СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАМОРОЖЕННОЙ КОНЦЕНТРИРОВАННОЙ ЗАКВАСКИ НА ОСНОВЕ СИМБИОЗА ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2009 года по МПК A23C9/12 

Предлагаемое изобретение относится к микробиологической промышленности, биотехнологии и может быть использовано для приготовления кисломолочных продуктов, а также биологически активных добавок к пище на основе биомассы пробиотических микроорганизмов.

Известно, что получение биопрепаратов является одним из сложных направлений в биотехнологии. Наиболее перспективным в технологическом и экономическом отношении является использование концентрированных препаратов, полученных на питательных средах, которые дают возможность получения культур с заданными свойствами. Использование замороженных концентрированных заквасок позволяет увеличить объем продукции, упростить технологический процесс, сократить его продолжительность и повысить санитарно-гигиенические показатели готового продукта.

Известен способ получения бактериального концентрата бифидобактерий для производства кисломолочных продуктов, предусматривающий приготовление питательной среды на основе осветленной молочной сыворотки и ростовых компонентов, внесение инокулята бифидобактерий, культивирование, отделение полученной биомассы, смешивание с защитной средой, замораживание [SU №1686718 А1, МКИ А23С 9/12, опубл. 20.10.1993 г.].

Недостатком данного способа является длительное культивирование бифидобактерий, которое составляет (32-40) ч, при этом количество микроорганизмов в готовой закваске достигает всего 10^8-9 КОЕ/см³.

Наиболее близким способом к заявляемому изобретению по совокупности признаков является способ получения бактериального концентрата пропионово-кислых бактерий, предусматривающий приготовление питательной среды на основе осветленной молочной сыворотки и ростовых компонентов, с добавлением хлористого кобальта для увеличения витаминобразующей способности пропионово-кислых бактерий, внесение активизированной β-галактозидазой культуры пропионово-кислых бактерий Propionibacterium shermanii штамм МГУ, наращивание клеток, отделение полученной биомассы, смешивание с защитной средой, замораживание [RU №2309982 С2, С12N 1/20, А23С 9/12, С12R 1/15, опубл. 10.11.2007 г. Бюл. №31].

Однако использование монокультур пробиотических микроорганизмов снижает биотехнологические и пробиотические свойства концентрата.

Задачей настоящего изобретения является создание концентрированной закваски на основе симбиоза бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий с выраженными биотехнологическими и пробиотическими свойствами. Концентрированная закваска может использоваться для разработки новых препаратов-пробиотиков, рекомендуемых для эффективной профилактики нарушения микробиоценоза желудочно-кишечного тракта и предупреждения развития дисбактериозов различной этиологии.

Создание симбиоза пробиотических микроорганизмов связано прежде всего с рядом его несомненных преимуществ в сравнении с монокультурами. Симбиоз культур имеет более широкий спектр трансформируемых веществ и более технологичен в практическом использовании.

Технический результат, обеспечиваемый при осуществлении предлагаемого изобретения, заключается в повышении пробиотических свойств концентрированной закваски, увеличении количества клеток бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий и обеспечении высокой активности ферментации молока.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в способе приготовления концентрированной закваски, включающем приготовление питательной среды, внесение инокулята в количестве (3-5) %, наращивание клеток, отделение бактериальной массы от культуральной среды, смешивание ее с защитной средой, розлив и замораживание, согласно изобретению в качестве инокулята для заквашивания питательной среды используют комбинированную закваску, состоящую из отдельно активизированных культур бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий, при этом хлористый кобальт вводят в количестве (0,1-0,2) мг/мл.

Отличительными признаками заявляемого способа являются новые условия культивирования инокулята, а именно использование в качестве инокулята комбинированной закваски, состоящей из отдельно активизированных β-галактозидазой культур бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий, позволяющие реализовать в максимальной степени физиолого-биохимический и технологический потенциал микроорганизмов.

Для осуществления заявляемого способа получения концентрированной закваски были проведены экспериментальные исследования, в ходе которых подобраны оптимальные температурные условия для сбалансированного развития микрофлоры комбинированной закваски, выбрано соотношение культур и определены условия для накопления биомассы с высоким титром пробиотических бактерий.

Авторами исследовано влияние разных температурных параметров ферментации на скорости роста бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий. Результаты эксперимента представлены на фиг.1. Анализ данных фиг.1 показал, что изменение оптимальных температур культивирования бактерий приводит к снижению их скорости роста. Тогда как при промежуточной температуре 34°С наблюдается равномерное развитие микроорганизмов, значения средней удельной скорости роста бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий при данной температуре приближаются. В связи с этим для совместного культивирования пробиотических микроорганизмов выбран температурный режим ферментации (34±1)°С.

