НОВЫЕ ЭНАНТИОМЕРНОЧИСТЫЕ β-АГОНИСТЫ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ Российский патент 2010 года по МПК C07D265/36 C07D413/04 A61K31/536 A61P11/00 

Настоящее изобретение относится к энантиомерночистым соединениям общей формулы 1

в которой остатки R¹, R², R³, R⁴ и Х^- могут иметь указанные в формуле изобретения и последующем описании значения, к способу получения таких соединений и к их применению в качестве лекарственных средств, прежде всего в качестве лекарственных средств для лечения заболеваний дыхательных путей.

Предпосылки создания изобретения

Бетамиметики (β-адренергические вещества) известны из уровня техники. В этом отношении можно сослаться, например, на патент US 4460581, в котором предложены бетамиметики и их применение для терапии различных заболеваний.

Для медикаментозной терапии различных заболеваний часто желательно располагать лекарственными средствами, обладающими продолжительным действием. За счет этого, как правило, удается в течение длительного промежутка времени обеспечить поддержание в организме необходимой для достижения терапевтического эффекта концентрации действующего вещества без необходимости излишне частого повторного введения лекарственного средства в организм. В остальном же введение действующего вещества в организм с меньшей периодичностью в значительной степени способствует хорошему самочувствию пациента.

Наиболее желательно при этом располагать лекарственным средством, которое позволяло бы достигать требуемого терапевтического эффекта при его однократном введении в организм в день (т.е. лекарственным средством, рассчитанным на однократный прием в сутки). Преимущество, связанное с применением лекарственного средства только один раз в сутки, состоит в удобстве подобной схемы лечения для пациента благодаря сравнительно быстрому его привыканию к регулярному приему медикамента в определенное время суток.

В основу настоящего изобретения была положена задача предложить бетамиметики, которые, с одной стороны, проявляли бы терапевтический эффект при лечении заболеваний дыхательных путей, а с другой стороны, обладали бы более продолжительным действием и тем самым могли бы использоваться для приготовления лекарственных средств с более длительным действием. Задача настоящего изобретения состояла прежде всего в том, чтобы предложить бетамиметики, которые благодаря их длительному действию можно было бы использовать для приготовления лекарственного средства, которое для терапии заболеваний дыхательных путей требовалось бы вводить в организм один раз в сутки. Наряду с указанными выше задачами еще одна задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы предложить бетамиметики, которые обладали бы не только особо высокой эффективностью (сильным действием), но и высокой степенью избирательности по отношению к β₂-адренорецепторам. Кроме того, задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы предложить бетамиметики, которые благодаря их физико-химическим свойствам можно было бы использовать главным образом для приготовления лекарственных композиций, наиболее пригодных для введения в организм путем ингаляции. Задача настоящего изобретения состояла, в частности, в том, чтобы предложить бетамиметики, которые наряду с указанными выше свойствами были бы особо пригодны для приготовления на их основе ингаляционных порошков и суспензий для аэрозольной ингаляции.

Подробное описание изобретения

При создании изобретения неожиданно было установлено, что указанные выше задачи позволяют решить соединения формулы 1.

В соответствии с этим в настоящем изобретении предлагаются энантиомерночистые соединения формулы 1

в которой

R¹ обозначает водород, С₁-С₄алкил, С₁-С₄алкоксигруппу или галоген,

R² обозначает водород, С₁-С₄алкил, С₁-С₄алкоксигруппу или галоген,

R³ обозначает водород, С₁-С₄алкил, С₁-С₄алкоксигруппу, галоген, ОН, -O-С₁-С₄алкилен-СООН или -O-С₁-С₄алкилен-СОО-С₁-С₄алкил,

R⁴ обозначает водород, С₁-С₄алкил, С₁-С₄алкоксигруппу или галоген,

X^- обозначает однозарядный анион, предпочтительно однозарядный анион, выбранный из группы, включающей хлорид, бромид, иодид, сульфат, фосфат, метансульфонат, нитрат, малеинат, ацетат, бензоат, цитрат, салицилат, трифторацетат, фумарат, тартрат, оксалат, сукцинат, бензоат и паратолуолсульфонат,

необязательно в виде их таутомеров, смесей таутомеров, гидратов или сольватов.

Предпочтительны энантиомерночистые соединения общей формулы 1, в которой

R¹ обозначает водород или галоген,

R² обозначает водород или галоген,

R³ обозначает водород, С₁-С₄алкоксигруппу или галоген,

R⁴ обозначает водород или галоген,

Х^- однозарядный анион, предпочтительно однозарядный анион, выбранный из группы, включающей хлорид, бромид, иодид, сульфат, фосфат, метансульфонат, нитрат, малеинат, ацетат, бензоат, цитрат, салицилат, трифторацетат, фумарат, тартрат, оксалат, сукцинат, бензоат и паратолуолсульфонат,

необязательно в виде их таутомеров, смесей таутомеров, гидратов или сольватов.

Предпочтительны далее энантиомерночистые соединения общей формулы 1, в которой

R¹ обозначает водород, фтор или хлор, предпочтительно водород или фтор,

R² обозначает водород, фтор или хлор, предпочтительно водород или фтор,

R³ обозначает водород, метоксигруппу, этоксигруппу, фтор или хлор, предпочтительно водород, метоксигруппу, этоксигруппу или фтор,

R⁴ обозначает водород, фтор или хлор, предпочтительно водород или фтор,

Х^- обозначает однозарядный анион, предпочтительно однозарядный анион, выбранный из группы, включающей хлорид, бромид, иодид, сульфат, фосфат, метансульфонат, нитрат, малеинат, ацетат, бензоат, цитрат, салицилат, трифторацетат, фумарат, тартрат, оксалат, сукцинат, бензоат и паратолуолсульфонат,

необязательно в виде их таутомеров, смесей таутомеров, гидратов или сольватов.

Предпочтительны также энантиомерночистые соединения общей формулы 1, в которой

R¹ обозначает водород или фтор,

R² обозначает водород,

R³ обозначает метоксигруппу, этоксигруппу или фтор,

R⁴ обозначает водород,

Х^- обозначает однозарядный анион, выбранный из группы, включающей хлорид, бромид, сульфат, метансульфонат, малеинат, ацетат, бензоат, цитрат, салицилат, трифторацетат, фумарат, тартрат и сукцинат,

необязательно в виде их таутомеров, смесей таутомеров, гидратов или сольватов.

Столь же важное значение согласно изобретению имеют далее энантиомерночистые соединения общей формулы 1, в которой

R¹ обозначает водород,

R² обозначает водород, фтор или хлор, предпочтительно водород или фтор,

R³ обозначает водород,

R⁴ обозначает водород, фтор или хлор, предпочтительно водород или фтор,

X^- обозначает однозарядный анион, выбранный из группы, включающей хлорид, бромид, сульфат, метансульфонат, малеинат, ацетат, бензоат, цитрат, салицилат, трифторацетат, фумарат, тартрат и сукцинат,

необязательно в виде их таутомеров, смесей таутомеров, гидратов или сольватов.

Предпочтительны, кроме того, энантиомерночистые соединения общей формулы 1, в которой

X^- обозначает однозарядный анион, выбранный из группы, включающей хлорид, метансульфонат, малеинат, ацетат, цитрат, салицилат, трифторацетат, фумарат и сукцинат, предпочтительно хлорид, малеинат, салицилат, фумарат и сукцинат, наиболее предпочтительно обозначает хлорид, а

R¹, R², R³ и R⁴ могут иметь указанные выше значения, необязательно в виде их таутомеров, смесей таутомеров, гидратов или сольватов.

К особенно предпочтительным относятся далее соединения общей формулы 1, выбранные из группы, включающей

гидрохлорид 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

гидрохлорид 8-{(R)-2-[2-(2,4-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

гидрохлорид 8-{(R)-2-[2-(3,5-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил} -6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

гидрохлорид 8-{(R)-2-[2-(4-этоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

гидрохлорид 8-{(R)-2-[2-(4-фторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

малеинат 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4,]оксазин-3-она,

салицилат 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4,]оксазин-3-она,

сукцинат 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4,]оксазин-3-она,

фумарат 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4,]оксазин-3-она,

малеинат 8-{(R)-2-[2-(2,4-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

салицилат 8-{(R)-2-[2-(2,4-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

сукцинат 8-{(R)-2-[2-(2,4-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

фумарат 8-{(R)-2-[2-(2,4-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил} -6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

малеинат 8-{(R)-2-[2-(3,5-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

салицилат 8-{(R)-2-[2-(3,5-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил} -6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

сукцинат 8-{(R)-2-[2-(3,5-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

фумарат 8-{(R)-2-[2-(3,5-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

малеинат 8-{(R)-2-[2-(4-этоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

салицилат 8-{(R)-2-[2-(4-этоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

сукцинат 8-{(R)-2-[2-(4-этоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

фумарат 8-{(R)-2-[2-(4-этоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

малеинат 8-{(R)-2-[2-(4-фторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

салицилат 8-{(R)-2-[2-(4-фторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

сукцинат 8-{(R)-2-[2-(4-фторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она и

фумарат 8-{(R)-2-[2-(4-фторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она, необязательно в виде их таутомеров, смесей таутомеров, гидратов или сольватов.

Наиболее предпочтительны далее энантиомерночистые соединения общей формулы 1, в которой R¹, R², R³, R⁴ и Х^- имеют указанные выше значения, в кристаллической форме, необязательно в виде их кристаллических таутомеров, кристаллических гидратов или кристаллических сольватов. Особенно предпочтительны при этом энантиомерночистые кристаллические соединения общей формулы 1, в которой R¹, R², R³, R⁴ и X^- имеют указанные выше значения, необязательно в виде их кристаллических таутомеров, кристаллических гидратов или кристаллических сольватов, отличающиеся также тем, что они представляют собой кристаллические соединения, представленные только в одной единственной кристаллической модификации.

Под соединениями, представленными лишь в одной единственной кристаллической модификации, при этом подразумеваются кристаллические соединения формулы I, которые не представляют собой смесь возможно существующих полиморфных кристаллических модификаций.

Предлагаемые в изобретении соединения формулы 1 обладают разнообразными возможностями их применения в терапии. Особо следует при этом отметить возможность применения предлагаемых в изобретении соединений формулы 1 для лечения тех заболеваний, при которых соединения формулы 1 благодаря их фармацевтической эффективности предпочтительно могут использоваться в качестве бетамиметика.

В соответствии с этим еще одним объектом настоящего изобретения являются указанные выше энантиомерночистые соединения формулы 1, в качестве лекарственных средств. Изобретение относится далее к применению указанных выше энантиомерночистых соединений общей формулы 1, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболеваний дыхательных путей.

В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к применению описанных выше соединений общей формулы 1 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболеваний дыхательных путей, выбранных из группы, включающей обструктивные заболевания легких различного генеза, эмфиземы легких различного генеза, рестриктивные заболевания легких, интерстициальные заболевания легких, кистозный фиброз, бронхиты различного генеза, бронхоэктазии, респираторный дистресс-синдром у взрослых (РДСВ) и все формы отека легких.

Предпочтительно применение соединений общей формулы 1 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения обструктивных заболеваний легких, выбранных из группы, включающей хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), бронхиальную астму, детскую астму, тяжелую астму, острый приступ астмы и хронический бронхит, а особенно предпочтительно согласно изобретению применение для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения бронхиальной астмы.

Предпочтительно далее применение соединений общей формулы 1 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения эмфизем легких, причиной которых является ХОЗЛ или дефицит ингибиторов α1-протеиназы.

Предпочтительно далее применение соединений общей формулы 1 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рестриктивных заболеваний легких, выбранных из группы, включающей аллергический альвеолит, вызванные профессиональными вредностями рестриктивные заболевания легких, такие как асбестоз или силикоз, и рестрикцию вследствие опухолей легких, таких, например, как лимфангиоз (Lymphangiosis carcinomatosd), бронхоальвеолярный рак и лимфомы.

Предпочтительно далее применение соединений общей формулы 1 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения интерстициальных заболеваний легких, выбранных из группы, включающей инфекционные пневмонии, например, вследствие инфекции вирусами, бактериями, грибами, простейшими, гельминтами или иными возбудителями, пневмонит различного генеза, такой, например, как аспирация и недостаточность левых отделов сердца, лучевой пневмонит или фиброз, коллагенозы, такие, например, как красная волчанка, системная склеродермия или саркоидоз, гранулематозы, такие, например, как болезнь Бека, идиопатическая интерстициальная пневмония или идиопатический фиброз легких (ИФЛ).

