СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ СИСТЕМНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ, ФАРМКОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/14 A61K36/06 C12R1/77 

Изобретение относится к микологии и медицине, в частности к полученным из штаммов грибов-продуцентов физиологически активным веществам, средствам на их основе и их применению.

Известен штамм гриба Fusarium sambucinum Fuckel var. ossicolum (Berk, et Curt.) Bulai (Всесоюзная коллекция промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный номер ВКПМ F-165), являющийся продуцентом белка пищевого или кормового назначения, продуктивность которого достаточно высока.

Штамм F. sambucinum Fuckel var. ossicolum (Berk et Curt) Bulai F-165 выделен в стадии активного роста в процессе непрерывного культивирования мицелия штамма F. sambucinum P^s-64 (Всесоюзная коллекция промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ-Г-165).

Известен препарат «Милайф», полученный из штамма F. sambucinum var. ossicolum ВСБ-917 (ВКПМ F-169) и обладающий общеукрепляющим и адаптогенным действием, а также его применение при различных показаниях (см. патент RU 2040932).

При этом многократные попытки, предпринятые авторами по изучению активности препарата «Милайф» в отношении ряда возбудителей, в частности вирусов, представляющих собой огромную проблему для человечества, ввиду скорости их распространения и толерантности к известным методам лечения, не дали позитивных результатов.

Дальнейшие длительные исследования авторами штамма F. sambucinum F-165 привели к разработке средства нового состава и свойств, «HPM-7.0» (торговое наименование), обладающего широким спектром лечебно-профилактического действия, отличным от такового у средства "Милайф".

Сущность изобретения

В основу данного изобретения положено создание на основе штамма F. sambucinum F-165 средства, обладающего широким спектром системного физиологического действия, включающего, в частности, метаболическое, регенерирующее, иммуномодулирующее, противоопухолевое, противовирусное и антибактериальное свойства и не имеющего противопоказаний к применению.

Основу состава "HPM-7.0" составляет мицелий монокультуры гриба Fusarium sambucinum, штамм F-165, переработанный по уникальной отечественной технологии. Являясь препаратом растительного происхождения, состав "HPM-7.0" содержит разнообразный, уникальный и гармонизированный самой природой комплекс биологически активных веществ. С помощью уникальной технологии в составе "HPM-7.0" удалось собрать и сконцентрировать все самое ценное, содержащееся в биомассе мицелия. Так, например, препарат содержит 22 аминокислоты, в том числе незаменимые (триптофан, лизин, метионин). В его состав входят и ненасыщенные жирные кислоты, 50% из которых приходится на долю линоленовой кислоты. Состав характеризуется высоким для природных соединений содержанием коэнзимов Q₆, Q₉,

Q₁₀. Углеводы представлены гликанами и лентинаном, органическими кислотами, в том числе яблочной, лимонной, янтарной. Спектр витаминов включает все витамины группы B, фолиевую и никотиновую кислоты. Минеральный состав препаратов представлен 26 жизненно важными макро- и микроэлементами.

Широкое изучение применения препаратов "HPM-7.0" выявило множественные и разнородные лечебные свойства. С целью определения всего спектра лечебных возможностей препаратов "HPM-7.0" фирмой-производителем "ДИЖАФАРМ" был предпринят комплекс исследований в ведущих научных медицинских институтах России. Исследованиям был целенаправленно придан разноплановый характер. Открытые многочисленные эффекты оказались столь разнообразны, что не могли быть полностью и последовательно объяснены с позиций традиционных представлений медицинской биологии, физиологии и фармакологии.

В этой связи была сформулирована Концепция интегрирующих системных препаратов, к которым и была отнесен состав "HPM-7.0".

В соответствии с указанной Концепцией состав "HPM-7.0" оказывает на организм человека не специфичное узконаправленное, а интегрирующие и системное действие. Уникальный комплекс веществ запускает в действие всю защитную систему организма с целью восстановления его целостности. Роль препаратов "HPM-7.0" состоит в активации базовых информационных и энергетических процессов в направлении восстановления системности организма.

В соответствии с выдвинутой Концепцией важнейшая часть эффекта препарата состоит в восстановлении внутренних системных связей организма: в восстановлении их полномасштабности, интенсивности, в их взаимном уравновешивании и гармонизации, в возвращении всей суммы параметров организма к исходным. Поскольку восстанавливается вся системная иерархия организма, начиная с уровня синтеза наиболее простых химических соединений, образующих тело человека, т.е. с наноуровня, то всю группу разработанных медицинских лечебных технологий на основе состава "HPM-7.0", как и саму технологию производства этих препаратов, можно объединить одним названием "HPM-7.0-технологии" и отнести к группе нанотехнологий.

Установлено, что средство «HPM-7.0» обладает системным действием, по-видимому, за счет коррекции биопроцессов организма человека на наноуровне, что позволяет использовать его для профилактики и лечения состояний и заболеваний, связанных с накоплением в клетках экстрахромосомной ДНК, со снижением дефектных и увеличением точности репликации существующих ДНК-последовательностей.

Другой важной отличительной особенностью состава «HPM-7.О» является то, что средство может быть введено не только энтеральным, но и парентеральным, вагинальным, ректальным, наружным (например, в косметически-лечебных формах по уходу за кожей и полостью рта), оральным и прочим способом введения.

Примеры соответствующих лекарственных форм включают, не ограничиваясь ими ампулы для внутримышечного и внутривенного введения, ректальные и вагинальные суппозитории, гель и порошок для наружного применения, антисептические и косметические салфетки с пропиткой препаратом «HPM-7.0», таблетки, порошок, пастилки и прочее.

Любая из указанных лекарственных форм может быть получена по широко известным в области фармации методикам и в общем случае заключается в соединении путем смешения, растворения и прочего активного начала средства «HPM-7.0» с носителем, наполнителем или разбавителем и, необязательно, с другими целевыми добавками.