Выбор оптимального соотношения микроорганизмов в комбинированной закваске проводили с учетом биотехнологических свойств исследуемых культур и их ассоциаций. Полученные данные отражены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, все исследуемые ассоциации микроорганизмов обладают хорошими органолептическими и биотехнологическими свойствами. При совместном культивировании пропионово-кислых и бифидобактерий количество жизнеспособных клеток составляет на порядок выше, чем у отдельных культур, содержание ЛЖК и витамина В₁₂ увеличивается, что свидетельствует о симбиотических взаимоотношениях микроорганизмов. В результате эксперимента также установлено, что наиболее вязкой консистенцией и наибольшей влагоудерживающей способностью обладает образец с соотношением культур 1:2, но при этом наблюдается более кислый вкус, что объясняется высоким содержанием летучих жирных кислот, более интенсивное формирование сгустка, составляющее 6 ч.

Варианты соотношения культур бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий 2:1, 3:1 в комбинированной закваске имеют хорошие органолептические показатели, содержат несколько меньшее количество ЛЖК, СО₂ и большую продолжительность сквашивания молока (7,0-7,5) ч. Это объясняется тем, что в заквасках преобладает культура бифидобактерий, которая характеризуется более длительной продолжительностью ферментации молока по сравнению с пропионово-кислыми бактериями при температуре культивирования 34°С.

Данные по изучению накопления витамина B₁₂ микрофлорой заквасок свидетельствуют, что пропионово-кислые бактерии синтезируют значительное количество витамина B₁₂ и его содержание в закваске составляет 38 мкг/мл. Установлено, что в комбинированных заквасках количество витамина B₁₂ повышается. Это возможно объяснить благотворным влиянием метаболитов, выделяемых бифидобактериями в логарифмической фазе роста - аминокислот, витаминов, пептидов на синтез витамина B₁₂. Известно, что наиболее стимулирующим действием на синтез кобаламина оказывают аминокислоты, особенно аргинин и гистидин.

Наибольшее количество витамина B₁₂ обнаружено в комбинированной закваске при соотношении бифидо- и пропионово-кислых бактерий 1:2, которое составляет 53 мкг/мл.

Уменьшение дозы пропионово-кислых бактерий в комбинированных заквасках способствует пропорциональному понижению витамина В₁₂.

Таким образом, оптимальное сочетание в комбинированной закваске бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий 1:1 выбрано с учетом сбалансированного содержания жизнеспособных клеток данных культур и по органолептическим свойствам полученной комбинированной закваски. Данная закваска более приятная на вкус, также она обладает умеренной кислотностью 68°Т, приемлемой продолжительностью ферментации молока 6,5 ч, высоким содержанием летучих жирных кислот, витамина В₁₂ и хорошими реологическими показателями.

Следующий этап исследований посвящен изучению пробиотических свойств полученной комбинированной закваски.

Механизм действия пропионово-кислых и бифидобактерий является многофакторным. Метаболиты бактериальных клеток оказывают на макроорганизм положительное воздействие комплексом образуемых ими биологически активных веществ. Наиболее важными из них являются антимутагенные и антимикробные вещества.

Данные таблицы 2 свидетельствуют, что синтез антимикробных субстанций и антимутагенных веществ пробиотическими бактериями усиливается при симбиотических взаимоотношениях.

Из литературных источников известно, что экзополисахариды (ЭПС) не только улучшают реологические свойства кисломолочных продуктов, но также выступают в роли факторов, способствующих адгезии полезных микроорганизмов на стенках кишечника. Поэтому в дальнейших исследованиях изучали биосинтез ЭПС пропионово-кислыми, бифидобактериями и их ассоциацией. Полученные результаты представлены на фиг.2.

Следует отметить более высокий синтез ЭПС у пропионово-кислых бактерий, но при совместном культивировании с бифидобактериями количество экзополисахаридов уменьшается. Известно, что избыток источника углерода в среде оказывает стимулирующий эффект на выход ЭПС. В процессе ферментации основные метаболические функции клеток подвергаются сложной системе регуляции, контролирующей усвояемость лактозы - основного источника углерода и энергии для бактерий. Различия физиологии пропионово-кислых и бифидобактерий, проявляющихся при отдельном и совместном культивировании при метаболизме лактозы, могут объяснить разный выход экзополисахаридов. Кроме того, из литературных источников известно, что экзополисахариды обладают бифидогенными свойствами. Вероятно ЭПС, синтезируемые пропионово-кислыми бактериями, стимулируют рост бифидобактерий, о чем свидетельствует высокое количество жизнеспособных клеток бифидобактерий в комбинированной закваске.

