СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОТОПНОМЕЧЕНЫХ C ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ Российский патент 2009 года по МПК C12P7/64 C12N1/12 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению органических соединений, меченных стабильными изотопами. Получение таких соединений является одним из быстроразвивающихся направлений создания специализированных реагентов, применение которых в фундаментальных областях знаний и особенно в медицине, обеспечивает качественно новый уровень исследования.

Область применения таких соединений достаточно широка и включает как инструментальные методы физико-химического анализа органических веществ, так и новейшие диагностические методики в медицине и использование при изучении механизмов действия лекарственных средств.

Анализ источников информации по указанной тематике показал, что данное направление, как получение этих реагентов, так и их использование еще не в полной мере изучено и дальнейшая работа по теме может представлять определенный научный и коммерческий интерес.

Одним из исследуемых направлений применения в медицине стабильных изотопов, наряду с дыхательным тестом можно считать использование ¹³С-пальметиновой кислоты для измерения потока пальмитиновой кислоты в крови [Carnielli V.P., Luijendijk I.N.T., VanGoudoever J.В. at al. Structural position and amount of palmitic acid in infant formulas: Effect on fat, fatty acid, and mineral balance. // J. Pediatric Gastroenterology and mineral balance. 1996. V.23. №.5. P.553-560] [1], меченой галактозы - для наблюдения за углеводным метаболизмом в печени, ¹³С-линолевой и линоленовой кислот для исследования синтеза полиненасыщенных жирных кислот у младенцев [Carnielli V.P, Wattimena D.J.L] [2].

Применение для диагностики соединений, меченных стабильными изотопами ¹³С, ¹⁵N и ¹⁸O, по сравнению с радиоактивными аналогами, обусловлено отсутствием радиационной опасности, что особенно важно для обследования детей и младенцев, и возможностью определения локализации метки в молекуле исследуемого объекта с помощью методов: спектроскопии ядерного магнитного резонанса и масс-спектрометрии.

Потенциально неблагоприятные результаты в исследованиях с применением биомолекул с изотопными метками в структуре из-за кинетических и термодинамических изотопных эффектов обнаружены лишь в случае применения соединений с дейтерием. Значительные изменения констант ионизации O-D, N-D и активированных C-D связей по сравнению с аналогичными группами, содержащими протон, могут вызывать нарушения метаболизма. Дейтериевая метка также может быть потеряна в физиологической среде за счет обратного изотопного обмена атомов дейтерия на водород, легко протекающего по некоторым положениям биомолекул в водных растворах или при ферментативном расщеплении [Gregory R.В. and Rosenberg A. Protein conformation dinamics measured by hydrogen isotope exchange techniques. // Methods in Enzymol, 1986, V.131, P.448-508] [3].

В противоположность дейтерию применение стабильных изотопов ¹³С, ¹⁵N или ¹⁸O, имеющих относительно меньшую разность по массам от доминирующих ядер, не показывает каких-либо неблагоприятных результатов даже при высоком уровне обогащения соединений [Koletzko, Т.Sauerwald, Н.Demmelmair. Safety of stable isotope use. // Env. J. Pediatr. 1997. V.156 [Suppl 1] S.12-17] [4].

О важной биологической роли длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот свидетельствуют результаты исследования мышечных и нервных тканей, содержание докозагексаеновой кислоты в нервных тканях, составляет 20-25% от всех жирных кислот в сером веществе мозга человека и 50-60% во внешних сегментах сетчатки глаза [Gill and Valivety // Trends Biotechnol. - 1997. - 15: 401-409] [5]. Клинические и эпидемиологические исследования последних лет показали, что наличие в диете длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот n-3 серии, таких как докозагексаеновая и эйкозапентаеновая кислоты, являются важными составляющими при лечении сердечно-сосудистых, кожных, суставных заболеваний. Их недостаток, в соответствии с опубликованными данными, приводит к возникновению заболеваний, таких, как синдром Альцгеймера, а также может явиться причиной недоразвитости детей, особенно при внутриутробном развитии.

