НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Actinobacillus actinomycetemcomitans МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/04 

Описание патента на изобретение RU2420592C1

1. Область техники.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для диагностики заболеваний ротовой полости (гингивита, пародонтита).

Согласно современным представлениям, основной причиной развития заболеваний пародонта является микробная инфекция. Actinobacillus actinomycetemcomitans играет ключевую этиологическую роль в развитии быстропрогрессирующих пародонтитов. В последние годы разрабатываются различные методы молекулярно-генетической диагностики инфекций пародонта, которые позволяют выявлять последовательности ДНК, являющиеся характерными для определенного вида возбудителя. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) является оптимальным для идентификации бактерий, связанных с воспалительными процессами пародонта. Принцип ПЦР заключается в многократном копировании (амплификации) определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя. Благодаря высокой специфичности ПЦР происходит амплификация исключительно ДНК искомого микроорганизма - любая сопутствующая флора не может оказать влияние на эффективность диагностики.

2. Уровень техники.

Известны следующие аналоги данного изобретения:

Патент №2306341, дата публикации 20.09.2007 (с 08.04.2010 патент прекратил действие, но может быть восстановлен): «Набор реагентов для определения ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции»

Это изобретение позволяет определить пять парадонтопатогенов в одном образце с помощью мультиплексной ПЦР, что достигается использованием комбинации 16s rDNA-праймеров в определенных концентрациях:

Prevotella intermedia sensu stricto:

5'-GCA TCT GAC GTG GAC CAA-3', 0,15 µM;

Bacteroides forsythus:

5'-TAC AGG GGA ATA AAA TGA GAT ACG-3', 0,60 µM;

Actinobacillus actinomycetemcomitans:

5'-ATT GGG GTT TAG CCC TGG TG-3', 0,20 µM;

Porphyromonas gingivalis:

5'-TGT AGA TGA CTG ATG GTG AAA ACC-3', 0,30 µM;

обратный олигонуклеотидный праймер, общий для ДНК Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus и

Prevotella intermedia: 5'-ACG TCA TCC CCA CCT TCC TC-3', 1,20 µM,

а также два олигонуклеотидных праймера, специфичных для генома Treponema denticola: 5'-GAA TCG СТА GTA АТС GCA CAT CAG-3' и 5'-ТТС AAA CAT TCC AGC GTC TTC ATT-3', при этом концентрация каждого праймера - 0,30 µМ.

Набор содержит также комплект для подготовки пробы и положительный и отрицательный контрольные образцы. Анализ продуктов ПЦР осуществляется методом электрофореза.

Работа над созданием синтетических олигонуклеотидов (праймеров), которые используются в подобных наборах и являются их отличительной чертой, строится обычно следующим образом:

1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого микроорганизма выбирается участок генома, уникальный для данного вида микроорганизмов (или группы видов).

2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР.

На данном этапе работа заключается в сравнении геномных последовательностей разных микроорганизмов между собой и выборе уникального для нужного микроорганизма участка, не имеющего аналогов у других микроорганизмов.

Кроме того, необходимым условием оптимальной работы праймеров является соответствие между их расположением и числом мутаций в нуклеотидной последовательности генома микроорганизма. Это означает, что мутации, возможные в данном микроорганизме (естественно, те данные о которых уже есть в базах или уже самостоятельно получены), не должны затрагивать выбранный для праймеров участок генома, так как замены в геномной последовательности (мутации) могут негативно сказаться на работе праймеров.

3) Изготовление праймеров заказывается в особом сервисном центре.

4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей (для определения наличия/отсутствия данного микроорганизма в биоматериале).

Предлагаемое изобретение отличает уникальный набор из двух праймеров и зонда, который позволяет обнаруживать ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Actinobacillus actinomycetemcomitans, играющего ключевую этиологическую роль в развитии быстропрогрессирующих пародонтитов, с высокой диагностической чувствительностью и специфичностью.

3. Раскрытие изобретения.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале, забранном с помощью стоматологических зондов.