Выбор соответствующих носителей, наполнителей, разбавителей и целевых добавок для получения любой из указанных форм осуществляется специалистом на основании известных в области фармации принципов и правил.

Эффективное количество активного начала в лекарственной форме определяется в зависимости от пути введения, состояния или заболевания, которое следует лечить, степени его тяжести, веса и возраста пациента, и прочее. В общем случае дозы, эффективные для профилактики и лечения указанных состояний и заболеваний, могут варьировать в пределах от около 1 мкг до около 500 мг, соответственно, эффективное количество в единичной стандартной дозе лекарственного препарата может варьировать примерно в пределах от 1 мкг до 500 мг.

В частности, разовая доза при введении per os может, в частности, составлять от 10 мкг до 10 мг, суточная от 20 мкг до 200 мг в расчете на активное начало, средство «HPM-7.0».

При парентеральном введении разовая доза может, в частности, составлять от 1 мкг до 1 мг, суточная от 2 мкг до 6 мг; при вагинальном или ректальном введении разовая доза может, в частности, составлять от 5 мкг до 5 мг; суточная от 10 мкг до 30 мг.

Таким образом, изобретение касается средства «HPM-7.0», фармкомпозиций на его основе и его применения для коррекции биопроцессов организма человека на наноуровне, а также лечения и профилактики заболеваний, связанных с накоплением в клетках организма генетически избыточной (экстрахромосомной) ДНК и с увеличением дефектных и снижением точности репликации существующих ДНК-последовательностей.

Фиг.1: Спектр оптического поглощения в видимом диапазоне препарата «HPM-7», разведение 1:2.

Фиг.2: Спектр оптического поглощения в УФ-диапазоне препарата «HPM-7», разведение 1:100.

Фиг.3: Спектр оптического поглощения в УФ-диапазоне препарата «HPM-7».

Фиг.4: График кинетики деления популяции клеток MEF в присутствии «HPM-7».

По оси абсцисс - пассажи, по оси ординат - общее число клеток в популяции.

Ext M1 - концентрация «HPM-7» - 0.03%;

Ext М3 - концентрация «HPM-7» - 0.1%;

К - контроль (без «HPM-7»).

Фиг.5: Электрофореграмма препарата «HPM-7» в 10% ПААГ (29:1). Окрашивание этидия бромидом. Стрелками указаны дорожки, в которые были нанесены пробы.

Выявлена дополнительная высокомолекулярная фракция на старте, вероятно, за счет меньшей степени деградации ДНК.

ДНК² - дважды депротеинизированная фракция препарата - «HPM-7»;

ДНК - депротеинизированная фракция препарата - «HPM-7»;

ДНК-0 - препарат - «HPM-7».

Фиг.6: Исследование влияния средства «HPM-7.0» на ПЦР.

Дорожки 1-6 - добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) депротеинизированной фракции «HPM-7.0» без добавления ДНК клеточной линии SW480.

Дорожки 7-12 - добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) депротеинизированной фракции «HPM-7.0» с добавлением ДНК клеточной линии SW480.

Дорожки 13-18 - добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) «HPM-7.0» в разведениях 1:100, 1:500, 1:1000 с добавлением ДНК клеточной линии SW480.

Дорожки 19-20 - контроль проведения ПЦР. Добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) ДНК клеточной линии SW480 без добавления средств «HPM-7.0».

I. ДНК, выделенная из «HPM-7».

II. ДНК, выделенная из «HPM-7» с добавлением ДНК клеточной линии SW480.

III. «HPM-7» с добавлением ДНК клеточной линии SW480.

Фиг.7-11: маммограммы динамики объемного образования правой молочной железы больной под шифром Я.И.Л., с ноября 2006 г. по июнь 2007 г.

Способ получения средства «HPM-7.0»

Процесс получения включает выращивание на стерилизованной среде мицелия гриба штамма F. sambucinum F-165 в ферментационных аппаратах, сгущение, выделение, очистку, концентрирование и сушку полученного средства.

В качестве источника углерода, азота, калия и фосфора для роста мицелия используют соответственно мелассу, сахар-сырец, сахарозу, глюкозу, барду, молочную сыворотку, соки корнеплодов и зеленой массы, азотнокислый аммоний и кислый фосфорнокислый калий и прочее.

Культивирование мицелия осуществляют в рабочем аппарате в течение примерно 23-27 часов, при непрерывной подаче воздуха и t° около 23-25°С. Материал считается готовым, когда концентрация сухих веществ мицелия в культуральной среде достигает примерно 40 г/л. Далее осуществляют сгущение культуральной среды, очистку, концентрирование и обезвоживание продукта в течение примерно 30 мин в режиме, щадящем в отношении сохранения биологической активности (t° до около +50°С). Полученный таким образом коричневый порошок, средство «HPM-7.0», анализируют. Установлено, что полученное средство «HPM-7.0» представляет собой низкомолекулярное пептидное соединение с диаметром от 1 до 50 нм.

Способ включает следующие стадии:

Сырая биомасса мицелия гриба Fusarium sambucinum Fuckel var. ossicola Bilai F-165, полученная после фильтрации на нутч-фильтре культуральной жидкости, подвергается промывке дистиллированной водой.

Хорошо отжатая биомасса замораживается в морозильной камере и через сутки размораживается при комнатной температуре, затем повторно замораживается. Таким образом, осуществляются трехкратная заморозка и размораживание.

После последней разморозки биомасса заливается дистиллированной водой в соотношении 1:1 и трижды гомогенизируется по 3 раза с интервалом в 20 сек.