Известен способ получения триглицеридов, включающих смесь олеиновых, пальмитиновых и линолевых кислот, меченных стабильными изотопами, используемых в диагностической дыхательной пробе. Способ основан на управляемом культивировании микроорганизмов на средах, имеющих в своем составе источник стабильных изотопов ¹³С или ¹⁴С [Patent No 5,466,434 US. А61K 51/12 (20060101); С12Р 7/64 (20060101); С11В 1/00 (20060101); C12N 1/06 (2006 0101); Method of diagnosing fatty acid metabolism or absorption disorders using labeled triglyceride oils produced by cultivation of microorganisms. / Kyle; David J.; Martek Corporation. - No.: 08/338, 755, Filed: November 10, 1994] [6].

Способ предусматривает уровень обогащения целевого продукта от 6% до 65%, при использовании для культивирования ряда микроорганизмов как гетеротрофных, так и автотрофных, с предпочтением фотосинтезирующих морских водорослей рода Neochloris. Изобретение направлено преимущественно на обеспечение доступности проведения диагностических дыхательных проб, хотя стоимость получаемого продукта при указанном выше способе остается достаточно высокой. Стоимость конечного продукта определяется не только стоимостью применяемых для обогащения изотопсодержащих реагентов, но и расходами, связанными с культивированием морских микроорганизмов, требующих специальной среды и агрессивностью этой среды.

Известен способ получения меченых изотопом ¹³С полиненасыщенных жирных кислот, получаемых путем культивирования морских микроводорослей Phaeodactylum tricornutum в фотобиореакторе в среде, содержащей ¹³СО₂ при автоматическом контроле рН среды и кислорода с отбором получаемой биомассы и выделением из нее целевого продукта [Assessment of the production of ¹³C labeled compounds from phototrophic microalgae at laboratory scale. / Francisco G. Acien Fernander et.al. // Biomolecular Engineering. - 2003. - 20. - 149-162] [7].

Структура жирных кислот, полученных в лабораторных условиях в соответствии с методикой, изложенной в указанном источнике, отличается относительно низкой долей включения изотопа ¹³С в скелет молекулы - не более 35-50% с падением содержания в структуре изотопа ¹³С по мере увеличения длины цепи.

Для биологического мониторинга стабильно меченых соединений, как правило, необходимо, чтобы синтезируемые биомолекулы имели достаточные для их использования степени изотопного обогащения и были доступны по стоимости. Поэтому разработка наиболее рациональных путей биосинтетического получения подобных соединений, используемых в качестве реагентов, введение на рынок индивидуально полученных полиненасыщенных жирных кислот, обогащенных стабильными изотопами, в качестве стандартных образцов веществ является актуальной задачей.

Получение меченых стабильным изотопом ¹³С соединений из микроорганизмов, синтезируемых при управлении процессом изотопного обогащения, представляется наиболее перспективным.

Для использования стабильно меченых соединений необходимо, чтобы синтезируемые биомолекулы имели достаточно высокие степени изотопного обогащения. Проблема биосинтетического получения относительно недорогих, доступных, безопасных и эффективных соединений, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты с высокой степенью изотопного обогащения, еще далека от однозначного решения.

Техническим результатом изобретения является расширение ассортимента выпускаемых специализированных реагентов, снижение их стоимости, повышение уровня обогащения стабильным изотопом выделяемых полиненасыщенных жирных кислот.

Технический результат обеспечивают культивированием микроводоросли на среде, в которую включен изотоп ¹³С-содержащий компонент, с отбором биомассы, ее фильтрованием и выделением целевого продукта. В качестве микроводоросли используют пресноводную диатомовую водоросль Synedra Acus. Культивирование указанной микроводоросли осуществляют в монокультуре в фотобиореакторе. Посев культуры проводят, используя водоросли, отобранные из природного источника или используют биомассу, предварительно обогащенную изотопом ¹³С. Культивирование осуществляют в условиях, исключающих доступ посторонних источников углерода из внешней среды, в качестве источника изотопсодержащего компонента используют бикарбонат NaH¹³CO₃. Отбор биомассы проводят при достижении ею необходимого объема. Отфильтрованную биомассу гомогенизируют, экстрагируют общие липиды органическим растворителем и проводят гидролиз получаемого экстракта. Целевой продукт выделяют с применением методов хроматографии.

