НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ БОЛЕЗНЕЙ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР - ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙ БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS CORRUGATA МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/04 

Изобретение относится к области молекулярно-генетической диагностики фитопатогенов.

В последние годы разрабатываются различные методы молекулярно-генетической диагностики фитопатогенов, которые позволяют выявлять последовательности ДНК, являющиеся характерными для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Тем самым обнаруживается соответствующий возбудитель заболевания и делается вывод о его наличии в биологическом материале.

Наиболее перспективным является использование в этих целях метода полимеразной цепной реакции (ПНР) - высокоспецифичный и высокочувствительный метод выявления бактериальной ДНК. Принцип ПЦР заключается в многократном копировании (амплификации) определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя.

Известно изобретение по заявке №2003121605 (опубликована 27.01.2005), представляющее набор для идентификации энтерогеморрагических Escherihia coli. Это изобретение предполагает проведение ПЦР реакции с участием реагентов, входящих в этот набор. В частности, используются следующие праймеры, специфичные искомым бактериям, которые позволяют обнаружить ДНК этой бактерии при ПЦР:

Rfb for 5'-CAGGTGAAGGTGGAATGGTTG-3'

Rfb rev 5'-GAGTACATTGGCATGGTGTGG-3'

stx2 for 5'-ATCAGCAATGTGCTTCCGGAG-3'

stx2 rev 5'-CTGAGCACTTTGCAGTAACGG-3'.

В результате обнаруживаются энтерогеморрагические Escherihia coli.

Также известны аналогичные изобретения «Способ и набор для обнаружения ДНК бактерии заболевания лаймского боррелиоза - borrelia burqdorferi» (заявка №2004105688, опубликована 10.08.2005) и «Набор реагентов для определения ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции» (заявка №2005136997, опубликована 10.06.2007).

Работа над созданием праймеров, которые используются в подобных наборах, строится обычно следующим образом.

1. С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого микроорганизма выбирается участок генома уникальный для данного вида микроорганизмов (или группы видов).

2. На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПНР-реакции (часто 2 праймера и проба).

На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих геномных последовательностей и выборе участка последовательности, где число мутаций соответствует требуемому расположению праймеров.

Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей многих организмов друг с другом, поиск уникальных для нужного микроорганизма участков, не имеющих аналогов у других микроорганизмов.

Поиск соответствия между числом мутаций и расположению праймеров означает, что мутации, возможные в данном микроорганизме (естесственно те, данные о которых уже есть в базах или уже самостоятельно получены), не должны затрагивать выбранный для праймеров участок генома, так как замены в геномной последовательности (мутации) могут негативно сказаться на работе праймеров.

3. Изготовление праймеров заказывается в особом сервисном центре.

4. С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей (например, для определения наличия/отсутствия данного микроорганизма в биоматериале).

Предлагаемое изобретение позволяет обнаруживать ДНК фитопатогенной бактерии Pseudomonas corrugata, которая вызывает некроз сердцевины стебля томата (Lycopersicum esculentum Mill.) и значительные потери урожая.

Однако аналогичные наборы, а также реакционные смеси, праймеры и способы обнаружения ДНК этой бактерии неизвестны.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале (защищенный грунт, семена, растения, плоды огурца и томата).

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии Pseudomonas corrugate, включающего в себя праймеры:

5'-CGT GTG TTG CTG GGG GAA AC-3'

5'-GCG GGT TGA GCA AGG TGT TC-3'

и пробу: (BHQ1)-5'-GGC GAA GCG CTT GTC C(FdT)T GGG ATT-3'P, где

BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ.

1. Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры и проба, специфичные к участку ДНК Pseudomonas corrugata - гену PhaCl, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (рН 8.8 при 25°С), 500 мМ KCl, 0.8% Р40, 20 мМ MgCl₂), внутренний контрольный образец (ВК).

И праймеры, и проба представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к маркерному участку генома возбудителя, вводятся в реакцию непосредственно для амплификации (наработки) продукта. Проба (тоже специфичная к данному участку ДНК) имеет в своем составе флуоресцентную метку, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, что, в свою очередь, зависит от эффективности работы праймеров, количества стартового материала и других параметров реакции. Иными словами праймеры обеспечивают течение реакции, проба - проявку ее результатов.

Внутренний контрольный образец (ВК) представляет собой ДНК-последовательность, вносимую в реакцию для оценки эффективности ее протекания. Наработка ВК идет независимо от наработки специфического продукта с помощью отдельных праймеров и проб.

2. Раствор фермента Taq-полимеразы.

3. Положительный контрольный образец - ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 240 п.н. генома Pseudomonas corrugata.

Он вносится в пробирку (по аналогии с исследуемыми образцами) для того, чтобы иметь возможность сравнивать результаты, полученные в опытных пробирках с тем, как должно получаться при "положительной реакции". Соответственно добавляемые в остальные пробирки образцы ДНК являются опытными.

4. Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.

Данный набор применяется следующим образом.

1. Биологический материал (защищенный грунт, семена, растения, плоды огурца и томата) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием другого набора (набор реагентов для пробоподготовки, не является предметом данного патента); в ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для ПЦР.

2. Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и пробу, маркируется согласно количеству анализируемых образцов.

3. Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы.

4. Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок K- (отрицательный контрольный образец), K+ (положительный контрольный образец)) вносится выделенная согласно п.1) ДНК.

5. В пробирку, маркированную K-, вносится отрицательный контрольный образец.

6. В пробирку, маркированную K+, вносится положительный контрольный образец.

7. Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. Детекция результатов осуществляется детектирующим амплификатором автоматически во время амплификации (устройства: амплификаторы детектирующие ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО "НПФ ДНК-Технология").

Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору.

В случае образования специфического продукта ДНК проба разрушается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции, который фиксируется специальными приборами - детектирующими амплификаторами.

Набор синтетических олигонуклеотидов включает праймеры 5'-CGT GTG TTG CTG GGG GAA АС-3', 5'-GCG GGT TGA GCA AGG TGT ТС-3' и пробу: (BHQ1)-5'-GGC GAA GCG СТТ GTC C(FdT)T GGG ATT-3T. Посредством ПЦР набор позволяет достоверно обнаруживать в биологическом материале ДНК возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии Pseudomonas corrugata.

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии Pseudomonas corrugata методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что включает в себя праймеры:
5'-CGT GTG TTG CTG GGG GAA АС-3'
5'-GCG GGT TGA GCA AGG TGT ТС-3'
и пробу: (BHQ1)-5'-GGC GAA GCG СТТ GTC C(FdT)T GGG АТТ-3'Р, где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.