ЛИЗИНИЙ 3-МЕТИЛ-1,2,4-ТРИАЗОЛИЛ-5-ТИОАЦЕТАТ, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ НЕЙРОПРОТЕКТИВНОЕ, НООТРОПНОЕ, КАРДИОПРОТЕКТИВНОЕ, ЭНДОТЕЛИОТРОПНОЕ, ПРОТИВОИШЕМИЧЕСКОЕ, АНТИОКСИДАНТНОЕ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЕ И ПРОТИВОГИПОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ, ОБЛАДАЮЩИЙ НИЗКОЙ ТОКСИЧНОСТЬЮ Российский патент 2009 года по МПК C07D249/12 A61K31/41 

Изобретение относится к медицине и фармации, в частности к новым биологически активным соединениям, являющимся основой для создания лекарственных препаратов с широким спектром биологической активности, для лечения заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), в том числе острых нарушений мозгового кровообращения и других заболеваний.

Сосудистые и дегенеративные заболевания головного мозга сопровождаются ишемическим повреждением нервной ткани и ведут не только к тяжелым неврологическим расстройствам, таким как нарушение когнитивных, моторных, вербальных и других функций ЦНС, но и к ухудшению работы сердца, повреждению сосудистого эндотелия. Ежегодно в мире переносят инсульт около 6 млн. человек. Наблюдается увеличение частоты инсульта у лиц трудоспособного возраста. Согласно международным эпидемиологическим исследованиям в мире от инсульта ежегодно умирает 4,7 млн человек. В большинстве стран мира инсульт занимает 2-3 место в структуре общей смертности населения, а в Украине - 2 место, уступая лишь кардиоваскулярной патологии. Сосудистые и дегенеративные заболевания ЦНС занимают первое место, как причина стойкой утраты трудоспособности. При ишемическом поражении мозга, в результате снижения мозгового кровотока, происходит нарушение функций дыхательной цепи митохондрий и энергетического обмена, глутаматная «эксайтотоксичность», нарушение йонного гомеостаза клетки, с повышением внутриклеточного содержания йонов кальция, лактат-ацидозом; активацией внутриклеточных ферментов, с повышением синтеза NO; развитием оксидативного стресса; экспрессией генов; аноксической деполяризацией мембран и смертью клетки и острой сердечной недостаточности, что создает энергетический дефицит миокарда, развитие оксидативного стресса, активацию противовоспалительных цитокинов и формирование локального воспалительного очага. В комплексном лечении этой патологии применяют блокаторы кальциевых каналов, антиоксиданты, антигипоксанты, противовоспалительные средства и ноотропы.

Известно лекарственное средство пирацетам (Лекарственные препараты Украины. - К., 2000, т.2. - С.303-306). Пирацетам обладает ноотропным, нейропротективным, противоишемическим и противовоспалительным действиями. По результатам исследования пирацетама на модели мозгового инсульта установлено, что пирацетам способствует снижению повреждения мембран нейронов по снижению гиперферментемии нейроспецифического изоэнзима креатинфосфокиназы (ВВ-КФК), улучшению процессов памяти по сохранности УРПИ (условная реакция пассивного избегания), уменьшению смертности. Однако он не оказывает антиоксидантного действия и не эффективен в острый период заболевания. Известно лекарственное средство индометацин (Справочник Видаль, лекарственные препараты в России. - М.: «Астрафарм Сервис», 1995. - С.475-476). Индометацин является одним из наиболее эффективных нестероидных противовоспалительных средств и его применяют при лечении болезней ЦНС. Однако при заболеваниях нейродегенеративной природы он неэффективен. Кроме того, индометацин токсичен и вызывает головные боли, головокружение, диспепсию, сонливость, поражение слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и кровотечения. Известно применение изоптина в качестве блокатора кальциевых каналов и антиангинального средства (Машковский М.Д. Справочник лекарственных средств. - М.: Медицина, 2005. - С.427). Недостатком изоптина является узкий спектр биологической активности и отсутствие нейропротективного эффекта. Известно биологически активное соединение «Морфолиний 3-метил-1,2,4-триозолил-5-тиоацетат», проявляющий гепатозащитную, ранозаживляющую и противовоспалительную активность. Патент Украины №1988, кл. C07D 413/12, A61K 31/41. Лекарственные препараты с использованием этого соединения зарегистрированы Министерством здравоохранения Украины 31 мая 1994 г. (приказ №85, регистрационный №94/85), с названием «Тиотриазолин». По результатам клинических исследований установлено, что тиотриазолин, кроме указанных свойств, обладает антиоксидантной, кардиопротекторной, противоишемической, мембраностабилизирующей, иммуностабилизирующей, холатостимулирующей и другими формами активности. Однако тиотриазолин более предпочтителен в восстановительный период заболевания ЦНС, и он не обладает позитивным действием в отношении эндотелиоцитов мозговых сосудов. По химическому строению тиотриазолин принимаем в качестве структурного аналога. В основу изобретения поставлена задача создания нового биологически активного соединения, обеспечивающего при его использовании в лекарственных формах в качестве их активной основы максимальный эффект этих форм при лечении сосудистых и дегенеративных патологий ЦНС.