Биомассу диатомовых водорослей культивируют в фотобиоректоре, представляющем собой автономное мобильное устройство с возможностью подключения его к источнику пресной воды.

Культивирование водоросли в монокультуре проводят в водной среде следующего состава (мг/л): Ca(NO₃)₂·4H₂O - 20; KН₂РO₄ - 12.4; MgSO₄·7H₂O - 25; NaH13CO₃ - 16; Na₂·EDTA - 2.25; H₃BO₃ - 2.48; MnCl₂·4H₂O - 1.39; (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O - 1; витамин B12 - 0.04; тиамин гидрохлорид (витамин В1) - 0.04; биотин - 0.04; Na₂SiO₃·9H₂O - 28.4; FeCl₃ - 1.6, при температуре 12°С, и интенсивности освещения 250-300 µE·m^-2·s^-1.

При использовании для посева монокультуры водоросли, предварительно меченной изотопом ¹³С, степень ее обогащения изотопом составляет не менее 30-50%.

Для экстрагирования липидов в качестве органического растворителя используют смесь хлороформ-метанол при соотношении растворителей, равном 1:1, и соотношении биомассы к смеси растворителей, равном 1:20. После выдерживания смеси в течение 25-35 мин при комнатной температуре проводят фильтрование, подвергая полученный осадок повторному экстрагированию смесью растворителей или без него. При проведении повторного экстрагирования экстракты объединяют. К полученному экстракту добавляют воду в количестве 1/3 от объема растворителя, использованного для экстракции. После энергичного встряхивания смеси в течение 2-5 мин ее оставляют при 0°С на 10-12 часов для разделения фаз. Далее нижний слой экстракта отделяют и концентрируют, получая общие липиды.

Липиды, выделенные из биомассы, гидролизуют с использованием суспендирования в 1%-ного растворе MeONa в метаноле с выдерживанием смеси не менее 1 часа при 65°С в плотно закрытой емкости.

Продукты гидролиза очищают с применением препаративной тонкослойной хроматографии с выделением целевого продукта в виде фракции изотопномеченых ¹³С полиненасыщенных жирных кислот. Фракцию изотопномеченых ¹³С полиненасыщенных жирных кислот выделяют из продуктов гидролиза в виде метиловых эфиров, как наиболее устойчивой формы соединений.

Микроводоросли, как источник соединений, меченных стабильными изотопами, имеют ряд преимуществ из-за способности их фиксировать стабильные изотопы (¹³С, ¹⁵N) в биомассе в результате фотосинтеза. В настоящее время аутотрофное производство меченых биомолекул превалирует над гетеротрофным способом и в некоторых случаях, например, при производстве полиненасыщенных жирных кислот, является единственно возможным.

Выбор заявителями из известных диатомовых для культивирования пресноводной диатомеи Synedra acus представляется наиболее целесообразным. Указанные микроорганизмы являются автотрофами и растут на полностью неорганической среде, синтезируя все свои компоненты из продуктов фотосинтеза. Для осуществления заявляемого способа не требуются дорогостоящие органические соединения, имеющие изотопную метку в структуре ¹³С (глюкоза, ацетат, глицерин). Для культивирования сырья с целью получения целевого продукта нет необходимости в источниках натуральной или искусственной морской воды. Кроме того, культуру легко поддерживать в чистом состоянии - микробы не развиваются из-за отсутствия органического субстрата. Процесс культивирования можно контролировать, управлять им и при необходимости корректировать.

Впервые установлено, что культивирование пресноводной диатомеи S. acus на среде с ¹³С бикарбонатом в качестве источника углерода, не требует адаптации культуры к изотопсодержащей среде. При этом наблюдается ее нормальный рост и происходит включение изотопной метки в соединения, синтезируемые в процессе жизнедеятельности микроорганизма.

При культивировании биомассы Synedra acus на питательной среде с ¹³С бикарбонатом состав общих липидов изменяется незначительно, что подтверждает отсутствие изотопного эффекта.

