НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Tannerella forsythensis МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2014 года по МПК C12Q1/68 C12N15/11 

1. Область техники

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для диагностики заболеваний ротовой полости (гингивита, пародонтита).

На протяжении многих лет заболевания пародонта стабильно занимают по распространенности одно из ведущих мест в мире. Несмотря на широкое развитие инструментальных и лабораторных методов исследования, ранняя и точная диагностика различных стоматологических заболеваний до сих пор остается крайне актуальным вопросом.

Согласно современным представлениям, основной причиной развития заболеваний пародонта является микробная инфекция. Tannerella forsythensis (Bacteroides forsythus) играет ключевую этиологическую роль в развитии быстропрогрессирующих пародонтитов. В последние годы разрабатываются различные методы молекулярно-генетической диагностики инфекций пародонта, которые позволяют выявлять последовательности ДНК, являющиеся характерными для определенного вида возбудителя. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) является оптимальным для идентификации бактерий, связанных с воспалительными процессами пародонта. Принцип ПЦР заключается в многократном копировании (амплификации) определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя. Благодаря высокой специфичности ПЦР происходит амплификация исключительно ДНК искомого микроорганизма - любая сопутствующая флора не может оказать влияние на эффективность диагностики.

2. Уровень техники.

Известны следующие аналоги данного изобретения.

Патент №2306341, дата публикации 20.09.2007 (с 08.04.2010 патент прекратил действие, но может быть восстановлен): «Набор реагентов для определения ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции».

Это изобретение позволяет определить пять парадонтопатогенов в одном образце с помощью мультиплексной ПЦР, что достигается использованием комбинации 16s rDNA-праймеров в определенных концентрациях:

Prevotella intermedia sensu stricto:

5′-GCATCTGACGTGGACCAA-3′, 0,15 ^µM;

Bacteroides forsythus:

5′-TACAGGGGAATAAAATGAGATACG-3′, 0,60 ^µM;

Actinobacillus actinomycetemcomitans:

5′-ATTGGGGTTTAGCCCTGGTG-3′, 0,20 ^µM;

Porphyromonas gingivalis:

5′-TGTAGATGACTGATGGTGAAAACC-3′, 0,30 ^µM;

обратный олигонуклеотидный праймер, общий для ДНК Porphyromonas gin.givalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus и

Prevotella intermedia: 5′-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3′, 1,20 ^µM, а также два олигонуклеотидных праймера, специфичных для генома

Treponema denticola: 5′-GAATCGCTAGTAATCGCACATCAG-3′ и 5′-TTCAAACATTCCAGCGTCTTCATT-3′, при этом концентрация каждого праймера - 0,30 ^µМ.

Набор содержит также комплект для подготовки пробы и положительный и отрицательный контрольные образцы. Анализ продуктов ПЦР осуществляется методом электрофореза.

Патент №2420591, дата публикации 10.06.2011. Изобретение представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Porphyromonas gingivalis. Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале, забранном с помощью стоматологических зондов. Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтотопагенного микроорганизма Porphyromonas gingivalis, включающего в себя праймеры:

5′-TCCGACCGTCGAGCCTGTT-3′

5′- CTGCCACAGCCAGTAGCCTT-3′

и зонд: (BHQ1)-5′-GCCGAAAGAA(FdT)TGCCGGCCG-3′-P.

Патент №2420589, дата публикации 10.06.2011. Изобретение представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Prevotella intermedia. Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале, забранном с помощью стоматологических зондов. Указанный результат достигается путем использования при постановке ПНР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтотопагенного микроорганизма Prevotella intermedia, включающего в себя праймеры:

5′-CACTTGGCAAGCACAAAATGAA-3′

5′-TGGGGTTATCGGTTTCTACGAA-3′

и зонд: (BHQ1)-5′-CGCACCCGAAC(FdT)GCTTGGCG-3′-P.

Патент №2420592, дата публикации 10.06.2010. Изобретение представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Actinobacillus actinomycetemcomitans. Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале, забранном с помощью стоматологических зондов.

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Actinobacillus actinomycetemcomitans, включающего в себя праймеры:

5′-CGCCTAGGGCTGCCTGAAT-3′

5′-GCAGGTGAGGTTGCGCAGGA-3′

и зонд: (BHQ1)-5′-TTCGCCCGCC(FdT)CGCCCCTGA-3′-P.

Работа над созданием синтетических олигонуклеотидов (праймеров), которые используются в подобных наборах и являются их отличительной чертой, строится обычно следующим образом.

1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого микроорганизма выбирается участок генома - уникальный для данного вида микроорганизмов (или группы видов).

2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР.

На данном этапе работа заключается в сравнении геномных последовательностей разных микроорганизмов между собой и выборе уникального для нужного микроорганизма участка, не имеющего аналогов у других микроорганизмов.

