СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНОВЫХ ИМПЛАНТАТОВ Российский патент 2009 года по МПК A61K35/32 A61L27/24 A61L15/32 

Изобретение относится к медицине, а именно к восстановительной хирургии, и предназначено для получения биологического пластического материала, используемого при оперативном лечении повреждений связок, сухожилий и других мягких тканей, для закрытия раневых поверхностей, в качестве барьерных мембран, а также в качестве носителя биологически активных веществ, клеток, лекарственных средств.

Известен способ получения коллагена из костной ткани. По этому способу костную ткань механически очищают, распиливают на пластины толщиной от 0,1 до 2,0 см, промывают 0,1 М раствором фосфатного буфера с рН 5,8-6,0, переваривают в растворе активного 0,125-0,325% папаина при 60°С в течение 24 часов, промывают 5-ю объемами воды при 60°С, обрабатывают при комнатной температуре в течение 10-14 часов 0,4 Н раствором щелочи, отмывают проточной водой, обрабатывают 3% раствором перекиси водорода в течение 4 часов, затем обезжиривают в смеси этанол/хлороформ в соотношении 1:2, проводят декальцинацию в 0,5-1,0 Н соляной кислоте, отмывают водой очищенной, этанолом и высушивают при комнатной температуре, фасуют и стерилизуют радиационным способом (Патент РФ №2273489 от 2 мая 2006 года), который выбран за прототип, поскольку наиболее близок по своему техническому решению к предлагаемому изобретению.

Недостатками указанного способа является то, что он применим только для получения коллагена из костной ткани, а использование при обработке папаина приводит к изменению нативной структуры коллагена, что в свою очередь ведет к снижению механической прочности коллагена и делает его более доступным для клеточных ферментов, что приводит к ускорению резорбции имплантата в организме реципиента.

Задачей изобретения является получение коллагеновых имплантатов, пригодных для операций на мягких тканях.

Техническим результатом предлагаемого способа является получение коллагеновых имплантатов с высокой степенью биосовместимости, которые могут быть использованы при оперативном лечении для восстановления целостности связок, сухожилий, для закрытия раневых поверхностей, в качестве барьерных мембран между тканями разного вида, в качестве носителя биологически активных веществ, клеток, лекарственных средств.

Технический результат достигается тем, что в качестве сырья используют мягкотканные образования соединительной ткани, после механической очистки фрагменты ткани последовательно обрабатывают смесью раствора Triton х-100 и раствора дезоксихолата натрия, обрабатывают раствором щелочи, обрабатывают раствором кислоты и хлорида натрия, лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют радиационным методом.

Материалом для получения коллагеновых имплантатов могут служить мягкотканные образования соединительной ткани, такие как сухожилия, связки, фасции, твердая мозговая оболочка, перикард, хрящи человека и животных, например свиней, коров, баранов и.т.д.

Перед началом химической обработки фрагменты ткани необходимого размера механически очищают от окружающих мягких тканей и крови.

Как известно, трансплантационные антигены соединительной ткани сосредоточены главным образом на поверхности клеточных и базальных мембран. По своей химической природе антигены, содержащиеся в соединительной ткани, представляют собой главным образом гликопротеины, протеогликаны, сиалопротеины, липопротеины. Межклеточное вещество, структурированный коллаген, обладает намного более низкой видовой специфичностью в сравнении с другими белками организма. Таким образом, весь процесс обработки направлен на то, чтобы удалить высокоантигенные компоненты ткани и при этом сохранить структуру коллагена, который обуславливает механические свойства имплантатов.

Для этого после механической очистки материал обрабатывают смесью поверхностно-активных веществ (ПАВ) 1% раствора Triton х-100 и 3% раствора дезоксихолата натрия в ультразвуковой ванне при температуре 30°С в течение 3-6 часов с двукратной сменой раствора. Эта композиция ПАВ наиболее эффективно удаляет из ткани клетки, остатки клеточных и базальных мембран, липопротеины и омыляемые жиры, но могут использоваться и другие ПАВ. После обработки ПАВ материал промывают проточной водой.

После этого материал помещают в 0,1 М раствор гидроксида натрия (NaOH). На данном этапе из материала удаляют белки, расположенные на поверхности коллагена, гликопротеины, сиалопротеины и гликозаминогликаны. Обработку проводят в ультразвуковой ванне в течение 10 часов при комнатной температуре.

Затем материал обрабатывают раствором, содержащим 1 М соляной кислоты (HCl) и 1 М хлорида натрия (NaCl) в течение 10 часов. Обработка кислотой позволяет удалить из материала остатки неколлагеновых кислоторастворимых белков, гликопротеинов и гликозаминогликанов, нуклеиновые кислоты, а присутствие соли позволяет избежать набухания коллагена и ускоряет вымывание неколлагеновых белков из материала. Для большей эффективности процесс проводят в ультразвуковой ванне при комнатной температуре.

После обработки кислотой необходимо довести рН материала до нейтрального и отмыть от остатков растворов. Для этого материал последовательно помещают сначала в раствор, содержащий 1 М NaCl и 0,1 М фосфатного буфера на 10 часов, затем промывают в 0,1 М растворе фосфатного буфера, а затем трехкратно промывают дистиллированной водой.

После окончания химической обработки материал лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют радиационным методом.

Проведенные нами исследования состава полученных имплантатов показывают, что содержание жира в них около 0,7%, содержание гликозаминогликанов мене 1%, содержание коллагена 93% к сухому весу образца. При исследовании гистологических срезов и по данным электронной микроскопии установлено, что в образцах отсутствуют какие-либо клетки и структура коллагена имеет типичный для соединительной ткани вид.

Пример осуществления способа.