В результате проведенных исследований установлено, что при совместном культивировании микроорганизмов повышаются антимутагенные свойства и усиливается антимикробная активность комбинированной закваски. Экзополисахариды, образуемые бактериями, усиливают пробиотический эффект комбинированной закваски.

Далее исследования авторов были направлены на создание концентрированной закваски бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий для прямого внесения в молоко.

Анализ технологии получения концентрированных заквасок показал, что наиболее важное значение имеет этап накопления биомассы микроорганизмов, эффективность которого в большей степени зависит от условий культивирования и активности посевного материала.

В связи с этим на первом этапе изучена биохимическая активность комбинированной закваски пропионово-кислых и бифидобактерий. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 Качественная характеристика инокулята Показатели Характеристика Активность сквашивания, ч 14-16 Кислотность:   титруемая, °Т 73±2 активная, рН 4,63-4,58 Количество жизнеспособных клеток, КОЕ/см³   бифидобактерий 4·10¹⁰ пропионово-кислых бактерий 5·10¹⁰ Объем продукта (см³), в котором не допускаются:   БГКП (колиформы) 10 S. aureus 10 Патогенные микроорганизмы (в т.ч. сальмонеллы) 100 Дрожжи, КОЕ/см³, не более 5 Плесени, КОЕ/см³, не более 5

Как видно из полученных данных, комбинированная закваска обладает достаточно высокой ферментативной активностью, умеренной кислотностью и высоким содержанием жизнеспособных клеток заквасочных культур.

Пропионово-кислые бактерии являются активными продуцентами витамина В₁₂. Известно, что кобальт повышает витаминсинтезирующую способность пропионово-кислых бактерий, однако, его содержание в естественных средах минимально, поэтому в состав питательной среды был включен хлористый кобальт.

Авторами изучено влияние ионов кобальта на выход биомассы и на синтез витамина В₁₂. Процесс ферментации контролировали по оптической плотности биомассы и количеству жизнеспособных клеток, подсчитанных в конце процесса ферментации. По данным показателям находили среднюю удельную скорость роста бактерий. Хлористый кобальт вносили в количестве 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 мг/л. В качестве контроля - среда, не содержащая ионов кобальта. Результаты исследований представлены на фиг.3 и 4 и в таблице 4.

Из фиг.3 видно, что кобальт повышает биосинтез витамина B₁₂. С увеличением концентрации ионов кобальта идет большее накопление витамина. Следует отметить, в предлагаемом способе экспериментально установлено, что при совместном развитии бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий определенное количество кобальта не только контролирует образование кобаламина, но и служит фактором роста по сравнению с прототипом (фиг.4). В прототипе внесение в питательную среду ионов кобальта увеличивает синтез витамина B₁₂ пропионово-кислыми бактериями, но происходит снижение скорости роста клеток.

Таблица 4 Количество жизнеспособной микрофлоры в зависимости от содержания ионов кобальта в питательной среде Концентрация СоСl₂, мг/мл Количество жизнеспособных клеток, к.о.е./мл В. longum В379М Р. shermanii KM 186 Комбинированная закваска В. longum В379М Р. shermanii КМ186 0 7·10¹¹ 6·10¹¹ 3·10¹² 4·10¹² 0,05 3·10¹¹ 5·10¹¹ 3·10¹² 5·10¹² 0,1 6·10¹⁰ 2·10¹¹ 6·10¹² 8·10¹² 0,2 1·10¹⁰ 8·10¹⁰ 5·10¹¹ 7·10¹¹ 0,3 7·10⁹ 2·10¹⁰ 5·10¹⁰ 8·10¹⁰

В результате исследований оптимальной была выбрана доза хлористого кобальта в пределах (0,1-0,2) мг/л, которая позволила получить биомассу не только с высоким содержанием витамина B₁₂, но и с достаточным количеством жизнеспособных клеток пробиотических бактерий (10¹¹-10¹²) к.о.е./мл, что на (1-2) порядка выше по сравнению с прототипом (табл.4.).

Кроме того, биомасса комбинированной закваски нарастает интенсивнее, процесс культивирования сокращается на 3-4 часа по сравнению с известным способом и составляет (19-21) ч. Это свидетельствует о том, что состав питательной среды содержит все компоненты, необходимые для роста бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий, входящих в состав комбинированной закваски, и о симбиотических взаимоотношениях данных культур при совместном культивировании.

