СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУЖНОГО ГЕНИТАЛЬНОГО ЭНДОМЕТРИОЗА Российский патент 2009 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и найдет широкое применение для объективной диагностики наружного генитального эндометриоза (НГЭ).

Внедрение в последние 20-30 лет в практику инструментальных, эндоскопических, генетических, иммунологических методов расширило диагностические возможности при обследовании больных с эндометриозом. Частота выявления эндометриоза у гинекологических больных репродуктивного возраста колеблется от 7 до 50%. Наиболее частыми недостатками в диагностике являются: нераспознавание эндометриоза, ошибочное установление диагноза у некоторых онкологических и неврологических больных при отсутствии у них эндометриоза, запоздалая диагностика. «Золотым» стандартом диагностики эндометриоза являются лапароскопия и гистероскопия с последующим гистологическим исследованием биопсированных тканей. Однако частота гистологического подтверждения диагноза колеблется от 70 до 85%. Положительный результат биопсии подтверждает диагноз эндометриоза, в то время как отрицательный совершенно не исключает эндометриоидную болезнь, так как на исследование могут попасть лишь отдельные кусочки тканей, лишенные характерных морфологических признаков эндометриоза (В.П.Баскаков, Ю.В.Цвелев, Е.Ф.Кира. Эндометриоидная болезнь. Санкт-Петербург, 2002 г., 448 с.). Анализ патентной и научно-медицинской литературы позволил установить, что существующие способы диагностики НГЭ относятся в основном к инвазивным.

1. Известен способ ранней диагностики наружного генитального эндометриоза у женщин (заявка №2003113514, 2004 г.) по определению катепсина D при биопсии эндометрия при его значении 0,1 Ед.о.п./ч и менее.

2. Известен способ диагностики наружного генитального эндометриоза (патент №2219548, 2003 г.) по спектрофотометрическому определению уровня молекул средней массы в перитонеальной жидкости.

3. Известен способ диагностики наружного генитального эндометриоза (патент №2164687, 2001 г.) по исследованию периферической крови больного и определению спонтанной НСТ-активности нейтрофилов после их инкубации с ПАМГ-2.

4. Известен диагностический тест, при котором учитывается абсолютное количество макрофагов в перитонеальной жидкости - 13·10⁶, позволяющее диагностировать наличие эндометриоза (Oosterlynck D.J., Lacquet F.A., Waer М. et al. Lymphokine - activated killer activity in women with endometriosis // Gyn. Obstet. Invest. - 1994. - Vol.37, №3. - P.185-190).

5. Известен скрининговый экспресс-тест для оценки тяжести состояния пациентки и степени иммунологических нарушений при мониторинге лечения по проведению компьютерной морфометрии лимфоцитов в случае эндометриоза (С.А.Гаспарян, И.А.Василенко, Н.Г.Есаян, М.А.Лысенко. Возможности компьютерной морфометрии клеток в оценке иммунологических нарушений при эндометриозе // Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний. Москва, 2007, с.232-233).

6. Известен способ диагностики наружного генитального эндометриоза (патент №2265223, 2005 г.). Сущность изобретения состоит в том, что в пробе периферической венозной крови определяют относительное содержание CD45RO+ лимфоцитов и при его значении, равном 31% или менее, диагностируют наружный генитальный эндометриоз.

7. Известен способ диагностики наружного генитального эндометриоза у женщин с бесплодием (патент №2291439, 2007 г.) в периферической венозной крови которых определяют показатель относительного содержания CD16+ моноцитов в моноцитарном гейте и при его значениях, равных или меньших 45%, диагностируют наружный генитальный эндометриоз.

Ранее в качестве потенциальных маркеров эндометриоза было использовано определение в сыворотке крови СА-125, интерлейкина-6 (ИЛ-6), фактора некроза опухоли (ФНО-α) и сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР). Полноценное применение этих методов в клинической практике ограничено низкими чувствительностью и специфичностью (В.А.Бурлев, A.Larsson, М.Olovsson. Фактор роста фибробластов-2 в диагностике перитонеальной формы эндометриоза // Акушерство и гинекология, №3, 2007, с.50-54).

Основными недостатками выше описанных способов диагностики НГЭ является прежде всего или инвазивность (4, 5), или необходимость использования дорогостоящей аппаратуры (1), что ограничивает применение методов в практической медицине. К существенным недостаткам в ряде случаев можно отнести сложность расчета или возможность частых ошибок из-за крайне низких значений экстинкций, используемых для расчета величин в единицах оптической плотности (1) и длительность их проведения (2, 4).

