СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЭНДОМЕТРИОИДНЫХ КИСТ ЯИЧНИКОВ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и найдет широкое применение для объективной диагностики эндометриоидных кист яичников (ЭКЯ).

Внедрение в последние 20-30 лет в практику инструментальных, эндоскопических, генетических, иммунологических методов расширило диагностические возможности при обследовании больных с эндометриозом. Частота выявления эндометриоза у гинекологических больных репродуктивного возраста колеблется от 7 до 50%. Наиболее частыми недостатками в диагностике являются: нераспознавание эндометриоза, ошибочное установление диагноза у некоторых онкологических и неврологических больных при отсутствии у них эндометриоза, запоздалая диагностика. «Золотым» стандартом диагностики эндометриоза являются лапароскопия и гистероскопия с последующим гистологическим исследованием биопсированных тканей. Однако частота гистологического подтверждения диагноза колеблется от 70 до 85%. Положительный результат биопсии подтверждает диагноз эндометриоза, в то время как отрицательный совершенно не исключает эндометриоидную болезнь, так как на исследование могут попасть лишь отдельные кусочки тканей, лишенные характерных морфологических признаков эндометриоза (В.П.Баскаков, Ю.В.Цвелев, Е.Ф.Кира. Эндометриоидная болезнь. Санкт-Петербург, 2002 г., 448 с.). Анализ патентной и научно-медицинской литературы позволил установить, что существующие способы диагностики ЭКЯ относятся в основном к инвазивным.

Ультрасонография прочно вошла в медицинскую практику как один из объективных методов диагностики и динамического наблюдения гинекологических больных. Трансвагинальное ультразвуковое сканирование, по данным ряда исследователей, не позволяет выявить поверхностные эндометриоидные импланты на брюшине малого таза, однако обеспечивает надежную диагностику эндометриоидных кист яичников с чувствительностью 74% и специфичностью 75%. Метод помогает уточнить локализацию кисты, ее динамику под влиянием терапии и др.

Наиболее характерные эхографические признаки эндометриоидных кист яичников:

- наличие средней и повышенной эхогенности исследуемой не смещаемой мелкодисперсной взвеси;

- расположение кисты сзади и сбоку от матки;

- утолщенная эхо-плотная капсула кисты;

- относительно небольшие размеры кисты, не превышающие в диаметре 9 см;

- двойной контур образования;

- неравномерность стенки образования (30% случаев);

- по ЦДК кровоток внутри образования отсутствует.

(Адамян Л.В., Кулаков В.И., Андреева Е.Н. Эндометриозы: руководство для врачей. М: Медицина 2006; 416 с.; Ищенко А.И., Кудрина Е.А. Эндометриоз: современные аспекты. М: Медицина 2008; 176 с.; Choundhary S., Fasih N., Papadatos D., Surabhi V.R. Unusual Imaging Appearances of Endometriosis. AJR 2009; 192: p 1632-1644.; Steinkeler J.A., Woodfield C.A., Hillstrom M.M. Female Infertility: A Systematic Approach to Radiologic Imaging and Diagnosis. RadioGraphics 2009; Vol.29, N.5, P.1353-1370.; Woodward P.J., Sohaey R., Mezzetti T.P. Endometriosis: radiologic-pathologic correlation. RadioGraphics 2001; 21: p 193-216).