Решение поставленной задачи обеспечивает новое биологически активное соединение D,L-лизиний 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетат (М-1) следующей формулы:

проявляющее нейропротективное, ноотропное, кардиопротективное, эндотелиотропное, противоишемическое, антиоксидантное, противовоспалительное и противогипоксическое действия и обладающее низкой токсичностью.

Заявленное соединение отличается от структурного аналога тем, что вместо морфолина в нем используется лизин.

Фармакологический эффект от использования изобретения.

Заявленное соединение имеет более широкий спектр биологического действия в сравнении со структурным аналогом и исключает его недостаток, указанный выше.

В сравнении с референтными препаратами и структурным аналогом соединение и лекарственные формы на его основе нетоксичны. Назначение М-1 при остром нарушении мозгового кровообращения (ОНМК) приводит к уменьшению гибели нейронов и эндотелиоцитов капилляров коры головного мозга, улучшению энергообмена мозга, торможению свободнорадикального окисления (СРО), снижению маркеров повреждения нейронов, улучшению памяти.

При лечении инфаркта миокарда использование М-1 приводит к уменьшению зоны некроза миокарда, снижению маркеров повреждения кардиоцитов, улучшению показателей ЭКГ, уменьшению воспалительных процессов и снижению смертности в условиях гипоксии.

Применение М-1 по силе терапевтического эффекта превосходит эффективность референтных препаратов пирацетама, индометацина, изоптина и структурного аналога - тиотриазолина.

Сущность изобретения поясняется нижеприведенным описанием и примерами доклинических исследований на моделях ОНМК, острого инфаркта миокарда, воспаления и гипоксии. Результаты этих исследований приведены в таблицах.

Острую токсичность М-1 изучали при внутрибрюшинном введении крысам линии Вистар массой 140-160 г (Коваленко В.М., Стефанов А.В., Максимов Ю.М. Методичнi рекомендацiï по експериментальному вивченню токсичноi дiï потенцiйних лiкарських засобiв. - Киïв, 2000. - 26 с.), которое показало, что показатель токсичности соединения - ЛД₅₀ составляет 2240 мг/кг.

Пример 1. Синтез лизиния 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетата (М-1).

К 88,2 г (0,50 М) 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетата прибавляют раствор 76,8 г (0,526 М) L-лизина или DL-лизина в 40 мл воды и 125 мл этанола. Реакционную смесь кипятят час, прибавляют 75-100 мл этанола, охлаждают. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают 20-30 мл холодного этанола и сушат. Выход 150,7-153,0 г (94,4-95,8%) целевого продукта. Белый кристаллический порошок с Т.пл. 202-206°С (из водного этанола), легко растворимый в воде, растворим в этаноле, не растворим в эфире и хлороформе.

Найдено, %: C 41,2; H 6,7; N 21,9; S 10,0.

C₁₁H_2lN₅SO₄

Вычислено, %: C 41,4; H 6,6; N 21,9; S 10,0.

ИК-спектр, см^-1: 3429, 3130(√ NH); 1608(√ COO^-); 1541 (√ C=N); 1393 (сим COO^-).