Полученный гомогенат заливается в соотношении 1:3 спиртом (изопропиловым, изобутиловым, этиловым) и помещается на качалку на 12-16 часов для экстракции.

После экстракции однородную массу центрифугируют при 8000-12000 об/мин на центрифуге. Полученный супернатант собирают в отдельную емкость. Биомассу выбрасывают. Супернатант подвергают выпариванию на вакуумном-роторном испарителе при температуре, не превышающей 45°С. В концентрированную суспензию после выпаривания добавляют лактозу (1-2%) и лиофилизируют на сублимационной сушилке.

Результаты анализа состава «HPM-7.0» приведены в таблице А.

Таблица А Химический состав и описание «HPM-7.0» Показатель содержания Ед. измерения Объект анализа «HPM-7.0» Общий белок % от около 55,8 до около 56,2 Сумма полисахаридов % от около 9,6 до около 14,6 Сумма липидов % от около 4,22 до около 7,59 Минеральные элементы Натрий % от около 9,28 до около 9,78 Калий % от около 1,86 до около 1,87 Кальций   от около 1,53 до около 1,57 Магний   от около 2,28 до около 2,30 Железо % от около 2,9 до около 3 Цинк % от около 7,19 до около 7,36 Медь   от около 1,21 до около 1,3 Марганец   от около 0,21 до около 0,28 Кобальт % от около 0,14 до около 0,15 Никель   от около 0,21 до около 0,26 Хром   от около 0,12 до около 0,14 Молибдена ^% Следы Витамины Витамин B₁ % от около 0,033 до около 0,036 Витамин B₂ % от около 0,068-0,074 Витамин B₃ (Пантотеновая кислота) % от около 0,176 до около 0,189 Холин % Не обнаружен Витамин PP (Ниацин) % от около 0,450 до около 0,466 Витамин B₆ (Пиридо около околоксин) % от около 0,052 до около 0,059 Витамин B_c (Фолиевая кислота) % от около 0,023 до около 0,029 Витамин B₁₂ % от около 0,005 до около 0,0055 Витамин H (Биотин) % от около 0,0015 до около 0,0019

Определение содержания ДНК

Методы исследования

Расчет содержания ДНК выполнен при помощи спектрофлуориметрии на приборе DyNA Quant 200, Hoefer Pharmacia Biotech с использованием красителя Hoehst (Bisbenzimide H 33258). В качестве стандарта сравнения использовали раствор ДНК с известной концентрацией.

Результаты представлены на Фиг.1-3 и в Таблице В.

Таблица В Разведение (~1:100) Разведение (~1:400) OD (_{230-длина волны)} 1,810 0,551 OD (_{260-длина волны)} 2,000 0, 613 OD (_{280-длина волны)} 0,953 0,288

Спектры оптического поглощения в регистрирующем спектрофотометре снимали как в ультрафиолетовом, так и видимом диапазоне (см. Фиг.1-3). Показано, что соотношение оптического поглощения при длинах волн 260 нм и 280 нм составило 2,0, что свидетельствует о малом количестве белков или полипептидов в водорастворимой части средства «HPM-7.0». Такое соотношение характерно для нуклеиновых кислот или их фрагментов.

При малом разведении «HPM-7.0» (1:2) обнаружен пик оптического поглощения в районе 410 нм, что может быть отнесено к продуктам окисления хинонов, например убихинонов, которые содержатся в больших количествах в изучаемом виде гриба.

Соотношение оптического поглощения при длинах волн 260 нм/280 нм составило для «HPM-7.0» более 2,0, однако соотношение оптического поглощения при длинах волн 260 нм/230 нм составило всего около 1,1, что свидетельствует о наличии полисахаридов в составе средства (Фиг.2 и 3).

Электрофоретический анализ компонентов средства «HPM-7.0»

Измерения концентрации ДНК проводили на флуориметре DyNA Quant 200, Hoefer Pharmacia Biotech с использованием красителя Hoehst (Bisbenzimide H 33258). В качестве стандарта сравнения использовали раствор ДНК с известной концентрацией из клеточной линии Raji.

Результаты представлены на Фиг.5, из которых следует, что основу средства «HPM-7.0» составляют продукты деградации ДНК-фрагменты ДНК различной массы, имеющие размеры от тысяч до десятков пар нуклеотидов.

Полученное средство «HPM-7.0» представляет собой концентрат низкомолекулярных пептидных соединений и дефрагментированных ДНК гриба Fusarium sambucinum Fuckel var. Ossicola с диаметром не более чем от 1 до 50 нм.

Полученное таким образом средство «HPM-7.0» исследовали и испытывали на наличие биологической активности, данные о которой представлены ниже, и далее использовали для получения разнообразных лекарственных форм «HPM-7.0», включая такие формы как порошок и таблетки, гели, мази, спреи, ампулы, суппозитории и пр.

«HPM-7.0» - системное средство

Результаты проведенных исследований «HPM-7.0» (в частности, проведенных в НИИ детской гематологии МСРиЗ РФ Лаборатория молекулярной генетики, под руководством доктора медицинских наук, профессора Белохвостова А.С.) согласуются с концепцией системных средств принципиально нового вида. Одной из основ нового концептуального подхода является положение о нормализации системным средством функциональных многоуровневых связей различных систем и органов человеческого организма.

Системный препарат - препарат, восстанавливающий нарушение причинно-следственных связей в организме, возникающее под воздействием различных, в частности инфекционных, факторов (энтоэкологичная среда, радиация и т.п.), проявляющееся на фоне генетических предрасположенностей, приводящее к дисбалансу иммунно-гуморальной системы и дисрегуляции центральной нервной системы и сопровождающееся развитием стойких хронических заболеваний и преждевременным старением.