В настоящее время применяется MPT диагностика эндометриоидных кист яичника. Для эндометриоидных кист яичников характерно наличие высокой интенсивности магнитно-резонансного сигнала в режиме Т1 ВИ и отсутствие магнитно-резонансного сигнала в режиме магниторезонансной гидрографии. Эндометриоидные кисты яичника имеют четкий наружный контур, неравномерно утолщенную стенку до 0,5 см, неровные внутренние контуры, размеры до 7-10 см, преимущественно 2-4 см. Сигнал на Т2 ВИ низкий за счет отложения гемосидерина. Гипоинтенсивный или изоинтенсивный (со слабым повышением) магнитно-резонансный сигнал на Т2 ВИ связан с эффектом равномерного «затенения», являющегося специфической особенностью эндометриоидных кист яичников, отличающих их от других кист с геморрагическим содержимым. Кисты имеют округлую или овальную форму, часто бывают множественными. Варьирующий сигнал на Т2 ВИ свидетельствует о различной консистенции их содержимого - от жидкого геморрагического до густого, особенно при наличии плотного обызвествленного сгустка. (1. Кулаков В.И., Адамян Л.В., Волобуев А.И. и др. Магниторезонансная томография в диагностике различных форм эндометриоза // Вестник рентгенологии и радиологии. - 2003. - №4. - С.45-59; Al-Jefout М, Dezarnaulds G, Cooper М, et al. Diagnosis of endometriosis by detection of nerve fibres in an endometrial biopsy: a double blind study. Hum Reprod. - 2009. 24: p 3019-3024.; Sokor A, Kyama CM, Vercruysse L, et al. Density of small diameter sensory nerve fibres in endometrium: a semi-invasive diagnostic test for minimal to mild endometriosis. Hum Reprod. - 2009.24: p 3025-3032.).

Известен способ ранней диагностики наружного генитального эндометриоза у женщин (патент РФ №2247391, 27.02.2005) по определению катепсина D при биопсии эндометрия при его значении 0,1 Ед.о.п./ч и менее.

Известен способ диагностики наружного генитального эндометриоза (патент РФ №2291439, 2007 г.) по определению в периферической венозной крови показателя относительного содержания CD16+ моноцитов в моноцитарном гейте и при его значениях, равных или меньших 45%.

Известен способ диагностики наружного генитального эндометриоза (патент №2164687, 2001 г.) по исследованию периферической крови больного и определению спонтанной НСТ-активности нейтрофилов после их инкубации с ПАМГ-2.

Известен диагностический тест, при котором учитывается абсолютное количество макрофагов в перитонеальной жидкости -13·10⁶, позволяющее диагностировать наличие эндометриоза (Oosterlynck D.J., Lacquet F.A., Waer М. et al. Lymphokine - activated killer activity in women with endometriosis // Gyn. Obstet. Invest. - 1994. - Vol.37, №3. - P.185-190).

Известен скрининговый экспресс-тест для оценки тяжести состояния пациентки и степени иммунологических нарушений при мониторинге лечения по проведению компьютерной морфометрии лимфоцитов в случае эндометриоза (С.А.Гаспарян, И.А.Василенко, Н.Г.Есаян, М.А.Лысенко. Возможности компьютерной морфометрии клеток в оценке иммунологических нарушений при эндометриозе // Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний. Москва, 2007, с.232-233).

Известен способ диагностики наружного генитального эндометриоза (патент №2265223, 2005 г.). Сущность изобретения состоит в том, что в пробе периферической венозной крови определяют относительное содержание CD45RO+ лимфоцитов и при его значении, равном 31% или менее, диагностируют наружный генитальный эндометриоз.

Ранее в качестве потенциальных маркеров эндометриоза было использовано определение в сыворотке крови СА-125, интерлейкина-6 (ИЛ-6), фактора некроза опухоли (ФНО-α) и сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР). Полноценное применение этих методов в клинической практике ограничено низкими чувствительностью и специфичностью (В.А.Бурлев, A.Larsson, М.Olovsson. Фактор роста фибробластов-2 в диагностике перитонеальной формы эндометриоза // Акушерство и гинекология, №3, 2007, с.50-54).

Основными недостатками выше описанных способов диагностики НГЭ является, прежде всего, или инвазивность (Oosterlynck D.J., Lacquet F.A., Waer М. et al. Lymphokine - activated killer activity in women with endometriosis // Gyn. Obstet. Invest. - 1994. - Vol.37, №3. - P.185-190; С.А.Гаспарян, И.А.Василенко, Н.Г.Есаян, М.А.Лысенко. Возможности компьютерной морфометрии клеток в оценке иммунологических нарушений при эндометриозе // Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний. Москва, 2007, с.232-233), или необходимость использования дорогостоящей аппаратуры (патент РФ №2247391, 27.02.2005), что ограничивает применение методов в практической медицине. К существенным недостаткам в ряде случаев можно отнести сложность расчета или возможность частых ошибок из-за крайне низких значений экстинкций, используемых для расчета величин в единицах оптической плотности, и длительность их проведения.

