (9-22) пмоль/л, ТТГ - 0,7 (0,22-3,4) м Ед/л, ТГ - 59 (до - 55) нг/мл.

Клинический диагноз: Узловой эутиреоидный зоб 2 степени. Проведена операция - субфасциальная тиреоидэктомия.

Гистозаключение: Макро- и микрофолликулярный коллоидный зоб с полями фибротизации и формированием узловатых комплексов.

Реакция на ТПО, проведенная по предлагаемому способу. На фото. 1, поз. г, преобладают фолликулы крупных и средних размеров. Активность фермента в стенке преимущественно слабая, лишь в отдельных участках умеренная активность. В межфолликулярной ткани имеются единичные очаги пролиферации тироцитов с умеренной активностью.

Гистохимическое заключение: Первичный гипотиреоз (последствие АИТ). Состояние функционального гипотиреоза.

Признаки изобретения, отличительные от прототипа:

1. Криостатные срезы сразу переносят на предметные стекла (по прототипу - помещают в раствор).

2. Используют 0,3% раствор молибдата аммония (в прототипе - 0,1% раствор, но такая концентрация не дает нужного результата).

3. Инкубационная среда в виде капель наносится на высушенные на предметных стеклах срезы (в прототипе срезы заливают инкубационной средой в бюксике, это затрудняет работу со срезами, разрушается их структура).

4. Предметное стекла после нанесения инкубационного раствора сразу переносятся на столик микроскопа с фотонасадкой. Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять активность тиреопероксидазы под визуальным наблюдением (по прототипу реакция идет в бюксике с инкубационной средой).

5. По истечении времени инкубации (15 мин), не сливая инкубационный раствор со стекол, сразу же проводятся съемки (в прототипе, по окончании инкубации, срезы переносятся на предметные стекла, а далее заключаются в глицерин-желатину).

Положительный эффект изобретения

Предлагаемый способ позволяет определить функциональное состояние органа, а именно: тиреотоксикоза, эутиреоза и гипотиреоза, поскольку гормональный статус щитовидной железы находится в зависимости от активности тиреопероксидазы (ТПО) - поставщика атомов йода. При патоморфологических исследованиях обычно указывается наличие морфологических разновидностей зоба, в том числе и опухолей, а также признаков воспалительного процесса.

Таким образом, предлагаемый способ может дополнить патоморфологические данные функциональными, что важно при определении дальнейших послеоперационных лечебных мероприятий.

Информация, принятая во внимание

Метод по де Робертису - Э. Пирс «Бензидиновая реакция на перокосидазу», учебник гистохимии, 1962. С. 837 – прототип.

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики заболеваний щитовидной железы. Способ по изобретению представляет собой метод по де Робертису. Криостатные срезы переносят на предметные стекла и оставляют на 2 ч для высушивания при температуре воздуха 18° по Цельсию, после этого срезы покрывают 0,3% раствором молибдата аммония на 5 мин. Затем сливают раствор и покрывают срезы инкубационной средой, приготовленной из 1 мл насыщенного раствора бензидина с добавлением 1 капли 0,3% раствора перекиси водорода и переносят на столик микроскопа с фотонасадкой, через 15 мин проводят съемки. Использование изобретения позволяет определить функциональное состояние щитовидной железы. 1 ил., 4 пр.

Способ определения активности тиреопероксидазы в щитовидной железе, представляющий собой метод по де Робертису, отличающийся тем, что криостатные срезы переносят на предметные стекла и оставляют на 2 ч для высушивания при температуре воздуха 18° по Цельсию, после этого срезы покрывают 0,3% раствором молибдата аммония на 5 мин, затем сливают раствор и покрывают срезы инкубационной средой, приготовленной из 1 мл насыщенного раствора бензидина с добавлением 1 капли 0,3% раствора перекиси водорода и переносят на столик микроскопа с фотонасадкой, через 15 мин проводят съемки.