Установлено, что «HPM-7.0» обладает системным действием, по-видимому, за счет коррекции биопроцессов в организме человека на наноуровне, в частности, путем подавления дефектных и увеличения точности репликации существующих ДНК-последовательностей. Это позволяет использовать его для профилактики и лечения состояний и заболеваний, связанных с накоплением в клетках экстрахромосомной ДНК, с увеличением дефектных и снижением точности репликации существующих ДНК-последовательностей (Отчет ФГУ научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава «Изучение состава и биологических свойств средства «HPM-7.0» и его компонентов», 12.04.2005 г.).

Саморегуляция и самовосстановление организма

Разнообразие биологически активных соединений, обнаруженных в составе «HPM-7.0», и их содержание, по-видимому, определяет мультивалентность влияния средства на нейро-эндокринно-иммунные процессы. «HPM-7.0» восстанавливает ранее нарушенные процессы нейрогуморальной регуляции и компенсирует затраты энергетических ресурсов клетки. Сбалансированный комплекс аминокислот, витаминов и макроэлементов, содержащийся в средстве, способствует нормализации нарушенного гомеостаза и восстановлению компенсаторных механизмов организма.

Токсичность

Токсикологические исследования проводились в лаборатории лекарственной токсикологии института экспериментальной кардиологии РКПНК МЗ РФ, под руководством д.м.н., профессора Арзамасцева Е.В.

Заключение

Токсикологические исследования средства «HPM-7.0» показали, что исследуемый состав является нетоксичным и хорошо переносится при ежедневном длительном назначении кроликам готовых лекарственных форм «HPM-7.0».

В частности, результаты проведенных исследований показали, что 3-месячное сублингвальное применение средства «HPM-7.0» в высоких дозах (50 мг/кг таблетки для сублингвального применения и 30 мг/кг суппозитории для интравагинального или ректального применения) хорошо переносились животными и не влияли на гематологические показатели и функциональное состояние основных органов и систем организма подопытных животных (по показателям использованных гематологических и биохимических тестов). Длительное сублингвальное, интравагинальное и ректальное назначение изучаемых лекарственных форм не оказывало также и местного раздражающего действия. Макро- и микроскопические исследования внутренних органов животных, получавших сублингвально, интравагинально и ректально готовые лекарственные формы в испытанных дозах 50 и 30 мг/кг, не выявили каких-либо патологических изменений, связанных с токсическим действием средства «HPM-7.0».

Рекомендовано клиническое испытание указанных готовых лекарственных форм «HPM-7.0».

I. Определение эффекта «HPM-7.0» на процессы клеточного старения и кинетику пролиферации

Установлено также, что средство «HPM-7.0» увеличивает пролиферативную активность (активность деления) в клетках, контролирует клеточный цикл и запускает ускоренную систему апоптоза в дефектных клетках, что ведет к замедлению накопления мутаций.

Методы исследования

Для определения эффекта «HPM-7.0» на процессы клеточного старения и кинетику пролиферации было использовано долговременное культивирование генетически подверженных старению фибробластов MEF (эмбрионы инбредных мышей линии SAMP1).

Результаты представлены на Фиг.4.

Из Фиг.4 видно, что на стадии экспоненциальной пролиферации «HPM-7.0» в концентрации 0,03% приводит к значительному ускорению пролиферации клеток MEF, т.е. оказывает протективное действие против преждевременного старения этих клеток.

II. Исследование влияния средства «HPM-7.0» на ПЦР

Описание эксперимента

Для исследования влияния средства «HPM-7.0» на полимеразную цепную реакцию использовали двухэтапную схему анализа гена k-ras.

Первый этап в данной схеме - ПЦР гена k-ras с использованием праймеров, вносящих в ампликоны сайты рестрикции для рестриктазы BstN I на 5ґ- и 3ґ-концах ампликонов, а второй - обработка продуктов первого этапа указанной рестриктазой.

При наличии в исходной последовательности (матрице) мутаций в 12-м кодоне (1-й экзон) гена, рестриктаза расщепляет ампликон только по 3ґ-концу, образуя детектируемый фрагмент длиной 143 нуклеотида. В случае последовательности «дикого типа» рестриктаза расщепляет ампликон по 5ґ- и 3ґ-концам, образуя детектируемый фрагмент длиной 114 нуклеотидов.

В опыте использовали ДНК клеточной линии SW480 (рак толстой кишки человека), имеющей гомозиготную мутацию в 12-м кодоне гена k-ras.

Объем реакционной смеси - 25 мкл, испытуемую пробу добавляли в объеме 3 мкл.

На Фиг.6:

Дорожки 1-6 - добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) депротеинизированной фракции «HPM-7.0» без добавления ДНК клеточной линии SW480.

Дорожки 7-12 - добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) депротеинизированной фракции «HPM-7.0» с добавлением ДНК клеточной линии SW480.

Дорожки 13-18 - добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) «HPM-7.0» в разведениях 1:100, 1:500, 1:1000 с добавлением ДНК клеточной линии SW480.

Дорожки 19-20 - контроль проведения ПЦР. Добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) ДНК клеточной линии SW480 без добавления средств «HPM-7.0».

В результате эксперимента показано, что при добавлении «HPM-7.0» в разведениях от 1:100 до 1:1000 в реакционную смесь ПЦР увеличивалась амплификация фрагмента гена k-ras, по сравнению с контролем (без добавления «HPM-7.0»). При добавлении в реакционную смесь ПЦР депротеинизированной фракции «HPM-7.0» также наблюдали увеличение амплификации фрагмента гена k-ras по сравнению с контролем. Однако кроме специфического продукта наблюдали дополнительные (неспецифические) фракции. При добавлении депротеинизированной фракции «HPM-7.0» в разведении 1:10 количество неспецифических фракций было максимальным, тогда как при больших разведениях количество неспецифических фрагментов уменьшалось вплоть до их исчезновения при разведении 1:500.