Предпочтительно далее применение соединений общей формулы 1 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения кистозного фиброза, соответственно муковисцидоза.

Предпочтительно далее применение соединений общей формулы 1 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения бронхитов, таких, например, как бронхит вследствие бактериальной или вирусной инфекции, аллергический бронхит и токсический бронхит.

Предпочтительно далее применение соединений общей формулы 1 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения бронхоэктазий.

Предпочтительно далее применение соединений общей формулы 1 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения РДСВ.

Предпочтительно далее применение соединений общей формулы 1 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения отеков легких, например, токсического отека легких после аспирации или вдыхания токсических веществ и чужеродных веществ.

В особенно предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к применению соединений формулы 1 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения астмы или ХОЗЛ. Особое значение имеет далее указанное выше применение соединений формулы 1 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для однократного в сутки применения при лечении воспалительных и обструктивных заболеваний дыхательных путей, наиболее предпочтительно для однократного в сутки применения при лечении астмы или ХОЗЛ.

Настоящее изобретение относится далее к способу лечения указанных выше заболеваний, отличающемуся тем, что в организм в терапевтически эффективных количествах вводят одно или несколько описанных выше соединений общей формулы 1. В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения астмы или ХОЗЛ, отличающемуся тем, что в организм в терапевтически эффективных количествах один раз в сутки вводят одно или несколько описанных выше соединений общей формулы 1.

В контексте настоящего описания под алкильными группами подразумеваются, если не указано иное, разветвленные и неразветвленные алкильные группы с 1-4 атомами углерода. В качестве примера таких групп можно назвать метил, этил, пропил или бутил. Для обозначения подобных групп, т.е. метила, этила, пропила или же бутила, в некоторых случаях используются также соответствующие им сокращенные названия Me, Et, Prop или Bu. Если не указано иное, то в понятия "пропил" и "бутил" включены также все возможные изомерные формы каждого из таких остатков. Так, например, в понятие "пропил" включены н-пропил и изопропил, в понятие "бутил" включены изобутил, втор-бутил и трет-бутил и т.д.

Под алкиленовыми группами имеются в виду, если не указано иное, разветвленные и неразветвленные алкильные мостики с двумя связями и с 1-4 атомами углерода. В качестве примера при этом можно назвать метилен, этилен, н-пропилен или н-бутилен.

Под алкилоксигруппами (или же -О-алкильными группами) подразумеваются, если не указано иное, разветвленные и неразветвленные алкильные группы с 1-4 атомами углерода, присоединенные через атом кислорода. В качестве примера при этом можно назвать метилокси-, этилокси-, пропилокси- или бутилоксигруппу. В некоторых случаях для обозначения таких групп, т.е. метилокси-, этилокси-, пропилокси- или же бутилоксигруппы, используются также соответствующие им сокращенные названия МеО-, ЕtO-, РrорО- или ВuО-. Если не указано иное, то в понятия "пропилоксигруппа" и "бутилоксигруппа" включены также все возможные изомерные формы каждого из таких остатков. Так, например, в понятие "пропилоксигруппа" включены н-пропилоксигруппа и изопропилоксигруппа, в понятие "бутилоксигруппа" включены изобутилоксигруппа, втор-бутилоксигруппа и трет-бутилоксигруппа и т.д. В некоторых случаях в настоящем описании вместо обозначения "алкилоксигруппа" используется также эквивалентное ему понятие "алкоксигруппа". В соответствии с этим для обозначения таких групп, как метилокси-, этилокси-, пропилокси- или же бутилоксигруппа, в некоторых случаях используются эквивалентные им понятия метокси-, этокси-, пропокси- или бутоксигруппа.

Под галогеном в контексте настоящего описания подразумевается фтор, хлор, бром или иод. Если не указано иное, то фтор, хлор и бром являются предпочтительными галогенами.

Выражение "энантиомерночистый" используется согласно настоящему изобретению для описания соединений формулы 1 которые представлены в виде чистых энантиомеров с чистотой по меньшей мере 85% ее, предпочтительно по меньшей мере 90% ее, наиболее предпочтительно не менее 95% ее. Сокращенное обозначение "ее" (от англ. "enantiomeric excess", энантиомерный избыток) известно в уровне технике и характеризует степень оптической чистоты хиральных соединений.

Предлагаемые в изобретении соединения можно получать способом, проиллюстрированным ниже на схеме 1.

Схема 1

В показанных на схеме 1 соединениях формул 2-5 и 7 группа OPG представляет собой защищенную защитной группой (PG) функциональную гидроксигруппу. Защитные группы, пригодные для защиты гидроксигруппы, широко описаны в уровне технике, например, в Protective Groups in Organic Synthesis, T.W. Greene и P.G.M. Wuts, изд-во John Wiley & Sons Inc, 3-е изд., 1999. В предпочтительном варианте группа OPG представляет собой -O-С₁-С₄алкил, -O-бензил или -O-СО-С₁-С₄алкил, предпочтительно -O-метил, -O-бензил или -O-ацетил, более предпочтительно -O-метил или -O-бензил, наиболее предпочтительно -O-бензил.

В показанных на схеме 1 соединениях формул 3 и 4 группа L представляет собой уходящую группу. В предпочтительном варианте уходящая группа L представляет собой хлор, бром, иод, метансульфонат, трифторметансульфонат или n-толуолсульфонат, предпочтительно хлор или бром, наиболее предпочтительно хлор.

В показанных на схеме 1 соединениях формул 6 и 7 остатки R¹, R², R³ и R⁴ могут иметь указанные для них выше значения.

Исходя из 8-ацетил-6-бензилокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она (2) известным из уровня техники методом получают соединения общей формулы 3. Затем соединения формулы 3 энантиоселективно переводят в присутствии хирального катализатора на основе переходного металла в хиральный спирт общей формулы 4, из которого после этого в соответствующих реакционных условиях получают хиральный оксиран формулы 5. Методы энантиоселективного синтеза оксиранов известны из уровня техники (см., например, Hamada и др., Org. Letters 4, 2002, с.4373-4376). Далее взаимодействием оксиранов формулы 5 с аминами формулы 6 получают соединения формулы 7, которые после отщепления защитной группы (PG) можно перевести в соли формулы 1.

С учетом той центральной роли, которую они играют в качестве промежуточного продукта при синтезе предлагаемых в изобретении соединений 1, еще одним объектом настоящего изобретения являются соединения формулы 5 как таковые

где группа OPG представляет собой защищенную защитной группой (PG) функциональную гидроксигруппу, предпочтительно -O-С₁-С₄алкил, -O-бензил или -O-СО-С₁-С₄алкил, более предпочтительно -O-метил, -O-бензил или -O-ацетил, особенно предпочтительно -O-метил или -O-бензил, наиболее предпочтительно -O-бензил.

Следующим объектом настоящего изобретения является применение соединения формулы 5, где группа OPG может иметь указанные выше значения, в качестве исходного соединения для получения соединения формулы 1, где группы R¹, R², R³, R⁴ и Х^- могут иметь указанные выше значения. Еще одним объектом настоящего изобретения является применение соединения формулы 5, где группа OPG может иметь указанные выше значения, для получения соединения формулы 1, где группы R¹, R², R³, R⁴ и Х^- могут иметь указанные выше значения.

С учетом той центральной роли, которую они играют в качестве промежуточного продукта при синтезе предлагаемых в изобретении соединений 1, еще одним объектом настоящего изобретения являются соединения формулы 7 как таковые

где группа OPG представляет собой защищенную защитной группой (PG) функциональную гидроксигруппу, предпочтительно -O-С₁-С₄алкил, -O-бензил или -O-СО-С₁-С₄алкил, более предпочтительно -O-метил, -O-бензил или -O-ацетил, особенно предпочтительно -O-метил или -O-бензил, наиболее предпочтительно -O-бензил, а группы R¹, R², R³ и R⁴ могут иметь указанные выше значения.

Следующим объектом настоящего изобретения является применение соединения формулы 7, где группы OPG, R¹, R², R³ и R⁴ могут иметь указанные выше значения, в качестве промежуточного продукта при получении соединения формулы 1, где группы R¹, R², R³ и R⁴ и X^- могут иметь указанные выше значения. Еще одним объектом настоящего изобретения является применение соединения формулы 7, где группы OPG, R¹, R², R³ и R⁴ могут иметь указанные выше значения, для получения соединения формулы 1, где группы R¹, R², R³, R⁴ и Х^- могут иметь указанные выше значения.

Энантиомерночистые соединения формулы 1 в некоторых случаях можно также получать способом, проиллюстрированным ниже на схеме 2.

Схема2

Получаемое в соответствии со схемой 1 соединение формулы 7 затем при необходимости можно сначала переводить в свободные основания формулы 1', где остатки R¹, R², R³ и R⁴ могут иметь указанные выше значения. Эти свободные основания формулы 1¹ взаимодействием с приемлемой кислотой Н-Х переводят в соединения формулы 1, которые можно получать в кристаллической форме осаждением в пригодном для этой цели растворителе, например, в спирте, предпочтительно в спирте, выбранном из изопропанола, этанола, метанола и необязательно их смесей, в частности, из смеси изопропанола с метанолом.

С учетом той центральной роли, которую они играют в качестве возможных промежуточных продуктов при синтезе предлагаемых в изобретении соединений 1, еще одним объектом настоящего изобретения являются соединения формулы 1' как таковые

где группы R¹, R², R³ и R⁴ могут иметь указанные выше значения.

Следующим объектом настоящего изобретения является применение соединения формулы 1', где R¹, R², R³ и R⁴ могут иметь указанные выше значения, в качестве промежуточного продукта при получении соединения формулы 1, где группы R¹, R², R³, R⁴ и X^- могут иметь указанные выше значения. Еще одним объектом настоящего изобретения является применение соединения формулы 1', где R¹, R², R³ и R⁴ могут иметь указанные выше значения, для получения соединения формулы 1, где группы R¹, R², R³, R⁴ и Х^- могут иметь указанные выше значения.

Рассмотренные выше реакции более подробно описаны в последующей экспериментальной части на примерах. При этом представленные ниже примеры синтеза новых, предлагаемых в изобретении соединений служат для пояснения настоящего изобретения. Однако эти примеры, которые служат для более подробного пояснения настоящего изобретения, носят исключительно иллюстративный характер и не ограничивают его объем описанными ниже конкретными вариантами его осуществления.

Пример 1: Гидрохлорид 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она

а) 1-(5-бензилокси-2-гидрокси-3-нитрофенил)этанон

К раствору 81,5 г (0,34 моля) 1-(5-бензилокси-2-гидроксифенил)этанона в 700 мл уксусной кислоты при охлаждении ледяной баней по каплям добавляют 18 мл дымящей азотной кислоты таким образом, чтобы температура не поднималась выше 20°С. Далее реакционную смесь перемешивают в течение двух часов при комнатной температуре, после чего сливают в смесь воды со льдом и фильтруют. Продукт перекристаллизовывают в изопропаноле, кристаллы отделяют вакуум-фильтрацией и промывают изопропанолом и диизопропиловым эфиром.

Выход: 69,6 г (72%).

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=288.

б) 1-(3-амино-5-бензилокси-2-гидроксифенил)этанон

69,5 г (242 ммоля) 1-(5-бензилокси-2-гидрокси-3-нитрофенил)этанона растворяют в 1,4 л метанола и гидрируют при давлении 3 бара и комнатной температуре в присутствии 14 г родия на угле (10%-ного) в качестве катализатора. После этого катализатор отфильтровывают и фильтрат концентрируют. Остаток без дополнительной очистки используют в последующей реакции.

Выход: 60,0 г (96%).

Значение R_f: 0,45 (дихлорметан на силикагеле).