Для использования концентрированной закваски в молочной промышленности необходимо создать условия для продления сроков хранения микрофлоры, что определяется экономическими условиями производства. Одним из способов сохранения жизнеспособности клеток является замораживание. Поэтому на следующем этапе работы проводили замораживание полученной биомассы комбинированной закваски и изучали влияние криоанабиоза на выживаемость клеток. Для этого суспензию клеток комбинированной закваски, полученной после центрифугирования, смешивали с защитной средой в соотношении 1:1 и замораживали при температуре не выше минус 20°С. Полученные результаты отражены в таблице 5.

Таблица 5
Устойчивость микроорганизмов к замораживанию Показатели Количество клеток бифидобактерий, КОЕ/см³ Количество клеток пропионово-кислых бактерий, КОЕ/см³ Активность сквашивания 1 л молока 0,01 см³, ч До замораживания 7·10¹² 9·10¹² 12-14 После замораживания 2·10¹² 5·10¹² 12-14

Как показывают полученные нами данные, количество клеток после замораживания осталось на том же уровне, что объясняется не только применением защитной среды, но и образованием естественных протекторов - экзополисахаридов.

Кроме того, по предлагаемому способу количество клеток осталось на том же высоком уровне 10¹² к.о.е./см³ в течение 7 месяцев хранения. В известном способе получения бактериального концентрата пропионово-кислых бактерий количество жизнеспособных клеток в процессе хранения уменьшается на порядок и составляет 10¹⁰ к.о.е./см³.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что комбинированная закваска обладает более выраженной антимутагенной, антимикробной активностью и витаминсинтезирующими свойствами по сравнению с отдельными культурами микроорганизмов, входящими в ее состав. Отмечена высокая устойчивость комбинированной микрофлоры к низким температурам. Полученная заявляемым способом замороженная концентрированная закваска обладает высокими биохимическими свойствами и содержит высокое количество жизнеспособных клеток.

Именно выявленная совокупность отличительных признаков изобретения, заключающаяся в использовании в качестве инокулята комбинированной закваски бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий, влияет на достижение технического результата, выражающегося в повышении пробиотических свойств концентрированной закваски, увеличении количества клеток бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий и обеспечении высокой активности ферментации молока.

Предлагаемый способ получения замороженной концентрированной закваски на основе симбиоза пробиотических бактерий осуществляется следующим образом.

В качестве основы питательной среды в заявленном способе выбрана осветленная творожная сыворотка, которая является сравнительно дешевым вторичным сырьем при производстве творога, в которую добавляют компоненты среды: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон, агар и хлористый кобальт в количестве (0,1-0,2) мг/мл. Затем устанавливают рН среды в пределах 7,0. Питательную среду стерилизуют при (121±1)°C с выдержкой (23±2) мин, охлаждают до температуры (34±1)°С. В качестве инокулята для заквашивания питательной среды используют комбинированную закваску, состоящую из отдельно активизированных культур β-галактозидазой пропионово-кислых и бифидобактерий, в количестве 3-5%. Наращивание клеток проводят в течение (19-21) ч в условиях периодического культивирования при однократной нейтрализации среды через (9-11) часов насыщенным стерильным раствором углекислого натрия (Na₂CO₃). Полученную бактериальную массу охлаждают до температуры (18-20)°С, отделяют от культуральной среды и при этой температуре смешивают с защитной средой, разливают во флаконы по 2 мл и замораживают при минус (20-30)°С. Флаконы с концентрированной закваски закрывают стерильными пробками и закатывают металлическими колпачками. Замороженный препарат хранят до 7 месяцев при температуре минус (20-30)°С.

Пример 1.

Готовят питательную среду на основе осветленной творожной сыворотки, в которую добавляют компоненты среды: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон, агар и хлористый кобальт в количестве 0,1 мг/мл. Затем устанавливают рН среды в пределах 7,0. Готовую среду стерилизуют при 121°C с выдержкой 23 минуты и охлаждают до 34°С. Затем в среду вносят комбинированную закваску в количестве 5%, состоящую из отдельно активизированных β-галактозидазой культур бифидобактерий штамм Bifidobacterium longum B379M и пропионово-кислых бактерий бактерий штамм Propionibacterium shermanii KM 186 в соотношении 1:1. Наращивают клетки в течение 19 часов в условиях периодического культивирования при однократной нейтрализации среды через 9 часов насыщенным стерильным раствором углекислого натрия (Nа₂СО₃). По окончании процесса бактериальную массу охлаждают до 18°С и отделяют клетки от культуральной среды центрифугированием. Полученную бактериальную массу при температуре 18°С смешивают с защитной средой в соотношении 1:1. Затем разливают во флаконы по 2 мл, замораживают в холодильной камере при минус 30°С. Флаконы с концентрированной закваской закрывают стерильными пробками и закатывают металлическими колпачками. Замороженный препарат хранят до 7 месяцев при температуре минус 30°С.