Прототипом данного изобретения избран способ диагностики НГЭ по определению содержания ФРФ-2 (фактора роста фибробластов) в сыворотке крови и перитонеальной жидкости (В.А.Бурлев, A.Larsson, M.Olovsson. Фактор роста фибробластов-2 в диагностике перитонеальной формы эндометриоза // Акушерство и гинекология, №3, 2007, с.50-54).

Сущность способа-прототипа состоит в том, что в сыворотке крови и перитонеальной жидкости определяют содержание ФРФ-2, повышенные количества которого используются для диагностики НГЭ.

Данный способ обладает рядом несовершенств:

1. Метод не специфичен (основной фактор роста фибробластов -2 является проангиогенным фактором роста и присутствует в эутопическом и эктопическом эндометрии, он играет исключительно важную роль не только для ангиогенеза в эндометрии, но и для ангиогенеза в организме человека (Ferriani R.A., Charnock-Jones D.S., Prentice A. et al. // Hum. Reprod. - 1993. - Vol.8. - P.11-16. Moller В., Rasmussen C., Lindblom B., Olovsson M. // Mol. Hum. Reprod. - 2001. - Vol.5 - P.681-684.).

2. Ограничение возможности широкого применения метода (наличие оборудования и тест-наборов только в крупных перинатальных центрах).

3. Для выполнения метода необходим высококвалифицированный специалист. Указанные недостатки устраняются в заявляемом изобретении.

Задача заявляемого изобретения: разработка специфического способа, позволяющего с высокой точностью диагностировать ЭКЯ.

Поставленная задача решается следующим образом: производят забор крови у пациентки из локтевой вены, определяют активность аргиназы (колориметрическим методом) в сыворотке крови и при ее величине 0,73 ммоль/ч/л и выше, а также при наличии кисты яичника диагностируют эндометриоидную кисту.

Важная роль ангиогенеза в патогенезе НГЭ подтверждена многочисленными исследованиями. Развитие новых кровеносных сосудов, их рост и регрессия имеют существенное значение в формировании сети капилляров из эндотелиальных клеток и, очевидно, являются одним из факторов формирования эндометриоидных гетеротопий. Повышенная ангиогенная активность перитонеального окружения лежит в основе успешной имплантации эндометриоидной ткани в брюшной полости (Fujimoto J., Sakaguchi Н., Hirose R. et al. // Gyn. Obstet. Inv. - 1999; 48: p 14-20).

В настоящее время доказано, что аргинин является основным субстратом для роста клеток, формирующих гетеротопий, к которым относятся эндометриоидные гетеротопий (доброкачественные опухоли). Снижение в крови концентрации аргинина замедляет рост эндометриоидных кист. Достигается данная метаболическая ситуация в результате действия специфического фермента, расщепляющего аргинин до орнитина-аргиназы.

Аргиназа - это фермент, который уменьшает количество аргинина и угнетает его действие (Wu G., Morris S.M. Jr. Arginine metabolism: nitric oxide and beyond. Biochem. J., 1998, 336: 1-17; Böger R.H. The pharmacodynamics of L-arginine. J.Nutr., 2007, 137: p 1650S-1655S).

Известно, что аргиназа участвует в развитии компенсаторных реакций при НГЭ, заключающихся в нарушении роста кровеносных сосудов, обусловливающих развитие гетеротопий.

Патогенетически роль высокой активности данного фермента заключается в повышении синтеза коллагенов, изменяющих соединительнотканный компонент сосуда, вызывая его фиброз (склерозирование), в результате чего снижается кровоснабжение гетеротопий, а следовательно, и их формирование.

На системном уровне в сыворотке крови во всех клинических случаях нами обнаружено повышение активности аргиназы в 2 раза.