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Actinobacillus actinomycetemcomitans включающего в себя праймеры:

5'-CGC СТА GGG CTG CCT GAA Т-3'

5'-GCA GGT GAG GTT GCG CAG GA-3'

и зонд: (BHQ1)-5'-TTC GCC CGC C(FdT)C GCC CCT GA-3'-P, где

BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ:

1) Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры и зонд, специфичные к участку ДНК Actinobacillus actinomycetemcomitans, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (pH 8.8 при 25°С), 500 мМ КСl, 0.8% Р40, 20 мМ MgCl2), внутренний контрольный образец (ВК).

И праймеры, и зонд представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к маркерному участку генома Actinobacillus actinomycetemcomitans - гену глутаредоксин 2 (glrA), вводятся в реакцию непосредственно для амплификации (наработки) продукта. Зонд (тоже специфичный к данному участку ДНК) имеет в своем составе флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. В случае образования специфического продукта ДНК зонд разрушается, действие гасителя на флуоресцентную метку прекращается, это ведет к возрастанию уровня флуоресценции данного зонда, что фиксируется специальными приборами - детектирующими амплификаторами. Интенсивность флуоресценции зонда свидетельствует о количестве образующегося продукта, что в свою очередь зависит от эффективности работы праймеров, количества стартового материала и других параметров реакции. Иными словами праймеры обеспечивают течение реакции, зонд - проявку ее результатов.

Внутренний контрольный образец (ВК) представляет собой ДНК-последовательность, вносимую в реакцию для оценки эффективности ее протекания. Наработка ВК идет независимо от наработки специфического продукта с помощью отдельных праймеров и зонда.

2) Раствор фермента Taq-полимеразы.

3) Положительный контрольный образец - ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 235 п.н. генома Actinobacillus actinomycetemcomitans. Он вносится в пробирку (по аналогии с исследуемыми образцами) для того, чтобы иметь возможность сравнивать результаты, полученные в опытных пробирках с тем, как должно получаться при "положительной реакции". Соответственно добавляемые в остальные пробирки образцы ДНК являются опытными.

4) Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.

4. Осуществление изобретения.

1) Биологический материал (соскобы, забранные стоматологическими зондами) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора праймеров проводится через процедуру пробоподготовки с использованием другого набора (набор реагентов для пробоподготовки не является предметом данного патента); в ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР;

2) Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, маркируется согласно количеству анализируемых образцов;

3) Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы;

4) Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок К-(отрицательный контрольный образец), К+(положительный контрольный образец)) вносится выделенная согласно п.1) ДНК;

5) В пробирку, маркированную К- вносится отрицательный контрольный образец;

6) В пробирку, маркированную К+ вносится положительный контрольный образец;

7) Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. Детекция результатов осуществляется детектирующим амплификатором автоматически во время амплификации (устройства: амплификаторы детектирующие ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО "НПО ДНК-Технология").

Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору.