в) 8-ацетил-6-бензилокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-он

К 60,0 г (233 ммоля) 1-(3-амино-5-бензилокси-2-гидроксифенил)этанона и 70,0 г (506 ммолей) карбоната калия при охлаждении ледяной баней по каплям добавляют 21,0 мл (258 ммолей) хлорацетилхлорида. После этого смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре, а затем в течение 6 ч при кипячении с обратным холодильником. Далее горячую реакционную смесь фильтруют, после чего концентрируют до объема примерно 400 мл и смешивают со смесью воды со льдом. Выпавший осадок отделяют вакуум-фильтрацией, сушат и очищают хроматографией на короткой силикагелевой колонке (дихлорметан/метанол в соотношении 99:1). Содержащие продукт фракции концентрируют, суспендируют в изопропаноле/диизопропиловом эфире, подвергают вакуум-фильтрации и промывают диизопропиловым эфиром.

Выход: 34,6 г (50%).

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=298.

г) 6-бензилокси-8-(2-хлорацетил)-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-он

13,8 г (46,0 ммолей) 8-ацетил-6-бензилокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она и 35,3 г (101,5 ммоля) бензилтриметиламмонийдихлориодата в течение 5 ч перемешивают при 65°С в 250 мл дихлорэтана, 84 мл ледяной уксусной кислоты и 14 мл воды. После охлаждения до комнатной температуры смешивают с 5%-ным раствором гидросульфита натрия и перемешивают в течение 30 мин. Выпавшее в осадок твердое вещество отделяют вакуум-фильтрацией, промывают водой и диэтиловым эфиром и сушат.

Выход: 13,2 г (86%).

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=330/32.

д) 6-бензилокси-8-((R)-2-хлор-1-гидроксиэтил)-4Н-бензо[1,4]-оксазин-3-он

Синтез проводят аналогично описанному в литературе методу (Org. Lett. 4, 2002, с. 4373-4376). Для этого к 13,15 г (39,6 ммоля) 6-бензилокси-8-(2-хлор-ацетил)-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она и 25,5 мг (0,04 ммоля) Cp*RhCl[(S,S)-TsDPEN] (где Ср* обозначает пентаметилциклопентадиенил, a TsDPEN обозначает (1S,2S)-N-n-толуолсульфонил-1,2-дифенилэтилендиамин) в 40 мл диметилформамида при -15°С по каплям добавляют 8 мл смеси из муравьиной кислоты и триэтиламина (в молярном соотношении 5:2). Затем реакционную смесь в течение 5 ч перемешивают при этой температуре, после чего добавляют 25 мг катализатора и оставляют перемешиваться на ночь при -15°С. Далее реакционную смесь смешивают со смесью воды со льдом и фильтруют. Осадок на фильтре растворяют в дихлорметане, сушат над сульфатом натрия и удаляют растворитель. Остаток хроматографируют (градиент дихлорметана/метанола) и продукт перекристаллизовывают в диэтиловом эфире/диизопропиловом эфире.

Выход: 10,08 г (76%).

Значение R_f: 0,28 (дихлорметан/метанол в соотношении 50:1 на силикагеле).

е) 6-бензилокси-8-(R)-оксиранил-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-он

10,06 г (30,1 ммоля) 6-бензилокси-8-((R)-2-хлор-1-гидроксиэтил)-4Н-бензо[1,4]-оксазин-3-она растворяют в 200 мл диметилформамида. Полученный раствор при 0°С смешивают с 40 мл 2-молярного раствора едкого натра и в течение 4 ч перемешивают при этой температуре. После этого реакционную смесь сливают в смесь воды со льдом, перемешивают в течение 15 мин и затем фильтруют. Полученное твердое вещество промывают водой и сушат.

Выход: 8,60 г (96%).

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=298.

ж) 6-бензилокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино1этил}-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-он

5,25 г (17,7 ммоля) 6-бензилокси-8-(R)-оксиранил-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она и 6,30 г (35,1 ммоля) 2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламина смешивают с 21 мл изопропанола и в течение 30 мин перемешивают в закрытом реакционном сосуде при 135°С под воздействием микроволнового излучения. После этого отгоняют растворитель и остаток хроматографируют (оксид алюминия, градиент этилацетата/метанола). Полученный таким путем продукт дополнительно очищают путем перекристаллизации из смеси диэтилового эфира с диизопропиловым эфиром.

Выход: 5,33 г (63%).

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=477.

з) Гидрохлорид 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она

Суспензию 5,33 г (11,2 ммоля) 6-бензилокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4,]оксазин-3-она в 120 мл метанола смешивают с 0,8 г палладия на угле (10%-ного), нагревают до 50°С и гидрируют при давлении водорода 3 бара. После этого катализатор отделяют вакуум-фильтрацией и фильтрат концентрируют. Остаток растворяют в 20 мл изопропанола и добавляют 2,5 мл 5-молярного раствора соляной кислоты в изопропаноле. Продукт осаждают добавлением 200 мл диэтилового эфира, осадок отделяют вакуум-фильтрацией и сушат.

Выход: 4,50 г (95%, гидрохлорид).

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=387.

Аналогичным путем взаимодействием 6-бензилокси-8-(R)-оксиранил-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она (пример 1, стадия е) с соответствующим амином получают следующие соединения формулы 1.

Пример 2: Гидрохлорид 8-{(R)-2-[2-(2,4-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино1-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=393.

Пример 3: Гидрохлорид 8-{(R)-2-[2-(3,5-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=393.

Пример 4: Гидрохлорид 8-{(R)-2-[2-(4-этоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=401.

Пример 5: Гидрохлорид 8-{(R)-2-[2-(4-фторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=375.

Соединения формулы 1 при их получении описанными выше в качестве примеров методами синтеза в некоторых случаях могут образовываться не в виде единообразных кристаллических модификаций, и поэтому полученные соли формулы 1 может оказаться целесообразным перекристаллизовывать в пригодных для этой цели растворителях. Помимо этого из соединений, полученных в описанных выше примерах, можно известными из уровня техники методами получать другие соли.

В последующей части описания представлены примеры по получению единообразных солей формулы 1, наиболее пригодных для приготовления вводимых в организм путем ингаляции лекарственных форм.

Пример 6: Малеинат 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она

250 мг (0,65 ммоля) 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4,]оксазин-3-она смешивают с таким количеством этанола, что твердое вещество полностью переходит в раствор. После этого добавляют 75 мг (0,65 ммоля) малеиновой кислоты и способствующее кристаллизации вещество. Далее смесь охлаждают льдом, выпавшее в осадок твердое вещество отфильтровывают и промывают этанолом и диэтиловым эфиром. В полученной таким путем соли соотношение между кислотой и этаноламином составляет 1:1.

Выход: 254 мг (78%).

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=387.

Температура плавления 215°С.

Высококристаллический продукт детально исследовали рентгеновской порошковой дифрактометрией. Рентгеновскую порошковую дифрактограмму получали следующим путем. Для получения рентгеновских порошковых дифрактограмм согласно изобретению использовали дифрактометр Bruker D8 Advanced, оснащенный позиционно-чувствительным детектором (детектором оптического излучения) (К_α-излучение меди, λ=1,5418 Å, 30 кВ, 40 мА).

Для высококристаллического продукта были получены помимо прочего следующие характеристические значения d_hkl [Å], соответствующие определенным межплоскостным расстояниям в ангстремах (Å): d=21,68 Å, 8,62 Å, 5,92 Å, 5,01 Å, 4,59 Å, 4,36 Å, 3,64 Å и 3,52 Å.

Пример 7: Салицилат 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она

250 мг (0,65 ммоля) 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4,]оксазин-3-она растворяют в небольшом количестве этанола и смешивают с 90 мг (0,65 ммоля) салициловой кислоты. После добавления способствующего кристаллизации вещества смесь оставляют стоять на ночь, за которую в осадок выпадает твердое вещество. К смеси затем добавляют диэтиловый эфир и через 30 мин фильтруют. Полученное таким путем белое твердое вещество промывают диэтиловым эфиром и сушат.

Выход: 295 мг (87%).

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=387.

Температура плавления 215°С.

Высококристаллический продукт детально исследовали рентгеновской порошковой дифрактометрией. Рентгеновскую порошковую дифрактограмму получали следующим путем. Для получения рентгеновских порошковых дифрактограмм согласно изобретению использовали дифрактометр Bruker D8 Advanced, оснащенный позиционно-чувствительным детектором (детектором оптического излучения) (К_α-излучение меди, λ=1,5418 Å, 30 кВ, 40 мА).

Для высококристаллического продукта были получены помимо прочего следующие характеристические значения d_hkl [Å], соответствующие определенным межплоскостным расстояниям в ангстремах (Å): d=9,06 Å; 8,36 Å; 8,02 Å; 6,84 Å; 6,73 Å; 4,48 Å; 4,35 Å и 4,27 Å.

Пример 8: Сукцинат 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она

500 мг (1,2 ммоля) гидрохлорида 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4,]оксазин-3-она смешивают с этилацетатом, путем встряхивания экстрагируют водным раствором карбоната калия, органическую фазу сушат над сульфатом натрия и удаляют растворитель. Остаток растворяют в небольшом количестве этанола и смешивают с 140 мг (1,2 ммоля) янтарной кислоты. По истечении 2 ч выпавшее в осадок твердое вещество отделяют вакуум-фильтрацией и промывают холодным этанолом и диэтиловым эфиром. В полученной таким путем соли соотношение между этаноламином и кислотой составляет 1:0,5.

Выход: 468 мг (85%).

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=387.

Температура плавления 115°С.

Высококристаллический продукт детально исследовали рентгеновской порошковой дифрактометрией. Рентгеновскую порошковую дифрактограмму получали следующим путем. Для получения рентгеновских порошковых дифрактограмм согласно изобретению использовали дифрактометр Bruker D8 Advanced, оснащенный позиционно-чувствительным детектором (детектором оптического излучения) (К_α-излучение меди, λ=1,5418 Å, 30 кВ, 40 мА).

Для высококристаллического продукта были получены помимо прочего следующие характеристические значения d_hkl [Å], соответствующие определенным межплоскостным расстояниям в ангстремах (Å): d=14,35 Å; 8,49 Å; 7,37 Å; 7,25 Å; 5,47 Å; 4,78 Å; 4,14 Å и 3,59 Å.

Пример 9: Фумарат 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она

300 мг (0,71 ммоля) гидрохлорида 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4,]оксазин-3-она смешивают с этилацетатом и путем встряхивания экстрагируют водным раствором карбоната калия. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия и удаляют растворитель. Остаток растворяют в этаноле при добавлении нескольких капель воды. Далее добавляют 82 мг (0,71 ммоля) фумаровой кислоты и затравочные кристаллы и смесь оставляют стоять на ночь. Белое твердое вещество отделяют вакуум-фильтрацией, промывают диэтиловым эфиром и этанолом и сушат. В полученной таким путем соли соотношение между этаноламином и кислотой составляет 1:0,5.

Выход: 208 мг (63%).

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=387.

Температура плавления 130°С.

Высококристаллический продукт детально исследовали рентгеновской порошковой дифрактометрией. Рентгеновскую порошковую дифрактограмму получали следующим путем. Для получения рентгеновских порошковых дифрактограмм согласно изобретению использовали дифрактометр Bruker D8 Advanced, оснащенный позиционно-чувствительным детектором (детектором оптического излучения) (К_α-излучение меди, λ=1,5418 Å, 30 кВ, 40 мА).

Для высококристаллического продукта были получены помимо прочего следующие характеристические значения d_hkl [Å], соответствующие определенным межплоскостным расстояниям в ангстремах (Å): d=14,23 Å; 5,44 Å; 4,76 Å; 4,57 Å; 4,26 Å; 4,12 Å; 3,57 Å и 3,48 Å.

Пример 10: 6-гидрокси-8-{1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4,]оксазин-3-он (свободное основание)

Аналогично описанным выше примерам 500 мг (1,2 ммоля) гидрохлорида 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4,]оксазин-3-она сначала смешивают с этилацетатом. Далее органическую фазу путем встряхивания экстрагируют водным раствором карбоната калия, сушат над сульфатом натрия и удаляют растворитель. Полученное таким путем свободное основание растворяют в ацетонитриле при добавлении нескольких капель воды. Выпавшее в осадок твердое вещество отделяют вакуум-фильтрацией, промывают и сушат.

Выход: 168 мг (37%).

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=387.

Температура плавления 128°С.