Выводы

«HPM-7.0» корригирует биопроцессы в организме на наноуровне. Данные по усилению выхода ДНК из клеток под воздействием «HPM-7.0» позволяют предположительно связать с этим эффектом лечебное действие средства, что открывает новые области применения средств на основе «HPM-7.0».

В частности, это позволяет применять средство «HPM-7.0» для профилактики онкопроцесса и для подавления прогрессии злокачественных клеток при онкозаболеваниях, а также при преждевременном старении и пр.

III. Противовирусная и антибактериальная активность средства «HPM-7.0»

Исследованиями, проведенными в институте ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского и НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, доказано непрямое и прямое противовирусное, а также антибактериальное действие средства (применялись стандартные методики исследования, используемые при проведении исследований in vitro и in vivo, принятых в указанных специализированных НИИ) при инфекциях: ВИЧ, вирусном гепатите С, вирусе бешенства, желтой лихорадке, вирусе восточного энцефаломиелита лошадей (данный вирус по своим вирусоспецифическим свойствам сходен с вирусом, вызывающим клещевой энцефалит), герпетической (в том числе генитальной форме), цитомегаловирусной, папилломовирусной, гриппозной (в т.ч. вирус H5N1) инфекциях.

В частности, обнаружено, что противовирусное действие полученного средства «HPM-7.0» проявляется при ВИЧ (отчет ГУ НИИ вирусологии им. Д.Н.Ивановского «Исследование активности средства «HPM-7.0» в отношении вируса иммунодефицита», 12.01.2007 г.), вирусе бешенства (отчет ГУ НИИ вирусологии им. Д.Н.Ивановского «Об исследовании противовирусной активности средства «HPM-7.0» у мышей массой 12-14 г, зараженных внутримышечно уличным вирусом бешенства штамма «Як», 22.06.06 г.), желтой лихорадке (отчет ГУ НИИ вирусологии им. Д.Н. Ивановского «Изучение противовирусной активности средства «НРМ-7.0» при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом желтой лихорадки на мышах (штамм 17-D)», 22.06.06), а также вирусном гепатите С (отчет ГУ НИИ вирусологии им. Д.Н. Ивановского «Действие средства «HPM-7.0» на инфекционные свойства цитопатогенного варианта вируса гепатита С», 20.08.06 г.), герпетической инфекции, в том числе в генитальной форме (отчет ГУ НИИ вирусологии им. Д.Н.Ивановского «Исследование противовирусной эффективности средства «HPM-7.0» на модели экспериментальной герпесвирусной инфекции гениталий у самцов морских свинок», 17.06.2006 г.), гриппозной инфекции, включая вирус H5N1 (отчет ГУ НИИ вирусологии им. Д.Н.Ивановского «Действие средства «HPM-7.0» на инфекционные свойства высокопатогенного штамма гриппа А птиц (H5N1), 17.06.2006 г.), и других вирусных инфекций.

Результаты проведенных исследований позволили придти к следующим выводам:

1. Средство «HPM-7.0» дает возможность «охранным» системам организма обнаружить инфекционный агент в любой форме (активной или латентной), где бы тот не находился (вне- или внутриклеточно), добиваясь тем самым активации всей сложной цепочки реакций, направленных на ликвидацию инфекционного процесса в организме и выработку иммунитета к данному возбудителю.

2. Средство «HPM-7.0» непосредственно воздействует на возбудителя, либо разрушая его нуклеопротеид, либо снижая его патологическую активность (уничтожая пепломеры гемагглютинина и нейроаминидазы).

IV. Активность средства «HPM-7.0» по отношению к вирусу иммунодефицита человека

Актуальнейшей проблемой современной медицины является борьба с ВИЧ-инфекцией.

Несмотря на создание за короткий срок десятков новых средств, активных в отношении ВИЧ, сложная природа вируса позволяет ему различными способами адаптироваться к действию лекарств. Появляются резистентные штаммы вирусов, что требует увеличения доз средств, а также применения их комбинаций. Учитывая то, что большинство применяемых медикаментозных средств в разной степени токсичны для человека и часто вызывают побочные эффекты, актуальным остается поиск новых средств, менее токсичных и желательно активных в отношении разных вирусов одновременно.

Немаловажным моментом является цена и, соответственно, доступность средств для широких слоев населения.

К особенностям СПИДа относится то, что это, по-видимому, первый в истории медицины приобретенный иммунодефицит, связанный с конкретным возбудителем и характеризующийся эпидемическим распространением. Вторая его особенность - почти "прицельное" поражение Т-хелперов. Третья особенность - это первое эпидемическое заболевание человека, вызванное ретровирусами. В-четвертых, СПИД по клиническим и лабораторным особенностям не похож ни на какие другие приобретенные иммунодефициты.

Клетки, ткани и органы, которые поражает вирус иммунодефицита человека

Проникая в кровяное русло, вирус иммунодефицита человека инфицирует активированные CD4+ Т-лимфоциты, а также моноциты, макрофаги и родственные им клетки, экспрессирующие CD4-подобные молекулы. Инфицирование также возможно при фагоцитозе иммунных комплексов ВИЧ+Ат (антитело). Основной резервуар вируса иммунодефицита человека - это лимфоидная ткань. В центральной нервной системе поражаются клетки микроглии. Поражаются также клетки эпителия кишечника (в данном случае рецепторами для проникновения вируса иммунодефицита человека служат мембранные гликолипиды).

Средство «HPM-7.0» позволяет индуцировать клеточный и гуморальный иммунитет за счет увеличения цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), которые узнают презентированные антигены за счет восстановления функции белков основного комплекса гистосовместимости (MNS - major histocompatibility complex) и лизируют инфицированные клетки, даже если вирус находится в латентной форме. «HPM-7.0» способствует элиминации образования вируса за счет устранения клеток, продуцирующих вирус.

