Способ синтеза линолевой и линоленовой кислот, меченных изотопами углерода С и С Российский патент 2017 года по МПК C07C57/12 C07C51/10 C07C51/14 C07B59/00 A61K49/00 A61K51/00 

Изобретение относится к области органической химии и касается способа синтеза линолевой и линоленовой кислоты, меченной изотопами углерода ¹³С и ¹⁴С в положении 1, которая может быть использована в качестве средства для выполнения дыхательных тестов, в частности, в интересах диагностики функциональной активности органов пищеварения и гепатобиллиарной системы.

Анализ информации, касающейся способов применения изотопно-меченных соединений при проведении дыхательных тестов, по данным обзорной работы [PizzoferratoMetal, Eur.Rew.MedPharmac.Sci, 2013] показывает быстрый рост числа заболеваний, для которых разрешен и практически применяется дыхательный тест с применением изотопов углерода. С 1996 г, когда FoodandDrugAdministration США был разрешен для клинического применения уреазный дыхательный тест с ¹³С мочевиной, предназначенный для выявления возбудителя язвенной болезни желудка Helicobacterpylori, в практику были внедрены дыхательные тесты с применением целого ряда ¹³С-меченных соединений: формиатов, фенилаланина, тирозина, метацетина, аминопирина, эритромицина, метионина, фенацетина, кофеина, триглицеридов жирных кислот, крахмала, бикарбоната, лейцина, ацетатов, глюкозы, каприловой кислоты, лактозы, ксилозы, гликолевой кислоты (http://rostchim.ru/?page=products). Они зарекомендовали себя как экономически доступный, легко переносимый пациентами, точный и безопасный метод выявления инфекционных и метаболических расстройств, нейродегенаративных и других заболеваний.

Дыхательные тесты с применением изотопно-меченных свободных жирных кислот в клинической практике пока не применяются, что отчасти обусловлено отсутствием доступных и надежных источников изотопно-меченных жирных кислот. В работе [Carnielli V.P., Luijendijk I.N.Т., VanGoudoever J.В. еt al. Structural position and amount of palmitic acid in infant formulas: Effect on fat, fatty acid, and mineral balance. // J. Pediatric Gastroenterology and mineral balance. 1996. V. 23. №.5. P. 553-560] сообщается, что одним из исследуемых направлений применения в медицине стабильных изотопов, наряду с дыхательным тестом можно считать использование ¹³С-пальмитиновой кислоты для измерения потока пальмитиновой кислоты в крови, меченой галактозы - для наблюдения за углеводным метаболизмом в печени, ¹³С-линолевой и линоленовой кислот для исследования синтеза полиненасыщенных жирных кислот у младенцев.

Анализируя известные способы синтеза изотопно-меченных жирных кислот, необходимо отметить тенденцию к преобладанию биологических способов, основанных на культивировании водорослей или грибов в присутствии ¹³С-меченного углекислого газа и других низкомолекулярных углеродистых соединений. Известные из уровня техники химические способы синтеза направлены на получение изотопно-меченных производных жирных кислот (преимущественно эфиров), а не свободных жирных кислот.

Прототипом изобретения является патент Верещагина А.Л. и соавт. «Способ получения изотопно-меченных ¹³С полиненасыщенных жирных кислот» (опубл. 20.07.2009), описывающий способ культивирования пресноводных диатомовых водорослей Synedraacus в фотобиореакторе на среде, содержащей неорганический ¹³С-содержащий компонент. Известен также патент США Kyle D.J., опубликованный в 1994, №5466434 US, A61K 51/12 (20060101); С12Р 7/64 (20060101); С11В 1/00 (20060101); C12N 1/06 (20060101) «Метод диагностики метаболизма жирных кислот и нарушений кишечного всасывания и использованием меченных триглицеридов жирных кислот получаемых при культивировании микроорганизмов». В патенте описан способ получения триглицеридов, включающих смесь олеиновой, пальмитиновой и линолевой кислот, меченных стабильными изотопами. Описан способ применения изотопномеченного препарата в диагностической дыхательной пробе. Способ синтеза основан на культивировании микроорганизмов на средах, имеющих в своем составе источник изотопов ¹³С или ¹⁴С.