Высококристаллический продукт детально исследовали рентгеновской порошковой дифрактометрией. Рентгеновскую порошковую дифрактограмму получали следующим путем. Для получения рентгеновских порошковых дифрактограмм согласно изобретению использовали дифрактометр Broker D8 Advanced, оснащенный позиционно-чувствительным детектором (детектором оптического излучения) (К_α-излучение меди, λ=1,5418 Å, 30 кВ, 40 мА).

Для высококристаллического продукта были получены помимо прочего следующие характеристические значения d_hkl [Å], соответствующие определенным межплоскостным расстояниям в ангстремах (Å): d=14,96 Å; 9,63 Å; 7,05 Å; 5,57 Å; 5,28 Å; 5,05 Å; 4,63 Å и 3,73 Å.

Пример 11: Гидрохлорид 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она

300 мг (0,71 ммоля) гидрохлорида 6-гидрокси-8-{(R)-1-гидрокси-2-[2-(4-метоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]этил}-4Н-бензо[1,4,]оксазин-3-она растворяют путем нагрева в 4 мл изопропанола. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры и затем на 15 мин помещают в ледяную баню. Выпавшее в осадок твердое вещество отделяют вакуум-фильтрацией и сушат.

Выход: 180 мг (60%).

Масс-спектроскопия [М+Н]⁺=387.

Температура плавления 211°С.

Высококристаллический продукт детально исследовали рентгеновской порошковой дифрактометрией. Рентгеновскую порошковую дифрактограмму получали следующим путем. Для получения рентгеновских порошковых дифрактограмм согласно изобретению использовали дифрактометр Broker D8 Advanced, оснащенный позиционно-чувствительным детектором (детектором оптического излучения) (К_α-излучение меди, λ=1,5418 Å, 30 кВ, 40 мА).

Для высококристаллического продукта были получены помимо прочего следующие характеристические значения d_hkl [Å], соответствующие определенным межплоскостным расстояниям в ангстремах (Å): d=5,92 Å; 5,81 Å; 5,51 Å; 5,10 Å; 4,65 Å; 4,50 Å; 4,15 Å и 4,00 Å.

Аналогично описанным в примерах 6-11 методам можно получить следующие соединения:

пример 12: малеинат 8-{(R)-2-[2-(2,4-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 13: салицилат 8-{(R)-2-[2-(2,4-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 14: сукцинат 8-{(R)-2-[2-(2,4-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 15: фумарат 8-{(R)-2-[2-(2,4-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 16: малеинат 8-{(R)-2-[2-(3,5-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 17: салицилат 8-{(R)-2-[2-(3,5-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 18: сукцинат 8-{(R)-2-[2-(3,5-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 19: фумарат 8-{(R)-2-[2-(3,5-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил} -6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 20: малеинат 8-{(R)-2-[2-(4-этоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 21: салицилат 8-{(R)-2-[2-(4-этоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 22: сукцинат 8-{(R)-2-[2-(4-этоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 23: фумарат 8-{(R)-2-[2-(4-этоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 24: малеинат 8-{(R)-2-[2-(4-фторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 25: салицилат 8-{(R)-2-[2-(4-фторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 26: сукцинат 8-{(R)-2-[2-(4-фторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-она,

пример 27: фумарат 8-{(R)-2-[2-(4-фторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3 -она,

пример 28: 8-{(R)-2-[2-(2,4-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-он (свободное основание),

пример 29: 8-{(R)-2-[2-(3,5-дифторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1-гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-он (свободное основание),

пример 30: 8-{(R)-2-[2-(4-этоксифенил)-1,1-диметилэтиламино]-1 -гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-он (свободное основание), а также

пример 31: 8-{(R)-2-[2-(4-фторфенил)-1,1-диметилэтиламино]-1 -гидроксиэтил}-6-гидрокси-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-он (свободное основание).

Соединения общей формулы 1 можно применять индивидуально или в сочетании с другими предлагаемыми в изобретении действующими веществами формулы 1. При определенных условиях соединения общей формулы 1 можно также применять в сочетании с фармакологически активными действующими веществами другого типа. В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится также к лекарственным комбинациям, которые наряду с одним или несколькими соединениями формулы 1, предпочтительно одним соединением формулы 1, содержат в качестве действующего вещества другого типа одно или несколько соединений, выбранных из классов антихолинергических средств, ингибиторов фосфодиэстеразы типа IV (PDE IV), стероидов, антагонистов LTD4 и ингибиторов EGFR-киназы.

Предпочтительно при этом применение антихолинергических средств, а особый интерес представляет применение соединений, выбранных из бромидов и хлоридов таких катионов, как тиотропий, окситропий, флутропий, ипратропий, гликопирроний и троспий. Особое значение имеет применение тиотропийбромида, предпочтительно в виде его кристаллического моногидрата, известного из WO 02/30928. При использовании тиотропийбромида в предлагаемых в изобретении лекарственных комбинациях в безводной форме предпочтительно применять безводный кристаллический тиотропийбромид, который известен из WO 03/000265.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в качестве антихолинергического средства используют соединение

необязательно в виде его энантиомеров.

В качестве антихолинергических средств в сочетании с соединениями формулы 1 в некоторых случаях используют также следующие соединения:

метобромид тропенолового эфира 2,2-дифенилпропионовой кислоты,

метобромид скопинового эфира 2,2-дифенилпропионовой кислоты,

метобромид скопинового эфира 2-фтор-2,2-дифенилуксусной кислоты,

метобромид тропенолового эфира 2-фтор-2,2-дифенилуксусной кислоты,

метобромид тропенолового эфира 3,3',4,4'-тетрафторбензиловой кислоты,

метобромид скопинового эфира 3,3',4,4'-тетрафторбензиловой кислоты,

метобромид тропенолового эфира 4,4'-дифторбензиловой кислоты,

метобромид скопинового эфира 4,4'-дифторбензиловой кислоты,

метобромид тропенолового эфира 3,3'-дифторбензиловой кислоты,

метобромид скопинового эфира 3,3'-дифторбензиловой кислоты,

метобромид тропенолового эфира 9-гидроксифлуорен-9-карбоновой кислоты,

метобромид тропенолового эфира 9-фторфлуорен-9-карбоновой кислоты,

метобромид скопинового эфира 9-гидроксифлуорен-9-карбоновой кислоты,

метобромид скопинового эфира 9-фторфлуорен-9-карбоновой кислоты,

метобромид тропенолового эфира 9-метилфлуорен-9-карбоновой кислоты,

метобромид скопинового эфира 9-метилфлуорен-9-карбоновой кислоты,

метобромид циклопропилтропинового эфира бензиловой кислоты,

метобромид циклопропилтропинового эфира 2,2-дифенилпропионовой кислоты,

метобромид циклопропилтропинового эфира 9-гидроксиксантен-9-карбоновой кислоты,

метобромид циклопропилтропинового эфира 9-метилфлуорен-9-карбоновой кислоты,

метобромид циклопропилтропинового эфира 9-метилксантен-9-карбоновой кислоты,

метобромид циклопропилтропинового эфира 9-гидроксифлуорен-9-карбоновой кислоты,

метобромид циклопропилтропинового эфира метилового эфира 4,4'-дифторбензиловой кислоты,

метобромид тропенолового эфира 9-гидроксиксантен-9-карбоновой кислоты,

метобромид скопинового эфира 9-гидроксиксантен-9-карбоновой кислоты,

метобромид тропенолового эфира 9-метилксантен-9-карбоновой кислоты,

метобромид скопинового эфира 9-метилксантен-9-карбоновой кислоты,

метобромид тропенолового эфира 9-этилксантен-9-карбоновой кислоты,

метобромид тропенолового эфира 9-дифторметилксантен-9-карбоновой кислоты или

метобромид скопинового эфира 9-гидроксиметилксантен-9-карбоновой кислоты.

При использовании в сочетании с одним или несколькими соединениями общей формулы 1 ингибиторов PDE IV их предпочтительно выбирать из группы, включающей энпрофиллин, теофиллин, рофлумиласт, арифло (циломиласт), СР-325,366, BY343, D-4396 (Sch-351591), AWD-12-281 (GW-842470), N-(3,5-дихлор-1-оксопиридин-4-ил)-4-дифторметокси-3-циклопропилметоксибензамид, NCS-613, пумафентин, (-)n-[(4aR*, 10bS*)-9-этокси-1,2,3,4,4а,10b-гексагидро-8-метокси-2-метилбензо[s][1,6]нафтиридин-6-ил]-N,N-диизопропилбензамид, (R)-(+)-1-(4-бромбензил)-4-[(3-циклопентилокси)-4-метоксифенил]-2-пирролидон, 3-(циклопентилокси-4-метоксифенил)-1 -(4-N'-[N-2-циано-8-метилизотиоуреидо]бензил)-2-пирролидон, цис-[4-циано-4-(3-циклопентилокси-4-метоксифенил)циклогексан-1-карбоновую кислоту], 2-карбометокси-4-циано-4-(3-циклопропилметокси-4-дифторметоксифенил)циклогексан-1-он, цис-[4-циано-4-(3-циклопропилметокси-4-дифторметоксифенил)циклогексан-1-ол], (R)-(+)-этил[4-(3-циклопентилокси-4-метоксифенил)пирролидин-2-илиден]ацетат, (S)-(-)-этил[4-(3-циклопентилокси-4-метоксифенил)пирролидин-2-илиден]ацетат, CDP840, Bay-198004, D-4418, PD-168787, Т-440, Т-2585, арофиллин, атизорам, V-11294A, Cl-1018, CDC-801, CDC-3052, D-22888, YM-58997, Z-15370, 9-циклопентил-5,6-дигидро-7-этил-3-(2-тиенил)-9Н-пиразоло[3,4-с]-1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин и 9-циклопентил-5,6-дигидро-7-этил-3-(трет-бутил)-9H-пиразоло[3,4-с]-1,2,4-триазоло[4,3-а]пиридин, необязательно в виде их рацематов, энантиомеров или диастереомеров и необязательно в виде их фармакологически приемлемых кислотно-аддитивных солей, сольватов и/или гидратов. Под кислотно-аддитивными солями с фармакологически приемлемыми кислотами при этом подразумеваются, например, соли, выбранные из группы, включающей гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, гидросульфат, гидрофосфат, гидрометансульфонат, гидронитрат, гидромалеат, гидроацетат, гидробензоат, гидроцитрат, гидрофумарат, гидротартрат, гидрооксалат, гидросукцинат, гидробензоат и гидро-n-толуолсульфонат, предпочтительно гидрохлорид, гидробромид, гидросульфат, гидрофосфат, гидрофумарат и гидрометансульфонат.

При использовании в сочетании с одним или несколькими соединениями общей формулы 1 стероидов их предпочтительно выбирать из группы, включающей преднизолон, преднизон, бутиксокортпропионат, RPR-106541, флунисолид, беклометазон, триамцинолон, будесонид, флутиказон, мометазон, циклесонид, рофлепонид, ST-126, дексаметазон, (S)-фторметиловый эфир 6α,9α-дифтор-17α-[(2-фуранилкарбонил)окси]-11β-гидрокси-16α-метил-3-оксоандроста-1,4-диен-17β-карботионовой кислоты и (S)-(2-оксотетрагидрофуран-3S-иловый) эфир 6α,9α-дифтор-11β-гидрокси-16α-метил-3-оксо-17α-пропионилоксиандроста-1,4-диен-17β-карботионовой кислоты, необязательно в виде их рацематов, энантиомеров или диастереомеров и необязательно в виде их солей и производных, их сольватов и/или гидратов. При каждом упоминании стероидов подразумеваются также их возможно существующие соли или производные, гидраты или сольваты. В качестве примеров возможных солей и производных стероидов можно назвать соли с щелочными металлами, такие как натриевые или калиевые соли, сульфобензоаты, фосфаты, изоникотинаты, ацетаты, пропионаты, дигидрофосфаты, пальмитаты, пивалаты или же фуроаты.