Пример 2. Нейропротективная активность.

Нейропротективную, антиоксидантную, противоишемическую, ноотропную и эндотелитронную активность М-1 изучали (Стефанов А.В. Доклиническое изучение лекарственных средств. - Киев: Авицена, 2002. - 350 с.) на модели острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) у крыс линии Вистар массой 200-230 г (по 10 штук в каждой группе), которое вызывали двухсторонней перевязкой общих сонных артерий. О данных видах активности судили по снижению продукта свободнорадикального окисления (СРО) - малонового диальдегида (МДА) в головном мозге (по реакции с тиобарбитуровой кислотой); повышению макроэргического продукта - аденозинтрифосфата (АТФ) в головном мозге (хроматоспектрофотометрически); по повышению плотности нейронов и эндотелиоцитов (показатель выживаемости клеток) в коре головного мозга (изображение получали на микроскопе Axioskop (Zeiss, Germany) и с помощью 8-битной CCD-камеры COHU-4922 (COHU Inc., США) вводили в компьютерную систему анализа изображений VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Germany), морфометрический анализ клеток мозга и эндотелия осуществляли в автоматическом режиме с помощью макропрограммы, разработанной в специализированной среде программирования VIDAS-2,5 (Kontron Elektronik, Germany); no снижению активности церебрального изоинзима креатинфосфокиназы (ВВ-КФК) - маркера повреждения нейронов; по длительности УРПИ (условной реакции пассивного избегания). Препараты вводили внутрибрюшинно раз в сутки в течение всего срока наблюдения (4 суток) - М-1 50 мг/кг, пирацетам 500 мг/кг, тиотриазолин 50 мг/кг. Моделирование ОНМК у крыс приводило к активации СРО, о чем свидетельствовало повышение МДА; нарушению энергетического обмена, о чем свидетельствовало снижение АТФ; нарушению памяти, что выражалось в снижении латентного периода УРПИ; повышению гибели нейронов, о чем свидетельствовало снижение их плотности в коре мозга; повышению активности ВВ-КФК в плазме крови, повышению гибели эндотелиоцитов капилляров коры мозга, о чем свидетельствовало снижение их плотности. Как видно из табл.1, М-1 снижал образование МДА на 49% (препараты сравнения тиотриазолин и пирацетам на 39 и 29% соответственно), повышал латентное время УРПИ на 250% (тиотриазолин и пирацетам на 157 и 62%, соответственно) и увеличивал плотность нейронов и эндотелиоцитов на 26,7 и 38% соответственно (тиотриазолин на 11,5 и 14%, а пирацетам не оказывал действие), снижал активность ВВ-КФК на 55% (тиотриазолин и пирацетам на 46 и 26% соответственно). Таким образом, соединение М-1 по означенным видам активности превосходил базовый препарат терапии ОНМК - пирацетам и свой структурный аналог - тиотриазолин.

Таблица 1
Влияние соединения М-1 и препаратов сравнения - тиотриазолина и пирацетама на показатели энергетического обмена, активности СРО, активности ВВ-КФК, выживаемости нейронов и эндотелиоцитов в мозге и крови и латентного периода УРПИ крыс с ОНМК Группа крыс АТФ, мкм/г МДА, мкм/г Плотность нейронов Плотность эндотелиоцитов ВВ-КФК, ммол/л/ч УРПИ, с Интактные
(п=10) 2,23±0,04 0,56±0,01 1352±43 1877±67 0,040±0,001 112,6 ±0,47 ОНМК (п=10) 1,0±0,02 1,37±0,06 1070±11 1078±32 0,130±0,001 21,4±0,72 М-1 (п=10) 1,82±0,02*¹ (+82%) 0,70±0,01*¹ (-49%) 1357±10*¹ (+26,8%) 1489±34*¹ (+38%) 0,05 8±0,001*¹ (-55%) 70,5±2,33*¹ (250%) Тиотриазолин (п=10) 1,62±0,02* (+62%) 0,83±0,01* (-39%) 1193±21* (+11,5%) 1233±33*¹ (+14%) 0,070±0,002* (-46%) 54,3±1,17*¹ (157%) Пирацетам (п=10) 1,47±0,02* (+47%) 0,97±0,02* (-29%) 1087±34 (+1,5%) 1024±44 0,097±0,002* (-26%) 34,3±1,00* (62%) * - p<0,05 по отношению к контролю;
1 - p<0,05 по отношению к пирацетаму;
+ - p<0,05 по отношению к тиотриазолину.