Твердую мозговую оболочку человека механически очищают от сопутствующих мягких тканей и крови и нарезают на фрагменты размером 2×3 см. 100 грамм материала помещают в ультразвуковую ванну, заливают 1 литром раствора, содержащего 1% Triton x-100 и 3% дезоксихолата натрия, и обрабатывают в течение 3 часов при температуре 30°С с двукратной сменой раствора, раствор сливают, заготовки промывают в проточной воде, после чего заливают 1 литр 0,1 М раствора гидроксида натрия (NaOH) и обрабатывают в течение 10 часов при комнатной температуре, раствор сливают и фрагменты заливают 1 литром раствора, содержащего 1М соляной кислоты (HCl) и 1 М хлорида натрия (NaCl), и обрабатывают в течение 10 часов при комнатной температуре, раствор сливают и заливают 1 литр 0,1 М раствора фосфатного буфера с 1 М NaCl, обрабатывают при комнатной температуре в течение 10 часов, затем промывают 1 литром 0,1 М раствора фосфатного буфера, после этого трехкратно промывают дистиллированной водой.

Обработанный таким образом материал лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.

Пример практического применения коллагенового имплантата из твердой мозговой оболочки (тмо) в качестве барьерной мембраны, полученной описанным способом.

Больной К., 46 лет, истории болезни №1365. Больной обратился в клинику МОНИКИ по поводу хронического периодонтита 37, отсутствия 36 и 35. На рентгенограмме деструктивных изменений костной ткани в проекции отсутствующих 35, 36 и корней 37 не выявлено. Предложен план лечения: дентальная имплантация по двухэтапной методике в сегментах 35 и 36, а также в сегменте 37 одномоментно с удалением 37 и замещением костной полости деминерализованными костными чипсами с перекрытием зоны барьерной мембраной из тмо размером 1,5 на 2 см. Перед операцией проведена клинико-рентгенологическая и лабораторная диагностика, противопоказаний к операции нет.

Ход операции: под местной анестезией разрез слизистой по альвеолярному гребню в области отсутствующих 35 и 36, вокруг корня 37 и дополнительные вертикальные разрезы, отслоены лоскуты, удален 37, проведен тщательный кюретаж лунки, туалет раны растворами антисептиков, установлены дентальные имплантаты в сегментах 35 (4 на 13 мм), 36 (5 на 13 мм) и на место удаленного 37 (5 на 13 мм), где костные полости выполнены деминерализованными костными чипсами, смешанными предварительно с раствором 30% линкомицина гидрохлорида, зона имплантации перекрыта барьерной мембраной из тмо, предварительно замоченной на 20 минут в физиологическом растворе и пропитанной кровью пациента, лоскуты мобилизованы и фиксированы швами. В послеоперационном периоде проводилась антибактериальная, противовоспалительная терапия, заживление первичным натяжением, субъективно значительных отеков и болевого синдрома не отмечалось. Рентгенологический контроль проведен после операции сразу, через 1, 3 и 5 месяцев. Через 5 месяцев после операции отмечено формирование полноценной костной ткани в зоне пластики, полная резорбция мембраны из тмо. Результат применения мембраны из тмо при одномоментной дентальной имплантации следует признать удовлетворительным, а именно полная резорбция через 5 месяцев и формирование под ней полноценной костной ткани.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получить коллагеновые имплантаты с высокой степенью биосовместимости, которые можно использовать для оперативного лечения сухожильно-связочного аппарата и повреждений других мягких тканей, в качестве барьерных мембран для отделения одного вида тканей от другого, как носитель клеток, лекарственных средств и биологически активных веществ.

Изобретение относится к медицине, а именно к восстановительной хирургии, и предназначено для получения биологического пластического материала. Сущность способа: в качестве исходного материала используют сухожилия, связки, фасции, твердую мозговую оболочку, перикард, хрящи человека и животных, после механической очистки ткань нарезают на фрагменты необходимого размера, обрабатывают смесью растворов 1% Triton x-100 и 3% дезоксихолата натрия в ультразвуковой ванне при температуре 30°С в течение 3-6 часов с двукратной сменой раствора, промывают проточной водой, обрабатывают 0,1 М раствором гидроксида натрия в течение 10 часов, обрабатывают раствором, содержащим 1 М соляной кислоты и 1 М хлорида натрия в течение 10 часов, обрабатывают раствором, содержащим 1 М хлорида натрия и 0,1 М фосфатного буфера в течение 10 часов, промывают 0,1 М раствором фосфатного буфера, трехкратно промывают дистиллированной водой, лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют радиационным способом. Использование способа позволяет получить коллагеновые имплантаты с высокой степенью биосовместимости, которые можно использовать для оперативного лечения сухожильно-связочного аппарата и повреждений других мягких тканей, в качестве барьерных мембран, как носитель клеток, лекарственных средств и биологически активных веществ.

Способ изготовления коллагеновых имплантатов, включающий механическую очистку, обработку раствором щелочи, обработку раствором кислоты, консервацию и стерилизацию, отличающийся тем, что в качестве исходного материала используют сухожилия, связки, фасции, твердую мозговую оболочку, перикард, хрящи человека и животных, заготовки обрабатывают смесью 1%-ного раствора Triton х-100 и 3%-ного раствора дезоксихолата натрия при температуре 30°С в течение 3-6 ч с двукратной сменой раствора, обрабатывают 0,1М раствором гидроксида натрия в течение 10 ч, обрабатывают раствором, содержащим 1М соляной кислоты и 1М хлорида натрия в течение 10 ч, обрабатывают раствором, содержащим 1М хлорида натрия и 0,1М фосфатного буфера в течение 10 ч, промывают 0,1М раствором фосфатного буфера, трехкратно промывают дистиллированной водой.