При сравнении содержания состава полиненасыщенных жирных кислот, выделенных из морских диатомовых водорослей и пресноводной Synedra acus, обнаружено, что четвертая часть пула жирных кислот биомассы Synedra. acus представлена незаменимой эйкозапентаеновой кислотой (см. табл.). Важно, что данное соотношение сохраняется и в составе биомассы S. acus, обогащенной изотопом ¹³С.

Конкретное осуществление способа отражено в приводимых примерах.

Пример 1

В качестве исходного материала для культивирования была взята лабораторная культура диатомеи S. acus, полученная из материала, отобранного из фитопланктона озера Байкал.

Клетки этой бесшовной пеннатной диатомеи имеют длину 100-150 мкм и ширину около 3 мкм. Synedra acus широко распространена в пресных водах и в некоторые годы доминирует в пелагиали озера Байкал. Вид считается полупелагическим, поскольку он успешно размножается не только в озерах, но и в реках, в частности в главном притоке Байкала Селенге.

Культивирование клеток Synedra acus на среде с ¹³С бикарбонатом проводят в фотобиореакторе, включающем источник света и герметично закрытую емкость - ферментер, объемом 12 л. Ферментер снабжен устройством для барботирования, компрессором для удаления газа из надкультурального пространства, для очистки газа от кислорода и возврата его в ферментер для барботирования. Фотобиореактор содержит устройство для восполнения элементов питательной среды и ¹³СО₂, получаемого из ¹³С бикарбоната натрия, воздействуя на него капельно подаваемой в емкость с ¹³С бикарбонатом серной кислоты. Используют бикарбонат натрия NаН¹³СО₃ марки «Cambridge Isotope Laboratories, Inc.» с изотопной чистотой ¹³С не менее 99%. Фотобиореактор снабжен устройством создания необходимой для культивирования температуры в виде теплообменника и фильтром для очистки воды для культуральной жидкости.

Фотобиореактор является полностью автономным устройством и может быть установлен в любом помещении, имеющем источник пресной воды.

Оптимальными условиями для интенсивного роста биомассы водорослей является температура 12°С, освещение с интенсивностью 250-300 µЕ·m^-2·s^-1, и культуральная среда следующего состава (мг/л): Са(NО₃)₂·4Н₂O - 20; KН₂РO₄ - 12.4; MgSO₄·7H₂O - 25; NаH13СО₃ - 16; Na₂·EDTA - 2.25; Н₃ВО₃ - 2.48; MnCl₂·4H₂O - 1.39;

(NН₄)₆Мо₇O₂₄·4Н₂O - 1; витамин В12 - 0.04; тиамин гидрохлорид (витамин В1) - 0.04; биотин - 0.04; Nа₂SiO₃·9Н₂O - 28.4; FеСl₃ - 1.6. В процессе роста биомассы обеспечивают постоянный состав культуральной среды, восполняя расходуемые элементы.

На Фиг.1 показан уровень обогащения жирных кислот изотопом ¹³С в зависимости от числа двойных связей в цепи.

Производительность биомассы при описанных выше условиях составляет 0,4-0,5 г/сутки. При заполнении емкости ферментера достаточным объемом биомассы водоросли, ее отбирают и фильтруют. Достаточность заполнения емкости ферментера определяют визуально, как правило, при этом плотность культуры составляет около 1,5•10⁵ кл/мл. При большей плотности скорость нарастания массы снижается.

Для выделения липидов, включающих фракцию полиненасыщенных жирных кислот, обогащенную изотопом ¹³С биомассу гомогенизируют, экстрагируют смесью хлороформ-метанол при их соотношении, равном 2:1. Соотношение биомассы к смеси растворителей берут равным 1:20 (масса:объем). Смесь выдерживают 30 мин при температуре 18-23°С, затем фильтруют через бумажный фильтр. Отфильтрованный осадок дополнительно экстрагируют смесью хлороформ-метанол с добавлением хлороформа в соотношении 5:2. Полученные экстракты объединяют, прибавляют воду в количестве не более 1/3 от объема растворителей, использованных для экстракции. После энергичного встряхивания в течение 3-5 мин смесь оставляют на 10-12 часов при 0°С для разделения фаз. Далее нижний слой экстракта отделяют и концентрируют, получая общие липиды.