При использовании в сочетании с одним или несколькими соединениями общей формулы 1 антагонистов LTD4 их предпочтительно выбирать из группы, включающей монтелукаст, 1-(((R)-(3-(2-(6,7-дифтор-2-хинолинил)этенил)фенил)-3-(2-(2-гидрокси-2-пропил)фенил)тио)метилцикло-пропануксусную кислоту, 1-(((1(R)-3(3-(2-(2,3-дихлортиено[3,2-b]пиридин-5-ил)-(Е)-этенил)фенил)-3-(2-(1-гидрокси-1-метилэтил)фенил)пропил)тио)метил)циклопропануксусную кислоту, пранлукаст, зафирлукаст, [2-[[2-(4-трет-бутил-2-тиазолил)-5-бензофуранил]оксиметил]фенил]уксусную кислоту, МСС-847 (ZD-3523), MN-001, MEN-91507 (LM-1507), VUF-5078, VUF-K-8707 и L-733321, необязательно в виде их рацематов, энантиомеров или диастереомеров, необязательно в виде их фармакологически приемлемых кислотно-аддитивных солей, а также необязательно в виде их солей и производных, их сольватов и/или гидратов. Под кислотно-аддитивными солями, которые в некоторых случаях антагонисты LTD4 способны образовывать с фармакологически приемлемыми кислотами, подразумеваются, например, соли, выбранные из группы, включающей гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, гидросульфат, гидрофосфат, гидрометансульфонат, гидронитрат, гидромалеат, гидроацетат, гидробензоат, гидроцитрат, гидрофумарат, гидротартрат, гидрооксалат, гидросукцинат, гидробензоат и гидро-n-толуолсульфонат, предпочтительно гидрохлорид, гидробромид, гидросульфат, гидрофосфат, гидрофумарат и гидрометансульфонат. Под солями или производными, которые в некоторых случаях способны образовывать антагонисты LTD4, подразумеваются, например, соли с щелочными металлами, такие как натриевые или калиевые соли, соли с щелочноземельными металлами, сульфобензоаты, фосфаты, изоникотинаты, ацетаты, пропионаты, дигидрофосфаты, пальмитаты, пивалаты или же фуроаты.

При использовании в сочетании с одним или несколькими соединениями общей формулы 1 ингибиторов EGFR-киназы их предпочтительно выбирать из группы, включающей 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-{[4-(морфолин-4-ил)-1-оксо-2-бутен-1-ил]амино}-7-циклопропилметоксихиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-{[4-((R)-6-метил-2-оксоморфолин-4-ил)-1-оксо-2-бутен-1-ил]амино}-7-[(S)-(тетрагидрофуран-3-ил)окси]хиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-[2-((S)-6-метил-2-оксоморфолин-4-ил)этокси]-7-метоксихиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-({4-[N-(2-метоксиэтил)-N-метиламино]-1-оксо-2-бутен-1-ил }амино)-7-циклопропилметоксихиназолин, 4-[(3-этинилфенил)амино]-6,7-бис-(2-метоксиэтокси)хиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-{[4-(морфолин-4-ил)-1-оксо-2-бутен-1-ил]амино}-7-[(тетрагидрофуран-2-ил)метокси]хиназолин, 4-[(3-этинилфенил)амино]-6-{[4-(5,5-диметил-2-оксоморфолин-4-ил)-1-оксо-2-бутен-1-ил]амино}хиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-(транс-4-метансульфониламиноциклогексан-1-илокси)-7-метоксихиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-(тетрагидропиран-3-илокси)-7-метоксихиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-{1-[(морфолин-4-ил)карбонил]пиперидин-4-илокси}-7-метоксихиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-{1-[2-(2-оксопирролидин-1-ил)этил]пиперидин-4-илокси}-7-метоксихиназолин, 4-[(3-этинилфенил)амино]-6-(1-ацетилпиперидин-4-илокси)-7-метоксихиназолин, 4-[(3-этинилфенил)амино]-6-(1-метилпиперидин-4-илокси)-7-метоксихиназолин, 4-[(3-этинилфенил)амино]-6-(1-метансульфонилпиперидин-4-илокси)-7-метоксихиназолин, 4-[(3-этинилфенил)амино]-6-{1-[(морфолин-4-ил)карбонил]пиперидин-4-илокси}-7-метоксихиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-{1-[(2-метоксиэтил)карбонил]пиперидин-4-илокси}-7-метоксихиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-[цис-4-(N-метансульфонил-N-метиламино)циклогексан-1-илокси]-7-метоксихиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-[цис-4-(N-ацетил-N-метиламино)циклогексан-1-илокси]-7-метоксихиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-(транс-4-метиламиноциклогексан-1-илокси)-7-метоксихиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-[транс-4-(N-метансульфонил-N-метиламино)циклогексан-1-илокси]-7-метоксихиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-(транс-4-диметиламиноциклогексан-1-илокси)-7-метоксихиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-(транс-4-{N-[(морфолин-4-ил)карбонил]-N-метиламино}циклогексан-1-илокси)-7-метоксихиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-[2-(2,2-диметил-6-оксоморфолин-4-ил)этокси]-7-[(S)-(тетрагидрофуран-2-ил)метокси]хиназолин, 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-(1-метансульфонилпиперидин-4-илокси)-7-метоксихиназолин и 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-6-(1-цианопиперидин-4-илокси)-7-метоксихиназолин, необязательно в виде их рацематов, энантиомеров или диастереомеров, а также необязательно в виде их фармакологически приемлемых кислотно-аддитивных солей, их сольватов и/или гидратов. Под кислотно-аддитивными солями, которые в некоторых случаях указанные выше ингибиторы EGFR-киназы способны образовывать с фармакологически приемлемыми кислотами, подразумеваются, например, соли, выбранные из группы, включающей гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, гидросульфат, гидрофосфат, гидрометансульфонат, гидронитрат, гидромалеат, гидроацетат, гидробензоат, гидроцитрат, гидрофумарат, гидротартрат, гидрооксалат, гидросукцинат, гидробензоат и гидро-n-толуолсульфонат, предпочтительно гидрохлорид, гидробромид, гидросульфат, гидрофосфат, гидрофумарат и гидрометансульфонат.

В качестве примера лекарственных форм, пригодных для введения в организм в их составе соединений формулы 1, можно назвать таблетки, капсулы, суппозитории, растворы, порошки и т.д. На долю фармацевтически активного(-ых) соединения(-ий) в таких лекарственных формах должно приходиться в каждом случае от 0,05 до 90 мас.%, предпочтительно от 0,1 до 50 мас.%, от общей массы препарата.

Соответствующие таблетки можно изготавливать, например, смешением действующего вещества или действующих веществ с известными вспомогательными веществами, например, инертными разбавителями, такими как карбонат кальция, фосфат кальция или лактоза, разрыхлителями, такими как кукурузный крахмал или альгиновая кислота, связующими, такими как крахмал или желатин, смазывающими веществами, такими как стеарат магния или тальк, и/или средствами для обеспечения депо-эффекта, такими как карбоксиметилцеллюлоза, ацетофталат целлюлозы или поливинилацетат. Таблетки могут также состоять из нескольких слоев.

Соответствующим образом можно изготавливать драже нанесением на полученные аналогично таблеткам ядра покрытий из обычно применяемых в этих целях материалов, например, коллидона или шеллака, гуммиарабика, талька, диоксида титана или сахара. Ядра драже для обеспечения депо-эффекта или во избежание несовместимости также можно изготавливать многослойными. Равным образом и оболочка драже также может состоять для обеспечения депо-эффекта из нескольких слоев, при этом можно использовать вспомогательные вещества, указанные выше для таблеток.

В состав микстур с предлагаемыми в изобретении действующими веществами, соответственно комбинациями действующих веществ дополнительно могут входить также подслащивающее вещество, такое как сахарин, цикламат, глицерин или сахар, а также улучшитель вкуса, например, ароматизатор, такой как ванилин или апельсиновый экстракт. Помимо этого микстуры могут содержать суспендирующие вспомогательные вещества или загустители, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, смачиватели, например, продукты конденсации жирных спиртов с этиленоксидом, или защитные вещества (консерванты), такие как n-гидроксибензоаты.

Растворы получают по известной технологии, например, с добавлением придающих изотоничность агентов, консервантов, таких как n-гидроксибензоаты, или стабилизаторов, таких как соли этилендиаминтетрауксусной кислоты с щелочными металлами, и при необходимости с применением эмульгаторов и/или диспергаторов, при этом, например, при применении воды в качестве разбавителя при необходимости можно использовать органические растворители в качестве гидротропных солюбилизаторов, соответственно вспомогательных растворителей, и затем разливают по бутылкам для инъекций, ампулам или бутылкам для инфузии.

Капсулы, содержащие одно или несколько предлагаемых в изобретении соединений формулы 1, можно изготавливать, например, смешением действующих веществ с инертными носителями, такими как лактоза или сорбит, и расфасовыванием полученной смеси в желатиновые капсулы.

Соответствующие суппозитории можно изготавливать, например, смешением действующего вещества или действующих веществ с предусмотренными для этой цели носителями, такими как нейтральные жиры или полиэтиленгликоль, соответственно его производные.

В качестве примера вспомогательных веществ, которые можно использовать при изготовлении лекарственных форм, можно назвать воду, фармацевтически приемлемые (безвредные) органические растворители, такие как парафины (например, фракции минерального масла), масла растительного происхождения (например, арахисовое или кунжутное масло), моно- или полифункциональные спирты (например, этанол или глицерин), носители, такие как природная мука горных пород (например, каолин, глиноземы, тальк, мел), синтетическая мука горных пород (например, высокодисперсная кремниевая кислота и силикаты), сахара (например, тростниковый, молочный и виноградный сахар), эмульгаторы (например, лигнин, сульфитный щелок, метилцеллюлоза, крахмал и поливинилпирролидон) и скользящие вещества (например, стеарат магния, тальк, стеариновая кислота и лаурилсульфат натрия).

В состав предназначенных для приема внутрь таблеток помимо вышеуказанных носителей можно, как очевидно, включать также такие добавки, как, например, цитрат натрия, карбонат кальция и дикальцийфосфат, совместно с различного рода наполнителями, такими как крахмал, предпочтительно картофельный крахмал, желатин и т.п. Помимо этого при производстве таблеток могут использоваться также скользящие вещества, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк. В случае водных суспензий действующие вещества помимо вышеописанных вспомогательных веществ можно также смешивать с различного рода улучшителями вкуса или красителями.

При предусмотренном согласно изобретению наиболее предпочтительном применении соединений формулы 1 для терапии заболеваний дыхательных путей наиболее предпочтительно использовать вводимые в организм путем ингаляции лекарственные формы, соответственно фармацевтические композиции. В качестве примера ингалируемых лекарственных форм можно назвать ингаляционные порошки, дозированные аэрозоли с пропеллентом или ингаляционные растворы без пропеллента. В соответствии с настоящим изобретением под выражением "ингаляционные растворы без пропеллента" подразумеваются также концентраты или стерильные, готовые к применению ингаляционные растворы.

Соединения формулы 1, которые согласно изобретению наиболее предпочтительно использовать в кристаллической форме, предпочтительно применять для приготовления ингаляционных порошков. В применяемых согласно изобретению ингаляционных порошках кристаллические соединения формулы 1 могут содержаться либо индивидуально, либо в смеси с приемлемыми физиологически безвредными вспомогательными веществами. Если действующие вещества содержатся в предлагаемых в изобретении ингаляционных порошках в смеси с физиологически безвредными вспомогательными веществами, то для получения таких ингаляционных порошков могут использоваться следующие физиологически безвредные вспомогательные вещества: моносахариды (например, глюкоза или арабиноза), дисахариды (например, лактоза, сахароза, мальтоза), олиго- и полисахариды (например, декстраны), полиспирты (например, сорбит, маннит, ксилит), соли (например, хлорид натрия, карбонат кальция) либо смеси этих вспомогательных веществ между собой. Предпочтительно использовать моно- или дисахариды, при этом особенно предпочтительно применение лактозы или глюкозы, прежде всего, но не исключительно, в виде их гидратов. Особенно предпочтительным согласно изобретению является применение в качестве вспомогательного вещества лактозы, наиболее предпочтительно моногидрата лактозы.