Прототипом данного изобретения избран способ диагностики НГЭ по определению содержания ФРФ-2 (фактора роста фибробластов) в сыворотке крови и перитонеальной жидкости (В.А.Бурлев, A.Larsson, М. Olovsson. Фактор роста фибробластов-2 в диагностике перитонеальной формы эндометриоза // Акушерство и гинекология, №3, 2007, с.50-54).

Сущность способа-прототипа состоит в том, что в сыворотке крови и перитонеальной жидкости определяют содержание ФРФ-2, повышенные количества которого могут быть использованы для диагностики НГЭ.

Данный способ обладает рядом несовершенств:

1. Метод не специфичен (основной фактор роста фибробластов-2 является проангиогенным фактором роста и присутствует в эутопическом и эктопическом эндометрии, он играет исключительно важную роль не только для ангиогенеза в эндометрии, но и для ангиогенеза в организме человека (Ferriani R.A., Charnock-Jones D.S., Prentice A. et al. // Hum. Reprod. - 1993. - Vol.8. - P.11-16. Moller В., Rasmussen C, Lindblom В., Olovsson M. // Mol. Hum. Reprod. - 2001. - Vol.5 - P.681-684).

2. Ограничение возможности применения метода (только в крупных перинатальных центрах).

3. Для выполнения метода необходим высококвалифицированный специалист. Указанные недостатки устраняются в заявляемом изобретении.

Задача заявляемого изобретения: разработка специфического способа, позволяющего с высокой точностью диагностировать НГЭ.

Поставленная задача решается следующим образом. При лапароскопии получают перитонеальную жидкость, а также производят забор крови у пациентки из локтевой вены, определяют содержание сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР) (иммуноферментным методом наборами «Bender MedSystems» (Austria) по соответствующим протоколам) в сыворотке крови и в перитонеальной жидкости, после чего осуществляют расчет их соотношения, и если его значение больше 4,35, диагностируют НГЭ.

Важная роль ангиогенеза в патогенезе НГЭ подтверждена многочисленными исследованиями. Развитие новых кровеносных сосудов, их рост и регрессия имеют существенное значение в формировании сети капилляров из эндотелиальных клеток и, очевидно, являются одним из факторов формирования эндометриоидных гетеротопий. Повышенная ангиогенная активность перитонеального окружения лежит в основе успешной имплантации эндометриоидной ткани в брюшной полости (Fujimoto J., Sakaguchi Н., Hirose R. et al. // Gyn. Obstet. Inv. - 1999; 48: 14-20).

СЭФР относят к ключевым факторам высокой метаболической активности, которые стимулируют размножение эндотелиальных клеток, обеспечивая рост сосудов и их проницаемость (Vernon M.W., Wilson Е.А. // Fertil. Steril. - 1985; 44: 684-694).

Установлено также, что имеются различия в митотической активности между красными, черными и белыми гетеротопиями на брюшине и что их пролиферативная активность коррелирует с концентрацией СЭФР в перитонеальной жидкости (Khan K.N., Masuzaki Н., Fujishita A. et al. // Acta Obstetr. Gynecol. Scand. - 2004. - Vol.83. - P.375-382). Последняя является более высокой при эндометриозе (Mahne J.L., Dawood M.Y., Huang J.-C. // Fertil. and Steril. - 2000. - Vol.73 - P166-170).

Определение СЭФР только в сыворотке крови не имеет большой ценности для диагностики эндометриоза (Gagne D., Page М., Robitaille G. et al.// Hum. Reprod. - 2003. - Vol.18. - P.1674-1680; Potlog - Nahari C, Stratton P., Winkel C. et al. // Fertil. and Steril. - 2004. - Vol.81. - P.1507-1512) вследствие, как указывалось выше, наблюдающегося роста уровня СЭФР в сыворотке крови при различных опухолевых процессах. Тогда как исследование перитонеальной жидкости с определением содержания СЭФР в ней и расчет соотношения с сывороточным уровнем является специфическим и объективным критерием для диагностики наружного генитального эндометриоза, как показали наши исследования.

Таким образом, данный диагностический подход может служить существенным фактором, позволяющим при разработке методов диагностики НГЭ у пациенток использовать данное отношение.

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1. Больная П-ая, 25 лет. История болезни №7880/2233. Поступила в гинекологическое отделение №1 РНИИАП 13.12.2005 г.Диагноз: Двусторонние эндометриоидные кисты яичников. Наружный генитальный эндометриоз 4 ст. 14.12.2005 г. проведена лапароскопия: удаление кист обоих яичников, биопсия брюшины, вапоризация очагов эндометриоза. В сыворотке крови и перитонеальной жидкости пациентки определено содержание СЭФР иммуноферментным методом набором «Bender Med Systems» (Austria).