В публикации авторов из США [Doll и Erhan, 2005, J. Agric. Food Chem.] «Синтез карбонилированных метиловых эфиров жирных кислот с применением сверхкритических флюидов углекислого газа» описана двухстадийная схема синтеза циклических карбонатов, карбонилированного метилового эфира олеиновой кислоты и карбонилированного метилового эфира линолевой кислоты. На первой стадии в реакции метилового эфира ненасыщенной жирной кислоты с Н₂О₂ и муравьиной кислотой получают соответствующий эпоксид. Затем проводят реакцию карбонилирования с использованием бромида тетрабутиламмония в качестве катализатора, что позволяет включить свободный СО₂ в гидрофобную органическую молекулу. Этот метод позволяет избегать использования такого токсичного соединения, как фосген. Этот же принцип может быть использован для синтеза циклических карбонатов из коммерчески доступных 2-этилгексилэпоксидов соевого масла. Описанные в работе циклические карбонаты могут использоваться в качестве альтернативного сырья для нефтехимической промышленности.

В работе Kawashima et al., 2005, Anal Biochem. «Получение ¹³С-меченных полиненасыщенных жирных кислот с помощью гриба Mortierellaalpina 1S-4 - продуцента арахидоновой кислоты» сообщается о способе получения полиненасыщенных жирных кислот, меченных ¹³C с использованием в качестве источника изотопа ¹³С глюкозы или метиловых эфиров жирных кислот. При этом удалось получить жирные кислоты: арахидоновую (20:4 омега-6), дигомо-γ-линолевую (20:3 омега-6), γ-линолевую (18:3 омега-6) и линолевую (18:2 омега-6), в которых число атомов ¹³С колебалось от нуля до шести на молекулу.

В случае арахидоновой кислоты 20:4 омега-6 включение атома ¹³С происходило преимущественно в положение С-3, С-5 и С-7 при культивировании мицелия на [¹³С]-метиловом эфире стеариновой, [¹³С]-метиловом эфире пальмитиновой и [¹³С]-метиловом эфире миристиновой кислот, соответственно.

В работе [Georgin, Taras, Mioskowski, 2003, Chem. Phys. Lipids] «Дивергентный синтез 1-[¹⁴С]-моно-Е изомеров жирных кислот» описан способ синтез 1-[¹⁴С]-моно-транс изомеров жирных кислот путем инверсии олефинов. Описана 11-ступенчатая схема получения меченных по атому 1 моно-транс изомеров олеиновой, линолевой и линоленовой кислот из коммерчески доступных цис-изомеров. Вначале с помощью декарбоксилирования по Бертону получали бромированное производное. Эпоксидирование этого соединения привело к образованию трех моноэпоксидов, которые разделяли с помощью HPLC. Моноэпоксид нужной структуры, идентифицированный методом ЯМР-спектроскопии, подвергали инверсии методом стереоспецифического деоксигенирования с последующей β-элиминацией. На заключительной стадии атом брома замещали на углерод с помощью присоединения [¹⁴С]-цианидной группы с ее последующим гидролизом.

Анализ уровня техники показывает, таким образом, что способы химического синтеза ¹⁴С и ¹³С-меченных производных наиболее распространенных в пищевых продуктах ненасыщенных жирных кислот: линолевой и линоленовой из наиболее доступного сырья - ¹⁴СО₂ и ¹³CO₂ в патентной и иной литературе не описаны. Биологические способы с применением водорослей и грибов имеют низкий радиохимический выход, не превышающий 60%. Остальная часть изотопа выбрасывается в виде отходов, что с учетом большой длительности распада ¹⁴С приводит к высокой экологической опасности схемы синтеза. Кроме того, недостатками известного из уровня техники биологического способа с точки зрения применимости ¹⁴С и ¹³С-меченных жирных кислот в дыхательных тестах является распределение меченых атомов по всей длине углеродной цепи ацила. Между тем, для достижения высокой чувствительности, воспроизводимости и безопасности дыхательных тестов оптимальным является использование препаратов жирных кислот, имеющих 100% меченного атома в позиции 1 (альфа).