Максимальный средний размер частиц вспомогательных веществ, применяемых в составе предлагаемых в изобретении ингаляционных порошков, составляет вплоть до 250 мкм, предпочтительно от 10 до 150 мкм, наиболее предпочтительно от 15 до 80 мкм. При определенных условиях может оказаться целесообразным примешивать к указанным выше вспомогательным веществам их же фракции с меньшим средним размером частиц, составляющим от 1 до 9 мкм. Подобные вспомогательные вещества с меньшим размером частиц также выбирают из описанной выше группы вспомогательных веществ, применяемых в ингаляционных порошках. Помимо этого при получении предлагаемых в изобретении ингаляционных порошков предлагается примешивать к смеси вспомогательных веществ микронизированное действующее вещество, средний размер частиц которого предпочтительно составляет от 0,5 до 10 мкм, наиболее предпочтительно от 1 до 5 мкм. Способы получения предлагаемых в изобретении ингаляционных порошков путем размола и микронизации компонентов с последующим их смешением известны из уровня техники.

Для введения предлагаемых в изобретении ингаляционных порошков в организм могут использоваться известные из уровня техники ингаляторы.

В предлагаемых в изобретении препаратах с пропеллентом для аэрозольной ингаляции действующие вещества могут присутствовать в растворенном или в диспергированном в пропелленте виде. Используемые для приготовления препаратов для аэрозольной ингаляции пропелленты известны из уровня техники. Пригодные для этой цели пропелленты выбирают из группы, включающей углеводороды, такие как н-пропан, н-бутан или изобутан, и галогенированные углеводороды, такие как фторированные производные метана, этана, пропана, бутана, циклопропана или циклобутана. Указанные выше пропелленты могут при этом использоваться индивидуально либо в виде их смесей. Наиболее предпочтительными пропеллентами являются галогенированные производные алкана, выбранные из группы, включающей TG134a и TG227, а также их смеси.

В состав препаратов с пропеллентом для аэрозольной ингаляции могут входить также другие компоненты, такие как сорастворители, стабилизаторы, поверхностно-активные вещества (ПАВ), антиокислители, смазывающие вещества, а также средства для регулирования значения рН. Все такие компоненты известны из уровня техники.

Для введения описанных выше препаратов с пропеллентом в организм путем аэрозольной ингаляции могут использоваться известные из уровня техники ингаляторы (ингаляторы с дозировочной шкалой).

Назначаемая доза предлагаемых в изобретении соединений в существенной степени зависит, как очевидно, от метода их введения в организм и подлежащего лечению заболевания. При введении предлагаемых в изобретении соединений в организм путем ингаляции выраженный эффект от их применения проявляется уже при их введении в организм в дозах, лежащих в микрограммовом диапазоне. Однако соединения формулы 1 целесообразно применять и в дозах, превышающих микрограммовый диапазон. При этом соответствующая доза может, например, лежать в миллиграммовом диапазоне.

Еще одним объектом настоящего изобретения являются описанные выше фармацевтические композиции (лекарственные препараты), отличающиеся тем, что они содержат соединение формулы I как таковое, наиболее предпочтительно описанные выше фармацевтические композиции для введения в организм путем ингаляции.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах, в которых представлены составы некоторых лекарственных форм и которые не ограничивают его объем.

Примеры лекарственных форм

А) Таблетки

Компонент Содержание в одной таблетке, мг действующее вещество 100 лактоза 140 кукурузный крахмал 240 поливинилпирролидон 15 стеарат магния 5 Итого 500

Тонкоизмельченное действующее вещество смешивают с лактозой и частью от всего предусмотренного количества кукурузного крахмала. Полученную смесь просеивают, после чего ее увлажняют раствором поливинилпирролидона в воде, месят, гранулируют во влажном состоянии и сушат. Полученный гранулят совместно с остальным количеством кукурузного крахмала и стеаратом магния просеивают и смешивают между собой. Из полученной смеси прессуют таблетки требуемых формы и размера.

Б) Таблетки

Компонент Содержание в одной таблетке, мг действующее вещество 80 лактоза 55 кукурузный крахмал 190 микрокристаллическая целлюлоза 35 поливинилпирролидон 15 натрийкарбоксиметилкрахмал 23 стеарат магния 2 Итого 400 мг

Тонкоизмельченное действующее вещество смешивают с частью от всего предусмотренного количества кукурузного крахмала, лактозой, микрокристаллической целлюлозой и поливинилпирролидоном, полученную смесь просеивают и совместно с остальным количеством кукурузного крахмала и воды перерабатывают в гранулят, который сушат и просеивают. Далее добавляют натрийкарбоксиметилкрахмал и стеарат магния, перемешивают и из полученной смеси прессуют таблетки требуемого размера.

В) Раствор в ампулах

действующее вещество 50 мг хлорид натрия 50 мг вода из расчета на одну инъекцию 5 мл

Действующее вещество при собственном значении рН или при определенных условиях при рН 5,5-6,5 растворяют в воде и смешивают с хлоридом натрия в качестве придающего изотоничность агента. От полученного раствора отфильтровывают пирогенные продукты и фильтрат в асептических условиях разливают в ампулы, которые затем стерилизуют и запаивают.Такие ампулы могут содержать 5 мг, 25 мг и 50 мг действующего вещества.

Г) Дозированный аэрозоль, мас.%:

действующее вещество 0,005 сорбитантриолеат 0,1 смесь TG134a и TG227 в соотношении 2:1 до 100

Суспензию заливают в обычный аэрозольный баллончик, снабженный дозирующим клапаном. Выдаваемая за однократное нажатие на такой клапан порция суспензии предпочтительно составляет 50 мкл. При необходимости действующее вещество можно вводить в организм и в более высоких дозах (например, 0,02 мас.%).

Д) Растворы (в мг/100 мл)

действующее вещество 333,3 мг бензалконийхлорид 10,0 мг ЭДТК 50,0 мг НСl (1н.) до рН 3,4

Раствор такого состава можно приготавливать по обычной технологии.

Е) Ингаляционный порошок

действующее вещество 12 мкг моногидрат лактозы до 25 мг

Ингаляционный порошок указанного состава получают по обычной технологии смешением отдельных компонентов.

Данные, IC₅₀

Бетамиметики пролонгированного и быстрого действия используются для лечения легочных заболеваний в связи с их бронхолитическим действием и предложены «Комиссией по глобальной стратегии лечения хронического обструктивного заболевания легких (ХОБЛ)» (программа GOLD) в качестве лекарственных средств, которые позволяют контролировать и снижать интенсивность симптомов при лечении ХОБЛ, см. справочник GOLD 2005, goldcopd.com (стр.13 и 21). Чтобы снизить нежелательные побочные действия, прежде всего действие на сердечно-сосудистую систему (например, тахикардия, другие побочные действия: гипокалиемия и мышечный тремор), важно по возможности снизить активность используемого бетамиметика в отношении β1-адренорецептора.

Пригодными являются бетамиметики, которые по данным стандартных методов анализа характеризуются либо 1) низкой собственной активностью в отношении β1-адренорецептора, 2) высокой селективностью (рассчитанной по отношению величины ЕС₅₀ для β₁-адренорецептора к величине ЕС₅₀ для β₂-адренорецептора), либо 3) комбинацией указанных свойств. Кроме того, для клинических испытаний следует использовать только такие соединения, которые проявляют удовлетворительную эффективность в доклинических испытаниях на моделях животных, у которых индуцировано заболевание, аналогичное для пациентов с диагнозом ХОБЛ, то есть у которых наблюдается бронхостеноз.

Для соединений, описанных в примерах заявки, оценивали активность методом функционального анализа с использованием клеточных линий, то есть определяли эффективность, действие и селективность в отношении β₂-адренорецептора человека. В указанном анализе определяли индуцированное β-агонистом повышение уровня внеклеточного цАМФ в клеточной линии СНО, которая соответственно экспримирует либо клонированный β₁-адренорецептор, либо β₂-адренорецептор человека, а также определяли значение ЕС₅₀ и собственную активность (в качестве маркера действия) для двух β-адренергических рецепторов. Данные указанных анализов представлены в таблице 1. Указанные методы анализа подробно описаны ниже.

Соединения, описанные в примерах заявки, испытывали также на модели животных с бронхостенозом (модель Конзетта-Ресслера). В этой модели морским свинкам после анестезии вводили соединения внутритрахеальным способом и бронхостеноз индуцировали при внутривенном введении ацетилхолина в различные периоды времени после введения соединения. Указанная модель широко используется для оценки in vivo действия, эффективности и продолжительности действия бронхолитических средств, таких как β-агонисты, и до настоящего времени является надежным методом для предсказания действия соединений при лечении заболеваний дыхательных путей человека, таких как ХОБЛ (связанный с блуждающим нервом холинергический тонус является важным вкладом в сниженный поток воздуха у пациентов с ХОБЛ). Полученные при указанных испытаниях данные представлены в таблице 2. Соединения, пригодные для лечения ХОБЛ, в данной модели должны обеспечивать значительную, в идеальном случае полную (100%), защиту бронхов в дозе ≤30 мкг/кг и при этом оказывать продолжительное действие в течение более 3 ч (в этот момент времени должны оказывать защитное действие). Указанные методы испытаний подробно описаны ниже.

Соединения, полученные в примерах, проявляют высокую эффективность β₂-агонистов с высокой селективностью в отношении β₁-адренорецептора, например, селективность соединений, полученных в примерах 2, 3, 5, 7, 10, 17, 19, 22, 23 и 34 (ЕС₅₀ (β₁)/ЕС₅₀ (β₂)), составляет ≥50. Многие соединения характеризуются низкой собственной активностью в отношении β₁-рецептора. Например, собственная активность для соединений, полученных в примерах 1, 3, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 18, 22, 28, 31, 33, 34 и 35, составляет ≤15%.

Кроме того, все соединения, описанные в заявке, по данным испытаний с использованием морских свинок с моделью бронхостеноза проявляют после внутритрахеального введения в низкой дозе значительную защиту бронхов от индуцированного ацетилхолином бронхостеноза и проявляют активность в течение по крайней мере 3 ч после их введения (см. таблицу 2).

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что соединения, описанные в заявке, являются высокоэффективными и селективными агонистами β₂-рецептора, а также проявляют бронхолитическую активность на модели животных с индуцированным ацетилхолином бронхостенозом.

Для лучшего понимания изобретения ниже представлено подробное обсуждение данных, полученных в выбранных примерах:

- Соединение, полученное в примере 3, является высокоэффективным β₂-агонистом, величина ЕС₅₀ (β₂) составляет 1,4 нМ и проявляет лишь очень низкую собственную активность в отношении β₁-рецептора, которая составляет 7%. Рассчитанная величина селективности (EC₅₀ (β₁)/EC₅₀ (β₂)) составляет 256. По данным испытаний на модели морских свинок с бронхостенозом соединение, полученное в примере 3, вызывает 100% сужение бронхов (защиту бронхов) в дозе 3 мкг/кг и оказывает 95% защиту бронхов через 3 ч после введения (фиг.1). Следовательно, соединение характеризуется требуемым профилем свойств бронхомиметика.

- Соединения, полученные в примерах 12 и 21, также являются высокоэффективными частичными агонистами β₂-адренорецептора, величина ЕС₅₀ составляет от 2,4 до 3,4 нМ. Рассчитанная величина селективности (ЕС₅₀ (β₁)/ЕС₅₀ (β₂)) для обоих соединений составляет 30. Кроме того, оба соединения проявляют лишь очень низкую собственную активность в отношении β₁-рецептора, которая составляет 18%. По данным испытаний на модели морских свинок с бронхостенозом соединение, полученное в примере 3, вызывает 100% сужение бронхов (защиту бронхов) в дозе 3 мкг/кг и оказывает действие в течение всего периода регистрации 5 ч (фиг.2). В дозе 10 мкг/кг соединение, полученное в примере 21, оказывает 100% защиту бронхов и сохраняет такое действие в течение всего периода испытаний (фиг.5). Следовательно, указанные соединения характеризуются требуемым профилем свойств бронхомиметика.