Таким образом, данный диагностический подход может служить существенным фактором, позволяющим диагностировать ЭКЯ у пациенток.

Подробное описание способа и примеры его клинического выполнения.

Диагностику ЭКЯ осуществляют у пациенток с предварительно выявленными кистами яичника. Определение активности аргиназы проводят унифицированным колориметрическим методом (Клиническое руководство по лабораторным тестам. H.Тиц 2003 год) с использованием спектрометра Solar (Беларусь) и наборов фирмы «Вектор Бест» Россия.

Приготовление реактива и ход определения:

1. Рабочий раствор солянокислого аргинина, содержащий 250 мкг аргинина в 1 мл (готовят по мере необходимости из основного раствора с концентрацией 500 мкг солянокислого аргинина в 1 мл-50 мг / 100 мл, хранящегося при +5°C не более 2 недель).

2. Пирофосфатный буфер 0,1 моль/л, pH 9,5. Можно пользоваться и глициновым буфером, дающим более четкую цветную реакцию.

3. Раствор трихлоруксусной кислоты - 10 г/100 мл.

4. Раствор 8-гидроксихинолина - 0,02 г/100 мл (получают из 0,2 г/100 мл спиртового раствора 8-гидроксихинолина путем разведения его в 10 раз дистиллированной водой).

5. Водный раствор едкого натра - 10 г/100 мл.

6. Щелочной раствор брома (1 г брома помещают в мерный цилиндр, содержащий 50-80 мл раствора едкой щелочи, и доводят этим же раствором щелочи до объема 100 мл, щелочь - 5 г/100 мл).

7. Водный раствор мочевины - 40 г/100 мл.

Все реактивы необходимо хранить в холодильнике. В пробирку наливают 0,6 мл рабочего раствора солянокислого аргинина (150 мкг) и 0,3 мл буфера, после чего пробирку ставят в водяную баню при температуре +37°C.

Спустя 5 минут в нее добавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки, содержимое быстро смешивают и инкубируют точно 10 минут. После инкубации осаждают белки сыворотки крови с помощью 4 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Центрифугируют смесь в течение 10-15 мин (при 1500-2000 об/мин). Надосадочную жидкость сливают в чистую пробирку. Далее, в пробирку, содержащую 5 мл опытного раствора, добавляют 1 мл раствора 8-гидроксихинолина и 1 мл раствора едкого натра. Содержимое пробирки смешивают и ставят на холод (2 мин), после чего в нее добавляют 0,2 мл раствора брома и не позднее чем через 15 сек - 1 мл раствора мочевины. Точно через 60 мин в эту же пробирку приливают 2 мл холодной дистиллированной воды.

Коломитрировуют смесь на спектрометре PV 125 1С SOLAR, при длине волны 578 нМ в течение 5 мин. Одновременно проводят контрольный опыт с использованием всех указанных реагентов, но с прибавлением в контрольную пробирку вместо раствора аргинина дистиллированной воды.

Чтобы получить необходимые данные для построения калибровочной кривой, готовят пробы с применением раствора солянокислого аргинина из расчета 50 мкг аргинина в 1 мл - 0,25; 50; 75; 100; 125; 150 мкг.

По калибровочной кривой рассчитывают количество разрушенного субстрата и преобразовывают эту величину в размерность мкмоль/(мин·мл). Одну единицу активности фермента соотносят с одним мкмоль расщепленного аргинина при температуре +37°C за 1 минуту под действием аргиназы, содержащейся в 1 мл сыворотки крови.

Результаты определений активности аргиназы в сыворотке крови выражают в ммоль/(ч·л) по формуле;

ммоль/(ч·л)=С ед.·60,

где С ед. - количество мкмоль/(мин·мл); 60 - фактор пересчета.

При ее величине 0,73 ммоль/ч/л и выше диагностируют эндометриоидную кисту.