Таким образом, разработка способа химического синтеза линолевой и линоленовой кислот, меченных ¹⁴С и ¹³С по положению 1 ацила (альфа), с использованием СО₂ в качестве источника аномального изотопа является важной практической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение.

Предлагаемый способ синтеза линолевой и линоленовой кислот, меченных ¹⁴С и ¹³С по положению 1 ацила, включает следующие стадии:

а - получение реактива Гриньяра реакцией металлического магния с 1-бром-8,11-гептадекандиеном (в случае линолевой кислоты) или с 1-бром-8,11,14-гептадекантриеном (в случае линоленовой кислоты) в присутствии металлического йода;

b - карбоксилирование реактива Гриньяра углекислым газом, меченным ¹⁴С или ¹³С (СО₂ получают разложением серной кислотой карбоната бария, меченного ¹⁴С и ¹³С).

Технический результат изобретения состоит в ускорении процесса получения целевых продуктов, сокращении потерь углекислого газа, меченного ¹⁴С или ¹³С, в повышении его суммарного химического и радиационного выхода по сравнению с прототипом, а также исключению распределения изотопно-меченных атомов по всей длине углеродной цепи ацила: включение происходит только в положении 1.

Упрощение и удешевление процесса получения целевого продуктов линолевой (октадекадиен-9,12-овой-1) и линоленовой (октадекатриен-9,12,15-овой-1) кислот обеспечено уменьшением длительности, повышением радиационного и химического выхода продукта по источнику изотопа по сравнению с прототипом. В результате использования изобретения практически полностью исключается выброс радиоактивных отходов во внешнюю среду, так как включение его в целевой продукт приближается к количественному.

Предлагаемая последовательность реакций в сочетании с выбранными условиями их осуществления, обеспечивающие в совокупности достижение технического результата - получение целевого продукта с максимальным выходом и минимальными затратами труда, времени и средств, из уровня-техники не известны.

На Фиг. 1 показаны структурные формулы целевых продуктов: линолевой и линоленовой кислот.

Использованные реагенты и выходы продуктов на каждой стадии приведены в Примере 1.

На Фиг. 2 показана схема установки для получения реактива Гриньяра в атмосфере аргона в реакции металлического магния с 1-бром-8,11-гептадекандиеном (в случае линолевой кислоты) или с 1-бром-8,11,14-гептадекантриеном (в случае линоленовой кислоты) в присутствии металлического йода.

На Фиг. 3 показана схема установки для карбоксилирования реактива Гриньяра углекислым газом, меченным 14С или 13С (получают разложением серной кислотой карбоната бария, меченного 14С и 13С). 1 - источник CO₂, 2 - трубка с осушителем, 3 - высоковакуумная гребенка (диаметр трубки 13 мм), 4 - ртутный манометр, 5 - колба, 6 - магнитная мешалка, 7 - ледяная баня, 8 - вход азота (из баллона через редуктор), 9 - шлиф 28/12, 10 - кран с отверстием диаметром 3 мм, 11 - кран с отверстием 2 мм, 12 - шлиф 18/9, шлиф 14/35, шлиф 14/20.

На Фиг. 4 приведен спектр ¹Н-ЯМР линолевой кислоты, синтезированной согласно описанию в Примере 1.

Молекулярные массы продуктов, содержащих нормальный изотоп ¹⁴С: линолевая - 280,4455 г/моль, линоленовая - 278,4296 г/моль.

Синтез и мечение линолевой и линоленовой кислот изотопами углерода ¹³С и ¹⁴С проводят в 2 стадии: получение реактива Гриньяра, карбоксилироваиие реактива Гриньяра ¹³CO₂ или ¹⁴CO₂. Общий химический выход колеблется в пределах от 86 до 97%, радиохимическая чистота продуктов (без дополнительной очистки) от 88 до 92%.