Общие липиды, выделенные из биомассы, суспендируют в 1%-ном растворе MeONa в метаноле. Смесь выдерживают 1 час при 65°С в плотно закрытой емкости, затем охлаждают и нейтрализуют, добавляя 5%-ный раствор HCl.

Полученные продукты гидролиза экстрагируют п-гексаном. После упаривания гексана концентрат очищают с применением препаративной тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с силикагелем. Пластинку проявляют в бензоле, высушивают на воздухе, определяют зону, соответствующую жирным кислотам по хроматографической подвижности, снимают с пластинки и элюируют хлороформом. Затем элюат концентрируют, выделяя полиненасыщенные жирные кислоты, меченные изотопом ¹³С.

Степень обогащения полиненасыщенных жирных кислот изотопом ¹³С определяли по содержанию его в пальмитолеиновой кислоте. Для этого к продуктам гидролиза общих липидов добавляют 5% раствор НСl в метаноле и нагревают в течение 30 мин при 60°С. Смесь охлаждают, метиловые эфиры экстрагируют п-гексаном. Экстракт концентрируют и очищают препаративной ТСХ на пластинках с силикагелем.

Анализ метиловых эфиров жирных кислот проводят методом хроматомасс-спектрометрии на хроматомасс-спектрометре "Agilent, GC 6890, MSD 5973" с капиллярной колонкой DB-5MS (0,25 мм × 30 м, 25 мкм). Образцы жирных кислот разделяют при температурном градиенте колонки от 160 до 300°С со скоростью нагрева 2°С/мин с последующим выдерживании температуры при 300°С в течение 20 мин; температуре инжектора 290°С, квадруполя 150°С. Объем вводимого в колонку образца равен 0,002 мл. Детектирование проводят в режиме полного сканирования масс-спектров в диапазоне от 50 до 500 а.е.м., скорости сканирования 0.1 с и энергии ионизации 70 eV.

Оценка степени обогащения изотопом ¹³С пальмитолеиновой кислоты С16 (1) составляет 28%.

Пример 2

Культивирование биомассы пресноводной диатомовой водоросли Synedra Acus проводят в автономном фотобиореакторе, исключенном к источнику пресной воды, аналогичном описанному в примере 1.

При посеве культуры используют биомассу, выращенную в автономном переносном микробиореакторе емкостью 1 л. Инокулят подращивают при комнатной температуре в условиях периодического перемешивания при естественной смене дня и ночи. Использованные реактивы имели чистоту «ч.д.а.» Для посева в основной фотобиореактор культуру отбирают со степенью обогащения ее изотопом ¹³С не менее 30-50%.

Дальнейший процесс культивирования, контроля процесса, отбора биомассы и выделение целевого продукта осуществляют в соответствии с описанием в примере 1. Отличием является отсутствие операции дополнительного экстрагирования отфильтрованного осадка при выделении общих липидов.

Анализ метиловых эфиров жирных кислот проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе «Милихром А-02» с колонкой 2×70 мм, упакованной сорбентом «Silasorb SPH, 5 мкм» и эффективностью 3500 т.т по пику хризена (k′=6.5) при следующих условиях: подвижная фаза - ацетонитрил:вода в соотношении 1:1. УФ-детектирование при 200 и 210 нм, одновременно; температура колонки 35°С.

При разделении пробы отбирают 4 фракции в интервале времен удерживания (t_R) от 5,5 до 6,5 мин - 1 фракция; от 8,2 до 9,0 мин - 2 фракция; от 10,5 до 12 мин - 3 фракция; от 12,5 до 14,0 мин - 4 фракция.

На Фиг.2 показана хроматограмма препаративного разделения смеси метиловых эфиров. Позиция 2 - фракция, содержащая метиловый эфир эйкозапентаеновой кислоты.

Степень обогащения изотопом ¹³С пальмитолеиновой кислоты С16 (1) составляет 60%, стеариновой кислоты С18 (0) - 18%, линоленовой кислоты С18 (3) - 75%, эйкозапентаеновой кислоты С20 (5) - 64%.