Похожие патенты RU2420592C1

название год авторы номер документа
НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Treponema denticola МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 2012
  • Ребриков Денис Владимирович
  • Зорина Оксана Александровна
  • Петрухина Наталия Борисовна
  • Борискина Ольга Андреевна
  • Беркутова Ирина Сергеевна
  • Аймадинова Нелли Камильевна
RU2510857C2
НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Prevotella intermedia МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 2010
  • Зорина Оксана Александровна
  • Кулаков Анатолий Алексеевич
  • Грудянов Александр Иванович
  • Петрухина Наталия Борисовна
  • Борискина Ольга Андреевна
  • Авраамова Тамара Васильевна
  • Турчанинова Мария Андреевна
  • Ребриков Денис Владимирович
RU2420589C1
НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Porphyromonas gingivalis МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 2010
  • Зорина Оксана Александровна
  • Кулаков Анатолий Алексеевич
  • Грудянов Александр Иванович
  • Петрухина Наталия Борисовна
  • Борискина Ольга Андреевна
  • Авраамова Тамара Васильевна
  • Турчанинова Мария Андреевна
  • Ребриков Денис Владимирович
RU2420591C1
НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Tannerella forsythensis МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 2012
  • Ребриков Денис Владимирович
  • Зорина Оксана Александровна
  • Петрухина Наталия Борисовна
  • Борискина Ольга Андреевна
  • Беркутова Ирина Сергеевна
  • Аймадинова Нелли Камильевна
RU2535988C2
НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Candida albicans МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 2012
  • Ребриков Денис Владимирович
  • Зорина Оксана Александровна
  • Петрухина Наталия Борисовна
  • Борискина Ольга Андреевна
  • Беркутова Ирина Сергеевна
  • Аймадинова Нелли Камильевна
RU2510856C2
НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО МОНОЦИТАРНОГО ЭРЛИХИОЗА Ehrlichia spp. МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ "В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ" 2009
  • Трофимов Дмитрий Юрьевич
  • Ребриков Денис Владимирович
  • Турчанинова Мария Андреевна
RU2415947C1
НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ БОЛЕЗНЕЙ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР - ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙ БАКТЕРИИ XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV VESICARORIA МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 2008
  • Ребриков Денис Владимирович
  • Турчанинова Мария Андреевна
RU2378382C1
НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ БОЛЕЗНЕЙ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР - ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙ БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS SYRINGAE PV LACHRYMANS МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 2008
  • Ребриков Денис Владимирович
  • Турчанинова Мария Андреевна
RU2378383C1
НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ БОЛЕЗНЕЙ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР - ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙ БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS CORRUGATA МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 2008
  • Ребриков Денис Владимирович
  • Турчанинова Мария Андреевна
RU2376388C1
НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННЫХ МИКРОБОВ Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis ПРИ ПОМОЩИ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 2005
  • Царев Виктор Николаевич
  • Николаева Елена Николаевна
  • Земляная Надежда Юрьевна
  • Воронцова Нина Ивановна
  • Шеремет Ольга Константиновна
  • Иванова Наталия Владимировна
RU2306341C1

Реферат патента 2011 года НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Actinobacillus actinomycetemcomitans МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Actinobacillus actinomycetemcomitans. Изобретение может быть использовано в медицине для диагностики заболеваний ротовой полости.

Формула изобретения RU 2 420 592 C1

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Actinobacillus actinomycetemcomitans методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что включает в себя праймеры:
5'-CGC СТА GGG CTG CCT GAA Т-3'
5'-GCA GGT GAG GTT GCG CAG GA-3'
и зонд: (BHQ1)-5'-TTC GCC CGC C(FdT)C GCC CCT GA-3'-P, где
BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2011 года RU2420592C1

RU 2005136997 А, 10.06.2007
НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННЫХ МИКРОБОВ Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis ПРИ ПОМОЩИ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 2005
  • Царев Виктор Николаевич
  • Николаева Елена Николаевна
  • Земляная Надежда Юрьевна
  • Воронцова Нина Ивановна
  • Шеремет Ольга Константиновна
  • Иванова Наталия Владимировна
RU2306341C1
НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ БОЛЕЗНЕЙ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР - ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙ БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS CORRUGATA МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 2008
  • Ребриков Денис Владимирович
  • Турчанинова Мария Андреевна
RU2376388C1
Топчак-трактор для канатной вспашки 1923
  • Берман С.Л.
SU2002A1
KOZAROV E., et al
"Detection of bacterial DNA in atheromatous plaques by quantitative PCR"
Microbes Infect
Пломбировальные щипцы 1923
  • Громов И.С.
SU2006A1

RU 2 420 592 C1

Авторы

Зорина Оксана Александровна

Кулаков Анатолий Алексеевич

Грудянов Александр Иванович

Петрухина Наталия Борисовна

Борискина Ольга Андреевна

Авраамова Тамара Васильевна

Турчанинова Мария Андреевна

Ребриков Денис Владимирович

Даты

2011-06-10Публикация

2010-04-21Подача