Пригодность синтезируемых продуктов для выполнения дыхательных тестов подтверждают исследованием общей токсичности на мышах линии BALB/C с массой тела 18-20 г и на белых крысах линии Wistar массой 180-210 путем внутрижелудочного введения основного вещества: линолевой и линоленовой кислот согласно рекомендациям [Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, М.: Издательство Медицина, 2005]. Перед внутрижелудочным зондовым введением препарата животным его разводят в оливковом масле пищевого качества. Все процедуры приготовления препарата выполняют при комнатной температуре в асептических условиях.

Условия оценки острой токсичности ¹³С-линолевой и ¹³С-линоленовой кислот при однократном введении. Изучение острой токсичности линолевой и линоленовой кислот выполняют в соответствии с «Методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ». Исследование проводят на 95 мышах линии BALB/C (самцы и самки, масса тела 18-20 г) и 45 крысах линии Вистар (самцы и самки, масса тела 180-210 г).

Продукты синтеза: ¹³С-линолевую, ¹³С-линоленовую, ¹⁴С-линолевую и ¹⁴С-линоленовую кислоты растворяют в оливковом масле и вводят однократно в виде свежеприготовленных растворов в желудок в диапазоне доз для крыс 100, 200 и 500 мг (5 мл масла на животное), для мышей 10, 20 50 мг (0,5 мл масла) на животное. Длительность наблюдения за животными с начала эксперимента составляет 14 дней.

Исследование параметров токсичности линолевой и линоленовой кислот при однократном внутрижелудочном способе введения мышам BALB/c и крысам Wistar проводят с использованием двухэтапного метода, на первом этапе которого на ограниченном количестве животных методом Дейхмана и Лебланка определяют ориентировочные значения ЛД₅₀ [Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, М.: Издательство Медицина, 2005].

Условия оценки субхронической токсичности ¹³С-линолевой и ¹³С-линоленовой кислот. Изучение субхронической токсичности ¹³С-линолевой и ¹³С-линоленовой кислот выполняют в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, Хабриев Р.У., М.: Издательство Медицина, 2005.

Тест выполняют на 150 крысах линии Вистар с массой тела 180-200 г. Животных делят на группы по 30 животных в каждой (15 самцов и 15 самок): I группа - контроль, II группа - ¹³С-линолевая кислота 5 мг/кг (5-кратная диагностическая доза для человека), III группа - ¹³С-линолевая кислота 25 мг/кг (25-кратная диагностическая доза для человека), IV группа - ¹³С-линоленовая кислота 5 мг/кг (5-кратная диагностическая доза для человека), V группа - ¹³С-линоленовая кислота 25 мг/кг (25-кратная диагностическая доза для человека). Изучаемые соединения в виде свежеприготовленных растворов в указанных дозах вводят ежедневно с помощью зонда внутрижелудочно в течение 2-х недель.

Животных содержат в клетках типа Т-3, в условиях, соответствующих действующим Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник.

Животные должны получать в неограниченном количестве водопроводную питьевую воду, подаваемую с помощью поилок (500-мл стеклянные бутыли с конической пробкой из нержавеющей стали с отверстием в центре).

Кормление проводят в фиксированное время, только специализированными брикетированными кормами, сбалансированными по аминокислотному составу, минеральным веществам и витаминам.

В течение всего эксперимента фиксируют общее состояние и поведение животных (двигательная активность, динамка массы тела, аппетит и состояние шерстяного покрова).

Забор крови у крыс производят из хвостовой вены в объеме 2,0-2,5 мл перед началом субхронического эксперимента и по окончании 2-х недельного наблюдения. Форменные элементы крови подсчитывают с помощью автоматического счетчика крови «Picoscale» (Венгрия).