- Соединения, полученные в примерах 13 и 14, проявляют умеренную, но достаточную агонистическую в отношении β₂-адренорецептора активность, величина ЕС₅₀ составляет от 12 до 15 нМ. Кроме того, оба соединения проявляют лишь очень низкую собственную активность в отношении β₁-рецептора, которая составляет от 8 до 18%. Рассчитанная величина селективности (ЕС₅₀ (β₁)/ЕС₅₀ (β₂)) для соединения 14 составляет 13. Для соединения 13 величину ЕС₅₀ (β₁) не рассчитывали, так как величина составляет >10 мкМ. По данным испытаний на модели морских свинок с бронхостенозом соединение 13 вызывает 100% сужение бронхов (защиту бронхов) в дозе 10 мкг/кг и оказывает действие в течение всего периода регистрации 5 ч (фиг.2). В дозе 10 мкг/кг соединение, полученное в примере 21, оказывает 100% защиту бронхов и оказывает такое действие в течение всего периода испытаний 5 ч (фиг.3). Введение соединения 14 в дозе 3 мкг/кг приводит к полной защите бронхов через 90 мин, которая сохраняется в течение всего периода регистрации (фиг.5). Следовательно, указанные соединения характеризуются требуемым профилем свойств бронхомиметика.

Ниже показано, почему соединения, описанные в предшествующем уровне техники (US 4460581), не характеризуются преимуществами, которые указаны для соединений, описанных в заявке.

- Соединения, полученные в примерах 16 и 49 патента US 4460581, характеризуются более низкой селективностью. Рассчитанная величина селективности (ЕС₅₀ (β₁/ЕС₅₀ (β₂)) для соединения 16 составляет 4, 5, а для соединения 49 составляет 9. Следовательно, оба соединения не характеризуются требуемым профилем свойств бетамиметика.

- Соединение 28, описанное в патенте US 4460581, содержит метильную группу (замещение по амину), которая значительно меньше, чем заместитель в соединениях, описанных с заявке (амфетамин вместо диметилфенетиламина). Указанное соединение проявляет лишь низкую собственную активность в отношении β₂-рецептора (то есть слабый частичный агонист). Более того, соединение обладает не слишком высокой эффективностью (ЕС₅₀ (β₂)=24 нМ) и обладает низкой специфичностью в отношении β₁-адренорецептора. Рассчитанная величина селективности (ЕС₅₀ (β₁/EC₅₀ (β₂)) для соединения составляет 5,3. Следовательно, соединение не характеризуется требуемым профилем свойств бетамиметика.

- Соединением 31, описанным в патенте US 4460581, является 5-гидроксибензооксазинон, который характеризуется низкой селективностью. Рассчитанная величина селективности (ЕС₅₀ (β₁)/EC₅₀ (β₂)) для соединения составляет 5,5. Следовательно, соединение является не пригодным для использования в качестве бетамиметика.

Таблица 1   Данные анализа с использованием клеток по уровню накопления цАМФ в клеточной линии СНО, которая экспримирует β₁-адренергический или β₂-адренергический рецептор человека. Соединения, описанные в заявке Р0 1-1706, анализировали указанным методом анализа, полученные данные представлены ниже. Сокращение "IA" означает собственную активность по сравнению с активностью изопреналина (IA изопреналина равна 100%). Подробное описание методики анализа см. ниже.  

Beispiel # Struktur β₁ IA [%] β₁ EC₅₀ [nM] β₂ IА [%] β₂ EC₅₀ [nM] 1 28 326 82 1.4 2 15 13 40 0.9 3 7 358 53 1,4 4 22 11 72 0,8 5 23 2623 68 13 6 100 7,4 150 1,0 7 16 161 50 2,4 8 13 207 23 58 9 36 215 29 50 10 7 4280 58 9,9 11 29 18 50 0,8 12 18 71 52 2,4

Beispiel # Struktur β₁ IA [%] β₁ EC₅₀ [nM] β₂ IA [%] β₂ EC₅₀ [nM] 13 8 >10000 50 12 14 15 200 43 15 15 4 >10000 57 20 16 7 2189 28 92 17 19 401 54 4,2 18 15 32 50 1,6 19 30 171 55 1,3 20 20 103 64 11 21 18 101 65 3,4 22 9 417 54 7,3 23 20 418 78 2,1 24 19 9 49 2,7 28 8 68 52 9,9 31 7 119 70 2,5

Beispiel # Struktur β₁ IA [%] β₁ EC₅₀ [nM] β₂ IA [%] β₂ EC₅₀ [nM] 32 17 173 33 14 33 7 43 49 16 34 13 1172 48 4,1 35 15 145 54 6,8

Таблица 2 Данные анализа in vivo на модели Конзетта-Ресслера с использованием морских свинок. Соединения, описанные в заявке, испытывали указанным методом и полученные данные представлены ниже. "FED" означает полностью эффективную дозу, при введении которой достигается максимальная защита бронхов. Подробное описание методики анализа см. ниже. Beispiel # FED [µg/kg] Wirksamkeit nach 3 h [% Bronchoprotektion] 1 3 95 2 0.3 60 3 3 95 4 n.d. n.d. 5 3 70 6 n.d. n.d 7 3 100 8 n.d. n.d. 9 n.d. n.d. 10 10 80 11 n.d. n.d. 12 3 95 13 10 100 14 3 100 15 30 80 16 n.d. n.d. 17 10 95 18 3 100 19 10 80 20 n.d. n.d. 21 10 95 22 30 100 23 30 100 24 10 85 28 10 70 31 >10 20 (bei 10 µg/kg) 32 n.d. n.d. 33 n.d. n.d. 34 30 100 35 >30 75 (bei 30 µg/kg)

Таблица 3 Данные анализа с использованием клеток по уровню накопления цАМФ в клеточной линии СНО, которая экспримирует β₁-адренергический или β₂-адренергический рецептор человека. Соединения, описанные в патенте US 4460581, анализировали указанным методом анализа, полученные данные представлены ниже. Сокращение "IA" означает собственную активность по сравнению с активностью изопреналина (IA изопреналина равна 100%). Подробное описание методики анализа см. ниже. Beispiel # Struktur β₁ IA [%] β₁ EC₅₀ [nM] β₂ IA [%] β₂ EC₅₀ [nM] 16 63 2,7 109 0,6 28 14 127 32 24 31 107 1,1 167 0,2 49 153 0,9 107 0,1

Фиг.1:

Защита бронхов у морских свинок - действие соединения, полученного в примере 3, на индуцированный ацетилхолином бронхостеноз у морских свинок после анестезии. Защиту бронхов определяли в процентах подавления прироста обильного выделения слизи («избыточного потока»), индуцированного ацетилхолином перед введением лекарственного средства ингаляцией. После введения лекарственного средства животным вводили ацетилхолин внутривенно через каждые 10 мин в течение всего периода 5 ч. Каждую величину рассчитывали в виде среднего значения ± СО (n=2).

Фиг.2:

Защита бронхов у морских свинок - действие соединения, полученного в примере 12. на индуцированный ацетилхолином бронхостеноз у морских свинок после анестезии. Защиту бронхов определяли в процентах подавления прироста «избыточного потока», индуцированного ацетилхолином перед введением лекарственного средства ингаляцией. После введения лекарственного средства животным вводили ацетилхолин внутривенно каждые 10 мин в течение всего периода 5 ч. Каждую величину рассчитывали в виде среднего значения ± СО (n=2).

Фиг.3:

Защита бронхов у морских свинок - действие соединения, полученного в примере 13, на индуцированный ацетилхолином бронхостеноз у морских свинок после анестезии. Защиту бронхов определяли в процентах подавления прироста «избыточного потока», индуцированного ацетилхолином перед введением лекарственного средства ингаляцией. После введения лекарственного средства животным вводили ацетилхолин внутривенно серез каждые 10 мин в течение всего периода 5 ч. Каждую величину рассчитывали в виде среднего значения ± СО (n=2).

Фиг.4:

Защита бронхов у морских свинок - действие соединения, полученного в примере 14, на индуцированный ацетилхолином бронхостеноз у морских свинок после анестезии. Защиту бронхов определяли в процентах подавления прироста «избыточного потока», индуцированного ацетилхолином перед введением лекарственного средства ингаляцией. После введения лекарственного средства животным вводили ацетилхолин внутривенно через каждые 10 мин в течение всего периода 5 ч. Каждую величину рассчитывали в виде среднего значения ± СО (n=2).

Фиг.5:

Защита бронхов у морских свинок - действие соединения, полученного в примере 21, на индуцированный ацетилхолином бронхостеноз у морских свинок после анестезии. Защиту бронхов определяли в процентах подавления прироста «избыточного потока», индуцированного ацетилхолином перед введением лекарственного средства ингаляцией. После введения лекарственного средства животным вводили ацетилхолин внутривенно через каждые 10 мин в течение всего периода 5 ч. Каждую величину рассчитывали в виде среднего значения ± СО (n=2).

CHO-β1

Определение агонизма в отношении β-1-адренорецептора при стимуляции синтеза цАМФ в клетках СНО. Определение величины EC₅₀ и собственной активности (IA)

Материалы: ФСБ (номер по каталогу 14190-169), среда DMEM (номер по каталогу 31966-021), Pen/Strep (номер по каталогу 15140-106), MEM (номер по каталогу 11140-035), генетицин (номер по каталогу 10131-027), трипсин/ЭДТУ (номер по каталогу 25300-054) и версен (номер по каталогу 15040-033) производства фирмы Invitrogen. ЭТС (номер по каталогу 14-602F) производства фирмы BioWhittaker), HBSS 10x (номер по каталогу 14065-049) производства фирмы Gibco BRL, твин 20 (номер по каталогу 37240) производства фирмы Serva, БСА (номер по каталогу А-7030), ДМСО (номер по каталогу D-5879), NaCl (номер по каталогу S-3014), IBMX (номер по каталогу 1-7018), изопреналин (номер по каталогу 1-5627) и цАМФ (номер по каталогу А-6885) производства фирмы Sigma. 96-луночные планшеты с полуплоскими лунками и плоским дном производства фирмы Corning (номер по каталогу 3697). 384-луночные планшеты OptiPlate производства фирмы Packard Bioscience (номер по каталогу 6007290). Набор для определения цАМФ AlphaScreen (номер по каталогу 6760600М) производства фирмы BioSignal Packard. Все остальные материалы получали из различных коммерческих источников по возможности самой высокой квалификации.

Клетки СНО, экспримирующие β1-адренергический рецептор человека, получали известным в молекулярной биологии методом. Эти клетки экспримировали β1-адренергический рецептор человека. Последовательность описана в статье Frielle и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7920-7924 (1987)).

Способ

Среда для культивирования клеток: DMEM, 10% ЭТС, 1% Pen/Strep, 1% MEM, 1 нг/мл генетицин.

Буферный раствор для стимуляции: 0,1% БСА, 0,5 мМ IBMX, 5 мМ Hepes, 1×HBSS (10x).

Буферный раствор для лизиса: 0,3% твин 20, 5 мМ Hepes, 0,1% БСА.

Буферный раствор для гранул: 0,1% БСА, 6% 50 мМ Hepes, 4% HBSS.

Клетки СНО культивировали до конфлуентности 70-80%. После трехкратной промывки клеток буферным раствором ФСБ клетки отделяли с использованием версена и ресуспендировали в 10 мл буферного раствора для стимуляции. После центрифугирования (5 мин, 900 об/мин) супернатант отделяли и клетки ресуспендировали в 10 мл буферного раствора для стимуляции, затем снова центрифугировали. Полученные клетки разбавляли буферным раствором для стимуляции до плотности 0,65×10⁶ клеток/мл с использованием системы Casy.

10 мкл исследуемого соединения, разбавленного в 0,9% NaCl (конечная концентрация соединения от 0,1 нМ до 10 мкМ, 1% ДМСО), добавляли в лунки 96-луночного планшета и смешивали с 20 мкл клеточной суспензии. После инкубации при КТ в течение 30 мин в лунки добавляли 20 мкл буферного раствора для лизиса, затем инкубировали по крайней мере в течение 30 мин на ледяной бане. 5 мкл лизированной клеточной суспензии добавляли в лунки 384-луночного планшета в 4-кратном разведении, затем добавляли 10 мкл гранул акцептора (конечная концентрация 15 мкг/мл в буферном растворе для гранул). Планшеты инкубировали при КТ в течение 30 мин в темноте, затем добавляли по 10 мкл гранул донора (конечная концентрация 20 мкг/мл в буферном растворе для гранул), содержащих биотинилированный цАМФ (конечная концентрация 10 нМ). После инкубации в течение по крайней мере 2 ч планшеты считывали на ридере Fusions-Ableser (Packard Bioscience).

Результаты измерений, полученные с использованием набора Alpha Screen (=ASC), использовали непосредственно для расчета содержания цАМФ gj калибровочной кривой для стандарта цАМФ.