Предлагаемый способ получения высокоценных органических соединений с углеродным скелетом из изотопов углерода ¹³С использует уникальную способность клеток диатомовых водорослей фотосинтезировать широкий спектр сложных органических веществ и, что особенно важно, полиненасыщенных жирных кислот из относительно недорогих простых неорганических соединений. Культивирование диатомей на средах с полной заменой в субстратах атомов углерода на его изотоп ¹³С позволяет получить органические соединения с углеродным скелетом только из изотопа углерода ¹³С, не представленные в ассортименте известных фирм ["Silantes", www.silantes.com] [8].

Наработку культуры S. acus предпочтительнее проводить в реакторах малого объема для получения мелких партий биомассы, так как в таких случаях технология получения уникальных биомолекул наиболее оправдана, учитывая, что целевой продукт не требуется в больших объемах.

При достаточно высокой цене на биомолекулы, меченые изотопом ¹³С (цена 1 г ¹³С-линолевой кислоты достигает 4400 долларов США [9]) производство ¹³С-биомассы по заявляемому способу становится окупаемым при цене 800 руб. за 1 г получаемого целевого продукта.

Изложенная технология не только обеспечивает указанный технический результат, но является составной частью общей технологии комплексной переработки биомассы культивируемых пресноводных диатомовых водорослей, включающей использование кремнезема створок после удаления органического содержимого компонентов клеток диатомей [Заявка №2005136175/03 (040402) RU, МПК C03B 8/02 (2006.01) Способ получения кварцевого стекла. / М.А.Грачев и др.; Лимнологический институт СО РАН. - Заявл. 21.11.2005].

Источники информации

1. Carnielli V.P., Luijendijk I.NT., VanGoudoever J.B. at al. Structural position and amount of palmitic acid in infant formulas: Effect on fat, fatty acid, and mineral balance. // J. Pediatric Gastroenterology and mineral balance. 1996. V.23. №.5. P.553-560.

2. Carnielli V.P., Wattimena D.J.L.

3. Gregory R.B and Rosenberg A. Protein conformation dinamics measured by hydrogen isotope exchange techniques. // Methods in Enzymol, 1986, V.131, P.448-508.

4. Koletzko, T. Sauerwald, H. Demmelmair. Safety of stable isotope use. // Env. J. Pediatr. 1997. V.156 [Suppl 1] S.12-17]

5. Gill and Valivety // Trends Biotechnol. - 1997. - 15: 401-409.

6. Patent No 5,466,434 US. A61K 51/12 (20060101); C12P 7/64 (20060101); C11B 1/00 (20060101); C12N 1/06 (20060101); Method of diagnosing fatty acid metabolism or absorption disorders using labeled triglyceride oils produced by cultivation of microorganisms. / Kyle; David J.; Martek Corporation. - No.: 08/338, 755, Filed: November 10, 1994.

7. Assessment of the production of ¹³C labeled compounds from phototrophic microalgae at laboratory scale. / Francisco G. Acien Fernander et. al. // Biomolecular Engineering. - 2003. - 20. - 149-162.

8. www.silantes.com

9. Acien Fernandes F.G., Fernandes Sevilla J.M., Egorova-Zachernyuk T.A., Molina Grima E. Cost-effective production of ¹³C, ¹⁵N stable isotope-labelled biomas from phototrophic microalgae for various biotechnological applications. // Biomol. Eng. 2005. V.22. P.193-200.