Пример 3. Кардиопротективная активность.

Кардиопротективную активность М-1 изучали на модели острого инфаркта миокарда у крыс. Инфаркт миокарда (ИМ), воспроизводимый с помощью питуитрина и изадрина (которые вводились по схеме: питуитрин - 0,5 Ед/кг - внутрибрюшинно, через 20 минут изадрин - 100 мг/кг - подкожно, спустя 6 часов инъекция изадрина повторялась, и через 24 часа вводились оба агента в тех же дозах). Данная модель воспроизводит распространенный мелкоочаговый инфаркт миокарда. На этой экспериментальной модели (по 10 животных в каждой группе) препараты вводились внутрибрюшинно: М-1 в дозе 50 мг/кг, тиотриазолин - 50 мг/кг, изоптин - 10 мг/кг. Оценка степени ишемического повреждения миокарда и кардиопротективного действия препаратов осуществлялась с использованием современных электрокардиографических биохимических и морфометрических методов исследования. В качестве биохимических критериев использовались - уровень активности кардиоспецифического изоинзима креатинфосфокиназы (МВ-КФК), выделяемых из сыворотки крови методом колоночной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе А-50, с последующим определением активности ферментов в элюате. В качестве электрокардиографического критерия эффективности противоишемического действия препарата использовался метод ЭКГ картирования, с расчетом показателей суммарной степени смещения сегмента ST относительно изолинии (Σ_Δ ST). Этот принцип был использован в экспериментах на крысах после наложения 21 грудного электрода, с параллельной регистрацией ЭКГ в 3-х стандартных отведениях и расчетом показателя Σ_Δ ST. Также проводилась морфометрия очагов ишемии, с расчетом суммарной площади поражения от общей площади срезов сердца, выраженной в процентах. Изображение миокарда получали на микроскопе Axioskop (Zeiss, Germany) и с помощью 8-битной CCD-камеры COHU-4922 (COHU Inc., США) вводили в компьютерную систему анализа изображений VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Germany). Морфометрический анализ кардиоцитов осуществляли в автоматическом режиме с помощью макропрограммы, разработанной в специализированной среде программирования VIDAS-2,5 (Kontron Elektronik, Germany).

Таблица 2
Влияние М-1 и препаратов сравнения на площадь некроза, активность кардиоспецифического изоэнзина креатинфосфокиназы (МВ-КФК) и показателей суммарной степени смещения сегмента ST у крыс с ИМ Группа животных Площадь некроза, % МВ-КФК, ммол/л/ч Σ_Δ ST, мВ Интактная 0 0,05±0,001   Инфаркт (контроль) 21,9±1,6 0,17±0,01 216±24 Инфаркт + М-1 10,0±0,6*¹ 0,068±0,001*¹ 50±21   (-54,5%) (-60,0%) (-77,7%) Инфаркт + тиотриазолин 12,3±0,5* 0,09±0,001* 73±20* (-42,0) (-47,0%) (-66,1%) Инфаркт + изонтин 14,6±0,5* 0,09±0,001* 73±12* (-33,6%) (-47,0%) (-66,1%)

Как видно из данных, представленных в табл.2, препарат М-1, вводимый крысам в дозе 50 мг/кг параллельно формированию ИМ, оказывает выраженное кардиопротективное действие. Так, введение М-1 уменьшило: зону некроза миокарда на 54,5%, электрофизиологические проявления ишемии - суммарной степени смещения сегмента ST на 77,7% и активность маркерного фермента МВ-КФК на 60%. Оценивая фармакологические эффекты М-1 и препаратов сравнения на модели ИМ, можно сделать вывод о более высокой эффективности М-1, как кардиопротекторного средства по сравнению с тиотриазолином и изоптином.

Пример 4. Противовоспалительная активность.