Кроме того, необходимым условием оптимальной работы праймеров является соответствие между их расположением и числом мутаций в нуклеотидной последовательности генома микроорганизма. Это означает, что мутации, возможные в данном микроорганизме (естественно, те данные, которые уже есть в базах или уже самостоятельно получены), не должны затрагивать выбранный для праймеров участок генома, так как замены в геномной последовательности (мутации) могут негативно сказаться на работе праймеров.

3) Изготовление праймеров заказывается в особом сервисном центре.

4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей (для определения наличия/отсутствия данного микроорганизма в биоматериале).

Предлагаемое изобретение отличает уникальный набор из двух праймеров и зонда, который позволяет обнаруживать ДНК пародонтотопагенного микроорганизма Tannerella forsythensis, играющего ключевую этиологическую роль в развитии быстропрогрессирующих пародонтитов, с высокой диагностической чувствительностью и специфичностью.

3. Раскрытие изобретения

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале, забранном с помощью стоматологических зондов.

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтотопагенного микроорганизма Tannerella forsythensis, включающего в себя праймеры:

5′-TGGCACCCTCCGATGCCGAC-3′

5′-GCGCAGACCGTTGGGTTTCA-3′

(BHQ1)-5′- CCGCGCCCGA(FdT)GCGTCGCTGGC-3′-Р,

где BHQ1 означает присоединенный к 5′-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду T.

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ:

1) Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры и зонд, специфичные к участку ДНК Tannerella forsythensis, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (рН 8.8 при 25°C), 500 мМ KCl, 0.8% Р40, 20 мМ MgCl₂), внутренний контрольный образец (ВК).

И праймеры, и зонд представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к маркерному участку генома Tannerella forsythensis - гену bspA, вводятся в реакцию непосредственно для амплификации (наработки) продукта. Зонд (тоже специфичный к данному участку ДНК) имеет в своем составе флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. В случае образования специфического продукта ДНК зонд разрушается, действие гасителя на флуоресцентную метку прекращается, это ведет к возрастанию уровня флуоресценции данного зонда, что фиксируется специальными приборами - детектирующими амплификаторами. Интенсивность флуоресценции зонда свидетельствует о количестве образующегося продукта, что в свою очередь зависит от эффективности работы праймеров, количества стартового материала и других параметров реакции. Иными словами праймеры обеспечивают течение реакции, зонд - проявку ее результатов.

Внутренний контрольный образец (ВК) представляет собой ДНК-последовательность, вносимую в реакцию для оценки эффективности ее протекания. Наработка ВК идет независимо от наработки специфического продукта с помощью отдельных праймеров и зонда.

2) Раствор фермента Taq-полимеразы.

3) Положительный контрольный образец - ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 161 п.н. генома Tannerella forsythensis. Он вносится в пробирку (по аналогии с исследуемыми образцами) для того, чтобы иметь возможность сравнивать результаты, полученные в опытных пробирках с тем, как должно получаться при "положительной реакции". Соответственно добавляемые в остальные пробирки образцы ДНК являются опытными.

4) Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.

4. Осуществление изобретения

1) Биологический материал (соскобы, забранные стоматологическими зондами) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора праймеров проводится через процедуру пробоподготовки с использованием другого набора (набор реагентов для пробоподготовки, не является предметом данного патента); в ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР;

2) Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, маркируется согласно количеству анализируемых образцов;

3) Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы;

4) Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок K- (отрицательный контрольный образец), K+ (положительный контрольный образец)) вносится выделенная согласно п.1 ДНК;

5) В пробирку, маркированную К-, вносится отрицательный контрольный образец;

6) В пробирку, маркированную К+, вносится положительный контрольный образец;

7) Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. Детекция результатов осуществляется детектирующим амплификатором автоматически во время амплификации (устройства: амплификаторы детектирующие ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО "НПФ ДНК-Технология")).

Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Tannerella forsythensis методом полимеразной цепной реакции. Указанный набор включает специфичные к фрагменту гена bspA микроорганизма Tannerella forsythensis праймеры 5′-TGGCACCCTCCGATGCCGAC-3′ и 5′-GCGCAGACCGTTGGGTTTCA-3′, а также зонд (BHQ1)-5′-CCGCGCCCGA(FdT)GCGTCGCTGGC-3′-Р, где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т. Предлагаемое изобретение позволяет достоверно обнаруживать присутствие в биологическом материале микроорганизма Tannerella forsythensis.

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Tannerella forsythensis методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что включает в себя праймеры:
5′-TGGCACCCTCCGATGCCGAC-3′
5′-GCGCAGACCGTTGGGTTTCA-3′
и зонд (BHQ1)-5′-CCGCGCCCGA(FdT)GCGTCGCTGGC-3′-P, где BHQ1 означает присоединенный к 5′-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду T.