Содержание эйкозапентаеновой (ЭПК) и докозагексаеновой (ДГК) кислот в морских диатомеях и культивируемой S. acus (% от суммы жирных кислот) ПНЖ K Виды диатомовых микроводорослей морские (данные источников информации) пресноводные Chaetoceros muelleri [1*] Skeletonema costatum [1*] Phaeodactylum sp. [1*] Phaeodactylum tricornutum [1*] Thaslassiosira pseudonana [2**] Synedra acus ЭПК 0,7 12 13 12 13 27 ДГК 0,1 2,3 - 1,0 3.4 2,9 1. *Treguer Р, Nelson D.M, et. al. // Science 1995. - V.268. P.375-379. 2. **Viso A.C., Мarty J.C. // Phytochemistry. - 993. - V.34. - P.1521-1533.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ включает культивирование пресноводных диатомовых водорослей Synedra Acus в фотобиореакторе на среде, содержащей изотоп ¹³С-содержащий компонент. Для посева культуры используют водоросли, отобранные из природного источника, или используют биомассу, предварительно обогащенную изотопом ¹³С. Культивирование осуществляют в условиях, исключающих доступ посторонних источников углерода из внешней среды. В качестве изотопсодержащего реагента используют бикарбонат NaH¹³СО₃. Далее проводят отбор биомассы, ее фильтрование, гомогенизирование и экстрагирование общих липидов органическим растворителем. Осуществляют гидролиз общих липидов и последующую очистку целевого продукта хроматографией. Способ позволяет повысить уровень обогащения стабильным изотопом получаемых полиненасыщенных жирных кислот. Степень обогащения изотопом ¹³С пальмитолеиновой кислоты составляет 60%, стеариновой кислоты - 18%, линоленовой кислоты - 75%, эйкозапентаеновой кислоты - 64%. 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ получения изотопномеченых ¹³С полиненасыщенных жирных кислот, включающий культивирование микроводоросли на среде, в которую включен изотоп ¹³С-содержащий компонент, отбор биомассы, ее фильтрование и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют пресноводную диатомовую водоросль Synedra Acus, культивируемую в монокультуре в фотобиореакторе, посев культуры проводят, используя водоросли, отобранные из природного источника, или используют биомассу, предварительно обогащенную изотопом ¹³С, культивирование осуществляют в условиях, исключающих доступ посторонних источников углерода из внешней среды, в качестве изотопсодержащего компонента используют бикарбонат NaH¹³CO₃, при достижении биомассой необходимого объема проводят отбор биомассы, после фильтрования ее гомогенизируют и проводят экстрагирование общих липидов органическим растворителем, затем осуществляют гидролиз общих липидов и выделяют целевой продукт с применением хроматографии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование водоросли проводят в фотобиореакторе, представляющем собой автономное мобильное устройство, с возможностью подключения к источнику пресной воды.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование водоросли в монокультуре проводят в водной среде следующего состава, мг/л: Са(NO₃)₂·4Н₂O 20; KН₂РO₄ 12,4; MgSO₄·7H₂O 25; NаН¹³СО₃ 16; Na₂·EDTA 2,25; Н₃ВО₃ 2,48; MnCl₂·4H₂O 1,39; (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1; витамин B₁₂ 0,04; тиамин гидрохлорид (витамин B₁) 0,04; биотин 0,04; Nа₂SiO₃·9Н₂О 28,4; FеСl₃ 1,6, при температуре 12°С и интенсивности освещения 250-300 µE·m^-2·s^-1.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при использовании для посева монокультуры водоросли, предварительно меченной изотопом ¹³С, степень ее обогащения изотопом составляет не менее 30-50%.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют смесь хлороформ-метанол при соотношении растворителей, равном 2:1, и соотношении биомасса-смесь растворителей, равном 1:20, после выдерживания смеси в течение 30 мин при комнатной температуре проводят фильтрование, подвергая полученный осадок повторному экстрагированию смесью растворителей, или без него, при проведении повторного экстрагирования экстракты объединяют, добавляя воду в количестве 1/3 от объема растворителя, использованного для экстракции, после энергичного встряхивания смеси в течение 3-5 мин ее оставляют при 0°С на 10-12 ч для разделения фаз, далее нижний слой экстракта отделяют и концентрируют, получая общие липиды.

6. Способ по любому из пп.1 или 5, отличающийся тем, что гидролиз общих липидов проводят, суспендируя их в 1%-ном растворе MeONa в метаноле с выдерживанием смеси не менее 1 ч при 65°С в плотно закрытой емкости, фракцию изотопномеченых ¹³С полиненасыщенных жирных кислот выделяют из продукта гидролиза методом тонкослойной хроматографии.