Перед анализом стандарты и образцы исследуемых сывороток разбавляли рабочим буфером. Далее образцы и стандарты вносили в лунки, покрытые AT к исследуемому фактору. После соблюдения необходимых режимов инкубации и промывания в лунки вносили раствор хроматогенного субстрата. После инкубации смеси и развития окраски реакцию останавливали добавлением стоп-раствора, после чего на спектрофлюориметре («Wallac Оу», Финляндия) определяли оптическую плотность растворов. Расчет значений осуществляли по калибровочным кривым, выраженным в пг/мл. Полученные значения умножали на коэффициент разведения образцов.

Содержание СЭФР в сыворотке крови составило 150,5 пг/мл, в перитонеальной жидкости - 34,5 пг/мл. Отношение данных показателей составило 4,36, что позволило диагностировать НГЭ. Гистологическое исследование (№17211-17213) подтвердило наличие у пациентки эндометриоза.

Пример 2. Больная Г-ва, 29 лет. История болезни 4693/1499. Поступила в гинекологическое отделение №1 РНИИАП 27.07.2005. Диагноз: Киста правого яичника. Ретроцервикальный эндометриоз. Полип эндометрия. Хронический двусторонний эндосальпингит. Гидатиды обеих маточных труб. 28.07.2005 г. произведена лапароскопия: хромогидротубация, овариолизис, Дренирование и электрокаутеризация капсулы кисты правого яичника. Биопсия брюшины, коагуляция очагов эндометриоза. Гидроперитонеум, дренирование брюшной полости. Выскабливание стенок полости матки.

В сыворотке крови и перитонеальной жидкости пациентки определено содержание СЭФР иммуноферментным методом набором «Вепаег Med Systems» (Austria). Содержание СЭФР в сыворотке крови составило 370,5 пг/мл, в перитонеальной жидкости - 85,2 пг/мл. Отношение данных показателей составило 4,35, что по нашим данным свидетельствовало об отсутствии у данной пациентки НГЭ. Гистологическое исследование №10663-64, 10659, 10660-62 не подтвердило наличие у больной наружного генитального эндометриоза.

Пример 3. Больная Д-ко, 23 лет. История болезни 3981/1244. Поступила в гинекологическое отделение №1 РНИИАП 28.06.2005 г. Диагноз: Наружный генитальный эндометриоз 2 ст. Ретроцервикальный эндометриоз. Киста правого яичника. 29.06.2005 г. произведена лапароскопия - вапоризация очагов эндометриоза, удаление кисты правого яичника.

В сыворотке крови и перитонеальной жидкости пациентки определено содержание СЭФР иммуноферментным методом набором «Bender Med Systems» (Austria). Содержание СЭФР в сыворотке крови составило 559,7 пг/мл, в перитонеальной жидкости - 113,3 пг/мл. Отношение данных показателей составило 4,9, что позволило диагностировать НГЭ. Гистоанализ №8774-79 подтвердил диагноз НГЭ.

По заявляемому способу обследовано 70 пациенток, среди которых у 55 отношение содержания СЭФР в сыворотке крови к СЭФР перитонеальной жидкости было от 4,35 до 4,9 и у 15 - 4,9-5,7. У всех пациенток с определяемым соотношением больше 4,35 имелось гистологическое подтверждение НГЭ.

Вышеизложенное подтверждает диагностическую ценность заявляемого метода.

Таким образом, заявляемый способ более эффективен по сравнению с известными и обладает рядом преимуществ:

1. Метод специфичен. Обладает высокой точностью. В 100% случаев был диагностирован наружный генитальный эндометриоз.

2. Исключает необходимость многократного проведения исследования.

3. Клиническое применение способа позволит своевременно диагностировать НГЭ даже при отрицательном результате гистологического заключения.

4. Метод клинически эффективен и может быть рекомендован к использованию в гинекологической практике.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии. Предложен способ диагностики наружного генитального эндометриоза. В перитонеальной жидкости, полученной при лапароскопии, и в сыворотке крови определяют содержание сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР), и если отношение содержания СЭФР в сыворотке крови к содержанию СЭФР в перитонеальной жидкости больше 4,35, диагностируют наличие наружного генитального эндометриоза. Способ позволяет с высокой точностью устанавливать диагноз наружного генитального эндометриоза у пациенток.

Способ диагностики наружного генитального эндометриоза, включающий исследование сыворотки крови и перитонеальной жидкости, отличающийся тем, что в полученных образцах иммуноферментным методом определяют содержание сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР) и, если отношение содержания СЭФР в сыворотке крови к содержанию СЭФР в перитонеальной жидкости превышает значение 4,35, диагностируют наружный генитальный эндометриоз.