Биохимические показатели (глюкоза, общий белок, креатинин, мочевина, три-ацилглицериды, холестерин и общий билирубин) и активность ферментов (лактат-дегидрогеназа, щелочная фосфатаза, аланинаминотрансфераза и аспартатамино-трансфераза) определяют с помощью биохимического полуавтоматического анализатора FP-901 "Labsystems" (Финляндия).

По окончании субхронического эксперимента проводят забой крыс для патоморфологического исследования внутренних органов и тканей животных.

Животных вскрывают сразу же после забоя, чтобы исключить возможное разрушение тканей и клеток внутриклеточными ферментами. На каждое животное составляют полный патологоанатомический протокол вскрытия.

Образцы органов и тканей фиксируют в 10% нейтрализованном растворе формалина, после чего проводили обезвоживание, обезжиривание и проводку тканей с их заливкой вручную в парафин с воском. Получение гистологических срезов выполняли с помощью санного микротома, что позволяет получить серийные срезы. После депарафинирования срезы окрашивают гематоксилин-эозином, заключают в бальзам под покровные стекла, и полученные таким образом гистологические препараты микроскопируют.

Конечные данные по патоморфологии, полученные от крыс, получавших ¹³C-линолевую и ¹³С-линоленовую кислоты, сравнивали с исходными данными, взятыми в контрольной группе.

Возможность практического реализации изобретения проиллюстрирована ниже конкретным примером его осуществления.

Пример 1. Получение линолевой кислоты меченой углеродом-14 в положении 1 (альфа)

a) Получение реактива Гриньяра

Собирают установку из трехгорлой колбы на 250 мл, в боковые горловины колбы вставляют хорошо действующий обратный холодильник с хлоркальциевой трубкой и капельную воронку с трубкой уравнивающей давление во время прикапывания эфирного раствора. В центральное отверстие через масляный затвор вводят мешалку с электрическим приводом. В колбу помещают 1,5 г магниевой стружки и кристаллик йода. Всю установку продувают током аргона марки осч в течение 20 минут. Через капельную воронку в колбу вводят 80 мл абсолютного эфира, включают мешалку и при слабом токе аргона прибавляют 6 ммоль1-бром-8,11-гептадекандиена в виде раствора в диэтиловом эфире объемом 80 мл. Для начала реакции колбу нагревают на водяной бане до кипения эфира. После начала реакции водяную баню выключают и процесс перемешивания продолжают до полного растворения магния.

b) Карбоксилирование реактива Гриньяра двуокисью углерода-¹⁴С

Установка для получения меченых кислот карбоксилированием реактивов Гриньяра изображена на Фиг. 2. Она представляет собой высоковакуумную гребенку, снабженную шлифами для присоединения реакционной колбы, источника CO₂ и ртутного манометра, а также трубками для входа и выхода азота. Коническая трехгорлая реакционная колба изготовлена с таким расчетом, чтобы ее можно было охлаждать жидким азотом, и снабжена магнитной мешалкой, позволяющей работать в вакууме при охлаждении. Источник ¹⁴CO₂ представляет собой круглодонную колбу, содержащую карбонат бария (¹⁴С). Он соединен с заполненной концентрированной серной кислотой капельной воронкой, снабженной приспособлением для выравнивания давления. Эта часть установки связана с вакуумной гребенкой через трубку, наполненную осушителем.

Для проведения реакции установку откачивают до давления 10^-4 мм и заполняют ее сухим азотом. Затем при помощи предварительно промытой и заполненной азотом пипетки с поршневой подачей быстро вводят в реакционную колбу раствор реактива Гриньяра в молярном избытке в 10%. Свободный боковой отвод реакционной колбы закрывают пробкой, колбу охлаждают жидким азотом и откачивают систему до давления 10^-4 мм. После этого дают содержимому реакционной колбы оттаять, нагревая его смесью сухого льда к и ацетона до -20°С, снова замораживают жидким азотом. Повторно откачивают систему для удаления выделившегося азота.