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1. Больная П-ая, 25 лет. История болезни №7880/2233. Поступила в гинекологическое отделение №1 РНИИАП 13.12.2009 г. Диагноз: Двусторонние эндометриоидные кисты яичников. Наружный генитальный эндометриоз IV степени. 14.12.2009 г. проведена лапароскопия: удаление кист обоих яичников, биопсия брюшины, вапоризация очагов эндометриоза. В сыворотке крови пациентки определена активность аргиназы колометрическим способом.

Содержание аргиназы в сыворотке крови больной составило 1,46 ммоль/ч/л. Гистологическое исследование (№17211-17213) подтвердило наличие у пациентки эндометриоза. Данный пример подтверждает работоспособность предложенного нами способа диагностики ЭКЯ.

Пример 2. Больная Г-ва, 29 лет. История болезни 4693/1499. Поступила в гинекологическое отделение №1 РНИИАП 27.07.2010 г. Диагноз: Киста правого яичника. Ретроцервикальный эндометриоз. Полип эндометрия. Хронический двусторонний эндосальпингит. Гидатиды обеих маточных труб. 28.07.2010 г. произведена лапароскопия: хромогидротубация, овариолизис. Дренирование и электрокаутеризация капсулы кисты правого яичника. Биопсия брюшины, коагуляция очагов эндометриоза. Гидроперитонеум, дренирование брюшной полости. Выскабливание стенок полости матки.

В сыворотке крови пациентки определена активность аргиназы.

Содержание аргиназы в сыворотке крови составило 0,72 ммоль/ч/л, что по нашим данным свидетельствовало об отсутствии у данной пациентки НГЭ. Гистологическое исследование №10663-64, 10659, 10660-62 не подтвердило наличие у больной наружного генитального эндометриоза.

Пример 3. Больная Д-ко, 23 лет. История болезни 3981/1244. Поступила в гинекологическое отделение №1 РНИИАП 28.06.2010 г. Диагноз: Наружный генитальный эндометриоз II ст. Киста правого яичника. 29.06.2010 г. произведено: лапароскопия вапоризация очагов эндометриоза, удаление кисты правого яичника.

В сыворотке крови пациентки определена активность аргиназы.

Содержание аргиназы в сыворотке крови составило 0,73 ммоль/ч/л, что позволило диагностировать НГЭ. Гистоанализ №8774-79 подтвердил диагноз ЭКЯ. Предложенный нами способ диагностики эндометриоидных кист яичников по определению в сыворотке крови активности аргиназы свидетельствует о работоспособности метода.

По заявляемому способу обследовано 70 пациенток, страдающих ЭКЯ, среди которых у 68 активность аргиназы соответствовала 0,73 ммоль/ч/л и выше, у двух она была равна 0,64 ммоль/ч/л и 0,72 ммоль/ч/л. У первых пациенток, которым была определена активность аргиназы, имелось гистологическое подтверждение наличия эндометриоидных кист яичников, у вторых гистологическое исследование свидетельствовало об отсутствии эндометриоидных кист.

Вышеизложенное подтверждает диагностическую ценность заявляемого метода.

Таким образом, заявляемый способ более эффективен по сравнению с известными и обладает рядом преимуществ:

1. Метод специфичен. Обладает высокой точностью. В 100% случаев были диагностированы эндометриоидные кисты яичников.

2. Исключает необходимость многократного проведения исследования.

3. Клиническое применение способа позволит своевременно диагностировать ЭКЯ даже при отрицательном результате гистологического заключения.

4. Метод клинически эффективен и может быть рекомендован к использованию в гинекологической практике.

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и описывает способ диагностики эндометриоидных кист яичников, включающий исследование сыворотки крови, где у пациенток при наличии кисты яичника колориметрическим методом определяют активность аргиназы и при ее величине 0,73 ммоль/ч/л и выше диагностируют эндометриоидные кисты яичников. Способ обеспечивает высокую точность диагностики эндометриоидных кист яичников. 3 пр.

Способ диагностики эндометриоидных кист яичников, включающий исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что у пациенток при наличии кисты яичника колориметрическим методом определяют активность аргиназы и, при ее величине 0,73 ммоль/ч/л и выше диагностируют эндометриоидные кисты яичников.