Средство «HPM-7.0» не позволяет вирусу приобретать свойства резистентности и эволюционировать.

Подтверждением сказанному являются две научно-исследовательские работы, проведенные в лаборатории вирусов иммунодефицита испытательного Центра по экспертной оценке противовирусных и дезинфекционных средств ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, под руководством доктора медицинских наук, профессора Носик Д.Н., результаты которых приведены далее.

1. Исследование активности средства «HPM-7.0» в отношении вируса иммунодефицита человека.

Материалы и методы

КЛЕТКИ. Использовали перевиваемые лимфобластоидные клетки человека МТ-4 из коллекции культур клеток человека ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (производства ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН) с 10% сыворотки эмбрионов коров (производства ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН), 100 мкг/мл гентамицина (Фармахим, Болгария).

ВИРУСЫ. В качестве источника вируса использовали штамм ВИЧ-1 BRU из коллекции штаммов вирусов иммунодефицита человека ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

СРЕДСТВА. Исследовали средство «HPM-7.0» в виде порошка, предоставленного фирмой «Дижа-фарм».

В качестве антиретровирусного референс-средства использовали средство Ретровир (азидотимидин) производства ГлаксоСмитКляйн (Бельгия).

Структура исследования: К клеткам добавляли (по различным схемам) исследуемое средство и инфицировали вирусом в дозе 0,05 ТЦИДSoI клетка. Инкубировали культуры клеток при 37°С в атмосфере с 5% CO₂ и 98% влажности 5-6 дней. Учет результатов проводили окрашиванием клеток с помощью окраски тетразолиевым красителем (метод МТТ) (Сигма, США), спектрофотометрией и методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих иммуноферментных наборов фирмы Биорад Органон Техника (Нидерланды).

Результаты исследования приведены далее в Таблицах 1-4. Полученные данные позволяют сделать вывод, что при лечебно-профилактической схеме применение средства «HPM-7.0» снижает уровень антигена вируса иммунодефицита человека в культуральной жидкости зараженных клеток человека, а также повышает их жизнеспособность.

Исследование цитотоксического действия средства

Таблица 1 Исследование цитотоксичности средства на модели лимфобластоидных клеток человека Концентрация HPM-7.0, мкг/мл Количество жизнеспособных клеток по сравнению с контролем клеток, % 0,5 60,6 1,0 52,3 5,0 44,7 10,0 40,5 15,0 15,6 25,0 4,3 50,0 0

Полученные данные (Таблица 1) показали что при концентрации 0,5-1,0 мкг/мл средства обнаружено 60,6-52,3% жизнеспособных клеток по сравнению с контролем интактных клеток, что свидетельствует о цитопротективной способности препарата «HPM-7.0» в дозе 0,5-1,0 мкг/мл.

Исследование противовирусного действия средства

Таблица 2 Исследование противовирусной активности средства «HPM-7.0» на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ-1 Условия опыта Жизнеспособные клетки, %^* Без вируса (токсичность) Внесение «НРМ-7.0» в клетки 2 ч до вируса Одновременно 2 ч после вируса Средство (фильтр 0,45µ) 1,0 мкг/мл 51,9 49,4 41,7 18,8 Средство (фильтр 0,22µ) 1,0 мкг/мл 58,9 42,2 37,0 24,7 Средство (фильтр 0,45µ) 5,0 мкг/мл 19,5 22,7 22,5 0 Средство (фильтр 0,22µ) 5,0 мкг/мл 0 0 0 0 ^*Процент жизнеспособных клеток по сравнению с контролем интактных клеток.

Дальнейшие исследования с фильтрацией препарата через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 и 0,22 микрон (Миллипор, США) показали наибольшую активность препарата при профилактическом применении в дозе 1,0 мкг/мл за 2 ч до инфицирования: 42,2-49,4% жизнеспособных клеток. Данные результаты свидетельствуют о профилактическом эффекте препарата в отношении вируса иммунодефицита.

Таблица 3 Исследование противовирусной активности средства «НРМ-7.0» на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ-1 - определение уровня антигена вируса методом иммуноферментного анализа Условия опыта Снижение антигена вируса, % Внесение «НРМ-7.0» в клетки 2 ч до вируса Одновременно 2 ч после вируса Средство (фильтр 0,45 µ) 1,0 мкг/мл 64,9 58,6 30,6 Средство (фильтр 0,22 µ) 1,0 мкг/мл 65,5 53, 6 19,4 Средство (фильтр 0,45 µ) 2,5 мкг/мл 71,8 61,9 44,8 Средство (фильтр 0,22 µ) 2,5 мкг/мл 78,2 68,6 39,7

Снижение уровня антигена вируса в культуральной жидкости зараженных клеток на 64,9-65,5% свидетельствует о лечебном эффекте препарата.

Таблица 4 Исследование противовирусной активности средства «HPM-7.0» (внесение средства в клетки за 48 ч до инфицирования) на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ-1 Условия опыта/концентрация, мкг/мл Без вируса (токсичность) Внесение в клетки вируса Жизнеспособность клеток, % Количество клеток × 10³/мл Жизнеспособность клеток, % Количество клеток × 10³/мл Защита клеток, % Контроль клеток 88,6 1000 - - - Контроль вируса - - 41,2 340 - Средство 1,0 72,3 800 67,7 750 62,1 Средство 2,5 60,4 620 54,6 590 42,4 Средство 5, 0 26,6 330 22,8 390 0 Средство 7,5 18,2 260 14,9 100 0

Введение препарата за 48 ч до инфицирования клеток обеспечивало защиту клеток при концентрации препарата 1,0 мкг/мл - 62,1%. Данные результаты свидетельствуют о профилактическом эффекте препарата в отношении вируса иммунодефицита.