Карбоксилирование реактива Гриньяра проводят при температуре -20°С при постоянном перемешивании содержимого колбы. Для получения ¹⁴CO₂ к карбонату бария (¹⁴С) из капельной воронки медленно прибавляют концентрированную серную кислоту, следя за тем, чтобы давление в приборе не превышало 500 мм рт.ст. Для полного выделения ¹⁴CO₂ в конце реакции осторожно нагревают реакционную колбу с карбонатом бария до окончательного его растворения. После полного насыщения раствора реактива Гриньяра ¹⁴CO₂ давление в приборе больше не меняется. Обычно реакция завершается в течение 5-15 мин. Затем реакционную колбу охлаждают жидким азотом для того, чтобы в нее перешел весь оставшийся в системе ¹⁴CO₂, закрывают кран, соединяющий прибор с источником ¹⁴CO₂, и для полного поглощения ¹⁴CO₂ реакционную массу перемешивают в течение 15 мин при температуре -20°С. После этого установку заполняют азотом из баллона и соединяют с атмосферой. Полученный комплекс разлагают разбавленной соляной кислотой. Подкисленную смесь экстрагируют эфиром. Эфирный экстракт обрабатывают 100 мМ NaOH и подкисляют полученный щелочной раствор до pH 7,0. Выделившуюся кислоту отфильтровывают. Выделившийся осадок собирают, промывают водой и перекристаллизовывают из ацетонитрила при -20°С. Выход 1-¹⁴С-линолевой кислоты составляет 6,80 г (температура замерзания -11°С). Дополнительное количество кристаллов вещества (3,30 г) выделяют с помощью 3,00 г носителя, доводя общий радиохимический выход до величины, превышающий 96%. После объединения полученных кристаллов препарат замерзает при -10,7°С. Химический выход составляет 96%, радиохимический выход 88%. Удельную активность определяют на сцинтилляционном спектрометре: она должна составлять 1±0,02 мКи/г.

Анализ полученного препарата с помощью высокоэффективной хроматографии позволяет фиксировать примеси кетона и спирта, которые в сумме не должны превышать 2% сухой массы готового продукта.

ЯМР спектр по ¹Н и ¹³С показывает полное соответствие структуры синтезированного вещества линолевой кислоте (Фиг. 4).

Пример 2. Исследование острой токсичности ¹³C-линолевой и ¹³C-линоленовой, кислот при однократном введении

При введении препаратов в желудок в максимально вводимых дозах для мышей - 2,77 мг/кг, для крыс - 2,38 мг/кг, картины интоксикации указанных видов лабораторных животных, а также симптомов раздражения желудочно-кишечного тракта не наблюдалось. Гибели мышей и крыс не отмечено. Не установлено видовых и половых различий в чувствительности животных к токсическому действию изученных соединений.

Таким образом, при введении в желудок двум видам мелких лабораторных животных ¹³C-линолевой и ¹³C-линоленовой кислот в дозах, превышающих диагностическую в 2500 раз, на протяжении 3-х суток наблюдения не было обнаружено явлений интоксикации и гибели животных. В спецификации на ¹³С-линолевую кислоту фирмы ScienceLab (USA, Houston, Texas) указана ЛД₅₀ равная 3,2 г/кг, что не позволяет корректно сопоставить токсичность коммерческого препарата и препарата, изготовленного согласно настоящему изобретению.

Исследование субхронической токсичности ¹³С-линолевой и ¹³С-линоленовой кислот на крысах в условиях 2-неделъного эксперимента

При ежедневном 2-недельном внутрижелудочном введении ¹³С-линолевой и ¹³С-линоленовой кислот крысам в дозах 5 и 25 мкг/кг не выявлено существенных изменений в поведении и внешнем виде животных. Они имели гладкий шерстный покров, охотно поедали корм, сохраняли обычную двигательную активность.

Масса тела крыс во всех подопытных группах, получавших исследуемые препараты ¹³C-линолевой и ¹³C-линоленовой кислот, в течение теста на субхроническую токсичность существенно не отличалась от контроля (Таблица 1).