Пример 2.

Готовят питательную среду на основе осветленной творожной сыворотки, в которую добавляют компоненты среды: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон и агар, в среду также вносят хлористый кобальт в количестве 0,2 мг/мл. Затем устанавливают рН среды в пределах 7,0. Готовую среду стерилизуют при 120°С с выдержкой 25 минут и охлаждают до 35°С. Затем в среду вносят комбинированную закваску в количестве 4%, состоящую из отдельно активизированных β-галактозидазой культур бифидобактерий штамм Bifidobacterium bifidum 8₃ и пропиновокислых бактерий штамм P.fredenreichii subsp.shermanii AC - 2503 в соотношении 1:1. Наращивают клетки в течение 20 часов в условиях периодического культивирования при однократной нейтрализации среды через 10 часов насыщенным стерильным раствором углекислого натрия (Nа₂СО₃). По окончании процесса бактериальную массу охлаждают до 20°С и отделяют клетки от культуральной среды центрифугированием. Полученную бактериальную массу при температуре 20°С смешивают с защитной средой в соотношении 1:1. Затем разливают во флаконы по 2 мл, замораживают в холодильной камере при минус 20°С. Флаконы с концентрированной закваской закрывают стерильными пробками и закатывают металлическими колпачками. Замороженный препарат хранят до 7 месяцев при температуре минус 20°С.

Пример 3.

Готовят питательную среду на основе осветленной творожной сыворотки, в которую добавляют компоненты среды: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон и агар. Вносят хлористый кобальт в количестве 0,2 мг/мл. Затем устанавливают рН среды в пределах 7,0. Готовую среду стерилизуют при 122°C с выдержкой 22 минуты и охлаждают до 33°С. Затем в среду вносят комбинированную закваску в количестве 3%, состоящую из отдельно активизированных β-галактозидазой культур бифидобактерий штамм Bifidobacterium longum B379M и пропионово-кислых бактерий штамм Propionibacterium shermanii KM 186 в соотношении 1:1. Наращивают клетки в течение 21 часа в условиях периодического культивирования при однократной нейтрализации среды через 11 часов насыщенным стерильным раствором углекислого натрия (Na₂CO₃). По окончании процесса бактериальную массу охлаждают до 19°С и отделяют клетки от культуральной среды центрифугированием. Полученную бактериальную массу при температуре 19°С смешивают с защитной средой в соотношении 1:1. Затем разливают во флаконы по 2 мл, замораживают в холодильной камере при минус 25°С. Флаконы с концентрированной закваской закрывают стерильными пробками и закатывают металлическими колпачками. Замороженный препарат хранят до 7 месяцев при температуре минус 25°С.

Способ получения замороженной концентрированной закваски на основе симбиоза пробиотических бактерий предусматривает приготовление питательной среды на основе осветленной творожной сыворотки с внесением хлористого кобальта в количестве (0,1-0,2) мг/мл. В охлажденную до (34±1)°С среду вносят комбинированную закваску в количестве (3-5)%, состоящую из отдельно активизированных β-галактозидазой культур бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий, взятых в соотношении 1:1. Затем осуществляют наращивание клеток, отделение бактериальной массы от культуральной среды, смешивание ее с защитной средой, розлив и замораживание. Это обеспечивает повышение пробиотических свойств закваски, увеличение количества клеток бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий и высокую активность ферментации молока. 3 з.п. ф-лы. 4 ил., 5 табл.

1. Способ получения замороженной концентрированной закваски на основе симбиоза пробиотических бактерий, предусматривающий приготовление питательной среды, содержащей хлористый кобальт, внесение инокулята в количестве 3-5%, наращивание клеток, отделение бактериальной массы от культуральной среды, смешивание ее с защитной средой, розлив и замораживание, отличающийся тем, что в качестве инокулята используют комбинированную закваску, состоящую из отдельно активизированных β-галактозидазой культур бифидобактерий и пропионово-кислых бактерий, при этом хлористый кобальт вводят в количестве 0,1-0,2 мг/мл.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве инокулята используют активизированные β-галактозидазой культуры бифидобактерий штамм Bifidobacterium longum B379M и пропионово-кислых бактерий штамм Propionibacterium shermanii KM 186, взятых в соотношении 1:1.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве инокулята используют активизированные β-галактозидазой культуры бифидобактерий штамм Bifidobacterium bifidum 8₃ и пропионово-кислых бактерий штамм P.fredenreichii subsp.shermanii AC - 2503, взятых в соотношении 1:1.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что инокулят вносят при температуре (34±1)°С.