2. Лечебное действие средства «HPM-7.0»

Исследование образцов материала, полученных от ВИЧ-инфицированных лиц

ВИЧ-инфицированные пациенты принимали средство «НРМ-7.0» после еды, сублигвально в течение периода времени от одного до нескольких месяцев в прогрессирующих дозах, варьирующих от 10 мкг × 2 раза в день до 20 мг × 6 раз в день. Прием средства «HPM-7.0» продолжали до лабораторного подтверждения полной элиминации ВИЧ и затем еще 2 месяца профилактического приема с ежемесячным лабораторным контролем.

Прием средства «HPM-7.0» сопровождали физическими нагрузками (велотренажер, беговая дорожка, бассейн и т.п.) и курсами средства, направленного на восстановление биоценоза кишечника (например, флорин форте).

Результаты исследований

А) Исследование образцов крови больной (шифр Я.И.Л.) методом полимеразной цепной реакции и иммунофлюоресценции.

Таблица 5 Образец ПЦР^*, количество РНК копий/мл Т4- лимфоциты/мм³ T8-лимфоциты/мм³ T-индекс ИФ^**, % №0 (05.10.06) - до приема средства 586000 215 512 0,6 н.и. №1 (05.12.06) 183000 508 424 1,2 н.и. №2 (20.12.06) 27000 282 353 0,8 н.и. №3 (17.01.07) 18000 297 297 1,0 н.и. №4 (06.02.07) 17000 348 312 1,1 12 №5 (26.02.07) 18000 452 339 1,3 14 №6 (12.03.07) 15000 521 520 1,0 12 №7 (26.03.07) 23000 578 448 1,3 7 №8 (09.04.07) 9000 489 406 1,2 5 ^* ПЦР - полимеразная цепная реакция (определение РНК ВИЧ); ^** ИФ - реакция непрямой иммунофлюоресценции, % клеток, экспрессирующих антиген ВИЧ; н.и. - не исследовали.

Таблица 6 Исследование образцов крови больной (шифр И.Т.Б.) методом полимеразной цепной реакции и иммунофлюоресценции Образец ПЦР^*, количество РНК копий/мл Т4-лимфоциты/мм³ T8-лимфоциты/мм³ Т-индекс ИФ^**, % №0 (05.10.06) - до приема средства 375000 361 458 0,55 н.и. №1 (05.12.06) 25 000 452 382 1,2 н.и. №2 (20.12.06) 22 000 424 472 0,9 н.и. №3 (17.01.07) 10 000 409 424 1.0 54 №4 (06.02.07) 4 400 480 405 1,2 28 №5 (26.02.07) 16 000 593 635 0,9 23 №6 (12.03.07) 10 000 607 537 1,1 16 №7 (26.03.07) 9 000 579 409 1,4 10 №8 (09.04.07) 3000 524 415 1,5 6 ^* ПЦР - полимеразная цепная реакция (определение РНК ВИЧ); ^** ИФ - реакция непрямой иммунофлюоресценции, % клеток, экспрессирующих антиген ВИЧ; н.и. - не исследовали.

Вышеприведенные данные позволяют сделать вывод, что применение средства «HPM-7.0» приводит к снижению уровня вирусной нагрузки (ПЦР, РНК вируса) с 375000 копий/мл до 9000 копий/мл у пациента с шифром И.Т.Б и с 586000 копий/мл до 3000 копий/мл у пациента с шифром Я.И.Л, что подтверждает высокую противовирусную активность действия «HPM-7.0». Помимо этого приведенные результаты подтверждают тот факт, что противовирусное действие препарата «HPM-7.0» затрагивает не только вирус ВИЧ, поразивший лимфоидные клетки, но и вирус ВИЧ, разместившийся в клетках-«резервуарах» других органов и систем организма (печень, почки, мышцы и т.д.).

Б) У больной под шифром Я.И.Л. с момента обнаружения ВИЧ-инфицирования (в ноябре 2006 г.) диагностировали объемное образование правой молочной железы. Данный диагноз после проведения игольной биопсии и маммографии верифицирован в рак. Специализированного противоопухолевого лечения кроме приема средства «HPM-7.0» не проводилось.

В результате за период с ноября 2006 г. по июнь 2007 г. наблюдалась четкая положительная динамика, в виде уменьшения объемного образования, с более четкими краями (см. Фиг.7-11).

V. Микробиоцинозный (профилактический) эффект средства «HPM-7.0»

Форма, дозы:

1. Суппозиторий - 200 мкг для вагинального или ректального применения,

2. Гель - 250 мкг для наружного применения.

Микробицид - вещество в виде геля, свечи или вагинальной таблетки, которое может защитить от ВИЧ и других инфекций, передающихся половым путем (вместо или в дополнение к презервативу). Микробицидный гель или свеча (суппозиторий) являются одним из средств защиты от инфекции для мужчин и женщин, которые при наружном нанесении или введении во влагалище препятствуют инфицированию, образуя пленку, которая выделяет вещества, уничтожающие болезнетворные вирусы и бактерии.

Созданный на основе средства «HPM-7.0» микробицид в виде суппозитория для ректального и вагинального применения является лечебно-профилактическим средством урогенитальных инфекций, передающихся половым путем.

Заключение

Данные проведенных исследований позволяют говорить о том, что средство «HPM-7.0», полученное из мицелия гриба Fusarium sambucinum Fuckel var. Ossicolum (Berk.et Curt) Bilai (ВКПМ F-165), обладает системным действием, по-видимому, обеспечивая снижение числа генетических мутаций и/или их предотвращение, за счет снятия «маскировки» с мутированной или видоизмененной клетки (например, клетки, пораженной вирусом или измененной радиационным воздействием и т.п.), что позволяет иммуннокомпетентной системе ликвидировать имеющуюся хроническую патологию.