В течение всего теста на субхроническую токсичность не удалось выявить какие-либо значимые различия в количестве форменных элементов крови и уровне гемоглобина у животных, получавших исследуемые препараты, по сравнению с контролем (Таблицы 2 и 3).

В условиях теста на субхроническую токсичность при введении изучаемых соединений (¹³C-линолевой и ¹³C-линоленовой кислот) крысам в дозах 5 и 25 мг/кг существенных изменений в уровне общего белка в сыворотке крови выявлено не было. Это указывает на стабильность работы печени, связанную с синтезом основной массы белков крови (Таблица 4).

Для исследования возможного повреждающего действия изучаемых соединений (¹³C-линолевой и ¹³C-линоленовой кислот) на печень также определяли активность ферментов и уровень общего билирубина. Как показали результаты, изменения активности ферментов и уровня общего билирубина в сыворотке крови подопытных животных во всех группах не выходили за пределы физиологической нормы для данного вида лабораторных животных и существенно не отличались от соответствующих показателей в группе контроля (Таблицы 5 и 6).

Показатели мочевины и креатинина в сыворотке крови животных основной группы, которым внутрижелудочно вводили на протяжении всего субхронического изучения ¹³С-линолевую кислоту, не отличались от соответствующих показателей в контрольной группе животных (Таблица 7).

Как показало изучение углеводного обмена, ¹³C-линолевая и ¹³C-линоленовая кислоты в испытанных дозах 5 и 25 мг/кг в течение наблюдения не оказывали влияния на уровень глюкозы в сыворотке крови крыс и ее показатели находились в пределах допустимых физиологических значений для данного вида лабораторных животных (Таблица 8).

Для выявления возможного токсического действия ¹³C-линолевой и ¹³C-линоленовой кислот в условиях субхронического эксперимента на метаболизм липидов было изучено содержание в сыворотке крови животных общего холестерина и триглицеридов. По результатам исследования, введение ¹³С-линолевой и ¹³С-линоленовой кислот крысам в дозах 5 и 25 мг/кг ежедневно в течение 14 дней не оказало влияния на показатели липидного обмена (Таблицы 9 и 10).

Отсутствие влияния при субхроническом внутрижелудочном введении ¹³C-линолевой и ¹³С-линоленовой кислот крысам линии Wistare дозах 5 и 25 мг/кг на функциональное состояние и морфологическую картину важнейших внутренних органов и систем организма было подтверждено результатами патоморфологических исследований, показавших отсутствие патологических изменений во внутренних органах подопытных животных, а также общих и местных токсических реакций, связанных с действием изучаемых соединений.

Таким образом, в ходе осуществления изобретения было показано, что внутрижелудочное введение ¹³C-линолевой и ¹³C-линоленовой кислот крысам Wistar обоего пола ежедневно в течение 2-х недель в дозах 5 и 25 мг/кг (5- и 25-кратные диагностические дозы) не оказывало влияния, как на интегральные показатели, так и на общие и биохимические показатели крови, не изменяло гистологической структуры важнейших внутренних органов и систем животных основных групп.

Методы анализа и приборы

Структуру и чистоту полученных промежуточных и конечных продуктов контролируют:

- спектроскопией ядерного магнитного резонанса на приборе АМ-300 (Bruker, Германия, 300 МГц) и DRX-500 (Bruker, Германия, 500 МГц);

- тонкослойной хроматографией на силикагеле на пластинках Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Германия) и sorbfil ПТСХ-АФ-В-УФ, в системе этилацетат: гексан (1:1), если специально не оговорено иное.

Масс-спектры получают на установке FiniganMATINCOS 50 (70 эв) с прямым вводом и масс-спектрометре высокого разрешения MicrOTOFII (BrukerDaltonics, Германия) (ESI).