Противовоспалительную активность М-1 определяли на модели формалинового отека лапки у крыс линии Вистар массой 220-250 г (по 6 в каждой группе). Животным М-1 и препарат сравнения (индометацин) вводили в дозе 50 мг/кг за 30 мин до введения формалина. Контрольная группа крыс оставалась без лечения. О наличии противовоспалительного эффекта судили по снижению отека лапки крысы, который измеряли в мл.

Таблица 3
Противовоспалительная активность индометацина и М-1 при формалиновом отеке Группа животных Объем отека (мл) через 3 ч Объем отека (мл) через 6 ч Объем отека (мл) через 12 ч Контроль 0,60±0,01 0,54±0,02 0,110±0,02 М-1 (50 мг/кг) 0,44±0,02* 0,37±0,01* 0,12±0,01* (-26,7%) (-32%) (-37%) Индометацин (50 мг/кг) 0,49±0,01 0,40±0,02 0,14±0,02* (-16,7%) (-26%) (-26%) Примечание: * - p<0,05 по отношению к контролю.

Как видно из представленных данных в табл.3, соединение М-1 проявляет достоверный противовоспалительный эффект, уменьшая выраженность отека лапки крыс, вызванного формалином. Необходимо отметить, что достоверный фармакологический эффект при назначении М-1 регистрируется на 3 часу эксперимента и на 10% превосходит противовоспалительное действие индометацина. Подобное действие М-1, превосходящее по эффективости индометацин, сохраняется на протяжении 12 часов наблюдения.

Пример 5. Противогипоксическая активность.

Противогипоксическую активность М-1 изучали на модели гипоксии замкнутого пространства, в герметической камере объемом 500 см³, по времени жизни крыс. Соединение М-1 вводили за 30 мин до эксперимента в дозах 25,0; 50,0; 100,0; 250,0 мг/кг внутрибрюшинно. Эталонный препарат сравнения - пирацетам в дозе 500 мг/кг внутрибрюшинно, а тиотриазолин в дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно за 30 мин до эксперимента.

Таблица 4
Противогипоксическая активность М-1 и препаратов сравнения в условиях гипоксии замкнутого пространства Группа животных Количество животных Время жизни, мин Контроль 6 7,23±0,68 М-1 (25 мг/кг) 6 12,34±1,22*¹ (+78%) М-1 (50 мг/кг) 6 18,33±2,07*¹ (+150%) М-1 (100 мг/кг) 6 15,43±2,11* (+114%) M-1 (250 мг/кг) 6 11,33±1,44 (+57%) Пирацетам (500 мг/кг) 6 10,22±1,87* (+41,6%) Тиотриазолин (50 мг/кг) 6 12,88±2,12*^l (+78%) Примечание: * - p<0,05 по отношению к контролю;
1 - p<0,05 по отношению к препарату сравнения.

В результате проведенных исследований противогипоксического действия соединения M-1 было установлено, что данное соединение обладает выраженной дозозависимой противогипоксической активностью, в условиях гипоксии замкнутого пространства. Наиболее выраженное противогипоксическое действие M-1 наблюдалось при введении его в дозе 50 мг/кг (увеличивал время жизни на 150%). Пирацетам и тиотриазолин оказывали менее выраженное действие (повышали этот показатель на 41 и 78% соответственно).

Таким образом, представленные в описании результаты исследования являются экспериментальным обоснованием для создания на основе соединения M-1 (лизиний 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетат) нового малотоксичного лекарственного средства нейропротективного, ноотропного, кардипротективного, эндотелиотропного, противоишемического, антиоксидантного, противовоспалительного и противогипоксического действия в виде таблеток, капсул, инъекционного раствора и сиропа.

Описывается новое биологически активное соединение - лизиний 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетат, являющийся основой для создания лекарственных препаратов с широким спектром биологической активности, для лечения заболеваний центральной нервной системы, в том числе острых нарушений мозгового кровообращения, а также сердечной недостаточности. 4 табл.

Лизиний 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетат формулы,

проявляющий нейропротективное, кардиопротективное, эндотелиотропное, противоишемическое, антиоксидантное, противовоспалительное, противогипоксическое и ноотропное действия, обладающий низкой токсичностью.