Так как «HPM-7.0» является нетоксичным биологическим продуктом, его применение возможно для профилактики и лечения заболеваний, связанных с дисбалансом биопроцессов организма человека на наноуровне, в частности с накоплением в клетках организма генетически избыточной (экстрахромосомной) ДНК, и с увеличением дефектных и снижением точности репликации существующих ДНК-последовательностей, таких, например, как иммунодефицитные состояния, связанные, в частности, с вирусной и/или бактериальной инфекцией, различных стадий синдрома приобретенного иммунодефицита, онкопроцесса, процесса старения, у лиц разного возраста, с имеющейся различной сопутствующей патологией.

Предложено средство системного действия, полученное из мицелия гриба Fusarium sambucinum Fuckel var. Ossicolum (Berk. et. Curt) Bilai ВСБ 917 (ВКПМ F-165). Средство представляет собой концентрат низкомолекулярного пептидного соединения и дефрагментированных ДНК диаметром от 1 до 50 нм. Средство имеет следующий состав: минеральные элементы - от около 24% до около 26%, витамины - от около 0,8% до около 0,86%, липиды - от около 4,2% до около 7,6%, общий белок - от около 55% до около 57%, полисахариды - от около 9,6% до около 14,6%, вода - остальное. Кроме того, предложено применение средства системного действия для подавления дефектных и увеличения точности репликации существующих ДНК-последовательностей, а также его использование для приготовления фармкомпозиции. Также предложен способ подавления процесса накопления в клетках генетически избыточной ДНК, увеличения дефектных и снижения точности репликации существующих ДНК-последовательностей с использованием указанного средства. 5 н. и 15 з.п. ф-лы, 11 ил., 8 табл.

1. Средство, полученное из мицелия гриба Fusarium sambucinum Fuckel var. Ossicolum (Berk. et Curt) Bilai ВСБ 917 (ВКПМ F-165), представляющее собой концентрат низкомолекулярного пептидного соединения и дефрагментированных ДНК диаметром от 1 до 50 нм, обладающее системным действием и характеризующееся следующим составом:
Минеральные элементы: от около 24% до около 26%;
Витамины: от около 0,8% до около 0,86%;
Липиды: от около 4,2% до около 7,6%;
Общий белок: от около 55,0% до около 57,0%;
Полисахариды: от около 9,6% до около 14,6%;
Вода: остальное.

2. Применение средства по п.1 для подавления дефектных и увеличения точности репликации существующих ДНК-последовательностей.

3. Применение по п.2 для лечения и профилактики состояний и заболеваний, связанных с накоплением дефектных и снижением точности репликации существующих ДНК-последовательностей.

4. Применение по п.3, где указанные заболевания представляют собой результат вирусной инфекции.

5. Применение по п.3, где указанные заболевания выбраны из группы, включающей СПИД, бешенство, желтую лихорадку, восточный энцефаломиелит лошадей, герпесинфекцию, вирусный гепатит С и гриппозную инфекцию, включая H5N1.

6. Применение по п.3, где указанные заболевания выбраны из группы, включающей преждевременное старение, онкозаболевания.

7. Применение по п.3 в виде внутримышечных, внутривенных, вагинальных, ректальных, местных, пероральных лекарственных форм.

8. Применение мицелия гриба Fusarium sambucinum Fuckel var. Ossicolum для получения средства системного действия по п.1.

9. Фармацевтическая композиция для подавления дефектных и увеличения точности репликации существующих ДНК-последовательностей, включающая эффективное количество средства по п.1 и носитель и/или наполнитель.

10. Фармацевтическая композиция по п.9 для системной профилактики и лечения заболеваний, связанных с накоплением дефектных и снижением точности репликации существующих ДНК-последовательностей, включающая эффективное количество средства по п.1 и фармацевтически приемлемые добавки, носитель и/или наполнитель.

11. Фармацевтическая композиция по п.10, где указанные заболевания представляют собой результат вирусной инфекции.

12. Фармацевтическая композиция по п.11, где указанные заболевания выбраны из группы, включающей СПИД, бешенство, желтую лихорадку, восточный энцефаломиелит лошадей, герпесинфекцию, вирусный гепатит С и гриппозную инфекцию, включая H5N1.

13. Фармацевтическая композиция по п.10, где указанные заболевания выбраны из группы, включающей преждевременное старение, онкозаболевания.

14. Фармацевтическая композиция по п.10 в виде лекарственных форм для внутреннего или наружного применения, выбранных из внутримышечных, внутривенных, вагинальных, ректальных, местных, оральных и пероральных форм.

15. Способ подавления (ингибирования) процесса накопления в клетках генетически избыточной (экстрахромосомной) ДНК, увеличения дефектных и снижения точности репликации существующих ДНК-последовательностей, заключающийся в применении средства по пп.1-3, в количестве, эффективном для подавления дефектных и увеличения точности репликации существующих ДНК-последовательностей.

16. Способ по п.15 для системной профилактики и лечения заболеваний, связанных с накоплением дефектных и снижением точности репликации существующих ДНК-последовательностей.

17. Способ по п.16, где указанные заболевания представляют собой результат вирусной инфекции.

18. Способ по п.17, где указанные заболевания выбраны из группы, включающей СПИД, бешенство, желтую лихорадку, восточный энцефаломиелит лошадей, герпесинфекцию, вирусный гепатит С и гриппозную инфекцию, включая H5N1.

19. Способ по п.15, где указанные заболевания выбраны из группы, включающей преждевременное старение, онкозаболевания.

20. Способ профилактики и лечения по пп.16-19, включающий применение фармкомпозиции по пп.10-15.