Изобретение относится к области органической химии и касается способа синтеза линолевой и линоленовой кислоты, меченной изотопами углерода ¹³С и ¹⁴С в положении 1, которая может быть использована в качестве средства для выполнения дыхательных тестов, в частности, в интересах диагностики функциональной активности органов пищеварения и гепатобиллиарной системы. Способ синтеза ¹³С-линолевой, ¹³С-линоленовой, ¹⁴С-линолевой и ¹⁴С-линоленовой кислот включает конденсацию углекислого газа, меченного ¹⁴С или ¹³С, с реактивом Гриньяра, получаемым из 1-бром-8,11-гептадекандиена (в случае линолевой кислоты) или из 1-бром-8,11,14-гептадекантриена (в случае линоленовой кислоты), выполняемую в следующей последовательности стадий: а - получение реактива Гриньяра реакцией металлического магния с 1-бром-8,11-гептадекандиеном (в случае линолевой кислоты) или с 1-бром-8,11,14-гептадекантриеном (в случае линоленовой кислоты) в присутствии металлического йода; b - карбоксилирование реактива Гриньяра, полученного в пункте а, в течение 5-15 мин при температуре -20°C при постоянном перемешивании, углекислым газом, меченным ¹⁴С или ¹³С, получаемым разложением серной кислотой карбоната бария, меченного ¹⁴С и ¹³С, при давлении СО₂ в приборе не свыше 500 мм рт.ст. (поддерживается капельным дозированием серной кислоты); после прекращения изменения давления в системе реакционную колбу охлаждают жидким азотом с целью количественного переноса в нее оставшегося в системе ¹⁴СО₂ или ¹³CO₂, закрывают кран, соединяющий прибор с источником CO₂, и перемешивают реакционную массу в течение 15 мин при температуре -20°C с целью полного включения изотопно меченного углекислого газа в продукт синтеза: линолевую или линоленовую кислоту. Технический результат изобретения состоит в ускорении процесса получения целевых продуктов, сокращении потерь углекислого газа, меченного ¹⁴С или ¹³С, в повышении его суммарного химического и радиационного выхода по сравнению с прототипом, а также исключению распределения изотопно-меченных атомов по всей длине углеродной цепи ацила: включение происходит только в положении 1. Упрощение и удешевление процесса получения целевого продуктов линолевой (октадекадиен-9,12-овой-1) и линоленовой (октадекатриен-9,12,15-вой-1) кислот обеспечено уменьшением длительности, повышением радиационного и химического выхода продукта по источнику изотопа по сравнению с прототипом. В результате использования изобретения практически полностью исключается выброс радиоактивных отходов во внешнюю среду, так как включение его в целевой продукт приближается к количественному. 10 табл., 2 пр., 4 ил.

Способ синтеза ¹³С-линолевой, ¹³С-линоленовой, ¹⁴С-линолевой и ¹⁴С-линоленовой кислот, включающий конденсацию углекислого газа, меченного ¹⁴С или ¹³С, с реактивом Гриньяра, получаемым из 1-бром-8,11-гептадекандиена (в случае линолевой кислоты) или из 1-бром-8,11,14-гептадекантриена (в случае линоленовой кислоты), выполняемую в следующей последовательности стадий:

а - получение реактива Гриньяра реакцией металлического магния с 1-бром-8,11-гептадекандиеном (в случае линолевой кислоты) или с 1-бром-8,11,14-гептадекантриеном (в случае линоленовой кислоты) в присутствии металлического йода;

b - карбоксилирование реактива Гриньяра, полученного в пункте а, в течение 5-15 мин при температуре -20°C при постоянном перемешивании, углекислым газом, меченным ¹⁴С или ¹³С, получаемым разложением серной кислотой карбоната бария, меченного ¹⁴С и ¹³С, при давлении СО₂ в приборе не свыше 500 мм рт.ст. (поддерживается капельным дозированием серной кислоты); после прекращения изменения давления в системе реакционную колбу охлаждают жидким азотом с целью количественного переноса в нее оставшегося в системе ¹⁴СО₂ или ¹³CO₂, закрывают кран, соединяющий прибор с источником CO₂, и перемешивают реакционную массу в течение 15 мин при температуре -20°C с целью полного включения изотопно меченного углекислого газа в продукт синтеза: линолевую или линоленовую кислоту.