Каждый микротитрационный планшет содержал лунки с контролем-носителем (1% ДМСО, нестимулированные клетки), которые использовали в качестве контроля отсутствия стимуляции (0% CTL, низкое значение), и лунки, стимулированные изопреналином (конечная концентрация 1×10^-5 М), которые использовали в качестве положительного контроля (100% CTL, высокое значение).

Определение собственной активности (IA)

Полученные данные анализа использовали для расчета содержания цАМФ в процентах в присутствии исследуемого соединения по сравнению с содержанием цАМФ в лунках с положительным контролем:

((цАМФ (образец)-цАМФ (низкое значение)·100/(цАМФ) (высокое значение)-цАМФ (низкое значение))

Агонист β-1-рецептора характеризуется величиной IA от 0% CTL (отсутствие стимуляции), как правило, до <200% CTL (100% соответствует стандартной стимуляции при конечной концентрации изопреналина 1×10^-5 М).

Определение эффективной концентрации 50 (EC₅₀)

Указанную величину рассчитывали при обработке величины CTL в %, полученной при различных концентрациях каждого соединения, с использованием программы Graph Pad Prizm. Величины выражали в нМ-концентрации.

СНО-β2

Определение агонизма в отношении β-2-адренорецептора при стимуляции синтеза цАМФ в клетках СНО. Определение величины ЕС₅₀ и собственной активности (IA)

Материалы: ФСБ (номер по каталогу 14190-169), среда DMEM (номер по каталогу 31966-021), Pen/Strep (номер по каталогу 15140-106), MEM (номер по каталогу 11140-035), генецитин (номер по каталогу 10131-027), трипсин/ЭДТУ (номер по каталогу 25300-054) и версен (номер по каталогу 15040-033) производства фирмы Invitrogen. ЭТС (номер по каталогу 14-602F) производства фирмы BioWhittaker), HBSS 10x (номер по каталогу 14065-049) производства фирмы Gibco BRL, твин 20 (номер по каталогу 37240) производства фирмы Serva, БСА (номер по каталогу А-7030), ДМСО (номер по каталогу D-5879), NaCl (номер по каталогу S-3014), IBMX (номер по каталогу 1-7018), изопреналин (номер по каталогу 1-5627) и цАМФ (номер по каталогу А-6885) производства фирмы Sigma. 96-луночные планшеты с полуплоскими лунками и плоским дном производства фирмы Corning (номер по каталогу 3697). 384-луночные планшеты OptiPlate производства фирмы Packard Bioscience (номер по каталогу 6007290). Набор для определения цАМФ AlphaScreen (номер по каталогу 6760600М) производства фирмы BioSignal Packard. Все остальные материалы получали из различных коммерческих источников по возможности самой высокой квалификации.

Клетки СНО, экспримирующие β2-адренергический рецептор человека, получали известным в молекулярной биологии методом.

Способ

Среда для культивирования клеток: DMEM, 10% ЭТС, 1% Pen/Strep, 1% MEM, 1 нг/мл генетицин.

Буферный раствор для стимуляции: 0,1% БСА, 0,5 мМ IBMX, 5 мМ Hepes, 1×HBSS (10x).

Буферный раствор для лизиса: 0,3% твин 20, 5 мМ Hepes, 0,1% БСА.

Буферный раствор для гранул: 0,1% БСА, 6% 50 мМ Hepes, 4% HBSS.

Клетки СНО культивировали до конфлуентности 70-80%. После трехкратной промывки клеток буферным раствором ФСБ клетки отделяли с использованием версена и ресуспендировали в 10 мл буферного раствора для стимуляции. После центрифугирования (5 мин, 900 об/мин) супернатант отделяли и клетки ресуспендировали в 10 мл буферного раствора для стимуляции, затем снова центрифугировали. Полученные клетки разбавляли буферным раствором для стимуляции до плотности 0,65х10⁶ клеток/мл с использованием системы Casy.

10 мкл исследуемого соединения, разбавленного в 0,9% NaCl (конечная концентрация соединения от 0,1 нМ до 10 мкМ, 1% ДМСО), добавляли в лунки 96-луночного планшета и смешивали с 20 мкл клеточной суспензии. После инкубации при КТ в течение 30 мин в лунки добавляли 20 мкл буферного раствора для лизиса, затем инкубировали по крайней мере в течение 30 мин на ледяной бане. 5 мкл лизированной клеточной суспензии добавляли в лунки 384-луночного планшета в 4-кратном разведении, затем добавляли 10 мкл гранул акцептора (конечная концентрация 15 мкг/мл в буферном растворе для гранул). Планшеты инкубировали при КТ в течение 30 мин в темноте, затем добавляли по 10 мкл гранул донора (конечная концентрация 20 мкг/мл в буферном растворе для гранул), содержащих биотинилированный цАМФ (конечная концентрация 10 нМ). После инкубации в течение по крайней мере 2 ч планшеты считывали на ридере Fusion-Ableser (Packard Bioscience).

Результаты измерений, полученные с использованием набора Alpha Screen (=ASC), использовали непосредственно для расчета содержания цАМФ по калибровочной кривой для стандарта цАМФ.

Каждый микротитрационный планшет содержал лунки с контролем-носителем (1% ДМСО, нестимулированные клетки), которые использовали в качестве контроля отсутствия стимуляции (0% CTL, низкое значение), и лунки, стимулированные изопреналином (конечная концентрация 1×10^-5 М), которые использовали в качестве положительного контроля (100% CTL, высокое значение).

Определение собственной активности (IA)

Полученные данные анализа использовали для расчета содержания цАМФ в процентах в присутствии исследуемого соединения по сравнению с содержанием цАМФ в лунках с положительным контролем:

((цАМФ (образец)-цАМФ (низкое значение)·100/(цАМФ) (высокое значение)-цАМФ (низкое значение))

Агонист β-2-рецептора характеризуется величиной IA от 0% CTL (отсутствие стимуляции), как правило, до <200% CTL (100% соответствует стандартной стимуляции при конечной концентрации изопреналина 1×10^-5 М).

Определение эффективной концентрации 50 (EC₅₀)

Указанную величину рассчитывали при обработке величины CTL в %, полученной при различных концентрациях каждого соединения, с использованием программы Graph Pad Prizm. Величины выражали в нМ-концентрации.

Модель бронхостеноза у морских свинок, метод Конзетта-Ресслера

Животные - в эксперименте использовали самок и самцов морских свинок Dunkin-Harley, полученных в ветеринарном исследовательском центре Harlan Winkelmann (Германия). В эксперименте использовали животных с массой тела от 400 до 500 г после голодания в течение ночи со свободным доступом к воде.

Анестезия и подготовка животных

Анестезию проводили при внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала в дозе 50 мг/кг. Анестезию поддерживали при внутривенном вливании пентобарбитала в дозе 15 мг/кг/ч через яремную вену. В трахею вводили канюлю с помощью трахеотомии для подключения к аппарату искусственного дыхания. Во внутреннюю яремную вену вводили канюлю для инъекции ацетилхолина.

Оборудование и регистрация данных

Бронхоспазмы регистрировали модифицированным методом Конзетта-Ресслера, как описано в статье Walland и др. (1997). Искусственное дыхание животных осуществляли с использованием поршневого насоса (вентилятор воздуха, Hugo Sachs Electronik, Германия), объем хода поршня 1 мл/100 г массы тела, скорость 60 ходов/мин. Соединительная система, которая соединяет трахеальную канюлю с вентилятором, снабжена разветвлением для подключения к датчику прибора для измерения бронхоспазма (датчик для измерения бронхоспазма 7020, Ugo Basile, Италия). Поток воздуха измеряли с использованием анемометра с нагретой проволокой. Любой поток воздуха снижает температуру проволоки, при этом сопротивление проволоки пропорционально снижению потока. Так как проволочный элемент представляет собой мост Витстоуна, то при изменении сопротивления наблюдается пропорциональный скачок напряжения, который поступает в систему усилитель/регистрация (Notocord-hem, Notocord, Франция).

Кровяное давление и частоту сердечных сокращений регистрировали с использованием сонной артерии, чтобы контролировать параметры при анестезии и изменчивость препаратов.

Протокол эксперимента

Через 30 мин после начала регистрации потока воздуха и кровяного давления в течение 10 мин вводили ацетилхолин, чтобы обеспечить формирование временного и устойчивого спазма бронхов, который регистрировали в виде «избыточного потока» в мл. Для стандартизации данных от всех животных интенсивность регистрируемого избыточного потока поддерживали в диапазоне от 1 до 2 мл. То есть в начале эксперимента необходимо вводить соответствующую дозу ацетилхолина (обычно от 8 до 12 мкг/кг, внутривенно), чтобы вызвать избыточный поток на уровне приблизительно от 1 до 2 мл. После трех стабильных, вызванных ацетилхолином спазмов бронхов животным вводили через трахейную канюлю пролонгированный препарат β2-агониста с помощью аэрозольного ингалятора. После введения препарата проводили регистрацию указанных параметров в течение 5 ч, причем каждые 10 мин вводили ацетилхолин. В эксперименте использовали 4 группы животных, включающих группу отрицательного контроля (носитель), группу положительного контроля (формотерол, мкг/мл) и две группы животных, которым вводили ингаляцией две различные дозы исследуемого соединения (в диапазоне от 0,1 до 10 мкг/кг). Каждая группа включала по две морские свинки. После завершения эксперимента животных усыпляли (сверхдоза фенобарбитала, 100 мг/кг внутривенно). После внутривенной инъекции ацетилхолина животному в исходном состоянии индуцируется бронхостеноз, который характеризуется обильным выделением (избыточным потоком). Защиту бронхов при введении лекарственного средства (то есть подавление индуцированного ацетилхолином бронхостеноза) выражали в виде подавления обильного выделения, индуцированного ацетилхолином (в процентах), перед введением лекарственного средства ингаляцией. После введения лекарственного средства в ходе регистрации в течение 5 ч каждые 10 мин вводили ацетилхолин внутривенно.

Соединения

Соединения растворяли в физиологическом растворе или в смеси дистиллированной воды и этанола (40:60, об./об.) до концентрации, которая позволяла вводить соединение в дозе от 0,1 до 10 мкг/кг при одном нажатии на кнопку (10 мкл) аэрозольного ингалятора. Благодаря стабильности соединения в растворе, можно готовить исходный раствор с концентрацией 3 мг/10 мл или 10 мг/10 мл и использовать его в течение недели. Этот раствор можно использовать для введения соединения в дозе 0,1 мкг/кг (разбавление 1:60), 0,3 мкг/кг (разбавление 1:20), 1 мкг/кг (разбавление 1:6) и 3 мкг/кг (разбавление 1:2) или 10 мкг/кг двум животным в группе.

В эксперименте использовали ацетилхолин (дисперсия фталата ацетилхолина) производства GmbH (Germering, Германия), пентобарбитон (Narcoren) производства Rhone Merieux GmbH (88471 Laupheim, Германия). Формотеролфумарат производства Boehringer Ingelheim Pharma KG растворяли в смеси дистиллированной воды и этанола (40:60, об./об.).

Представленные данные

Защиту бронхов при введении лекарственного выражали в виде подавления обильного выделения, индуцированного ацетилхолином (в процентах), перед введением лекарственного средства ингаляцией. Эффективную дозу (FED), использованную в качестве индикатора эффективности исследуемого соединения, определяли по самой низкой дозе (мкг/кг), которая вызывает стабильный бронхостеноз.

Описываются энантиомерночистые соединения общей формулы (1)

в которой остатки R¹, R², R³, R⁴ и X^- могут иметь указанные в формуле изобретения, промежуточные соединения, фармацевтическая композиция, а также их применение в качестве лекарственных средств для лечения заболеваний дыхательных путей. 5 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл.

1. Соединение общей формулы 1

в которой R¹ обозначает водород или галоген,
R² обозначает водород или галоген,
R³ обозначает водород, С₁-С₄алкоксигруппу, галоген,
R⁴ обозначает водород, С₁-С₄алкил, С₁-С₄алкоксигруппу или галоген, и
X^- обозначает однозарядный анион, выбранный из хлорида, малеата, салицилата, фумарата, сукцината,
необязательно в виде его таутомеров, смесей таутомеров, гидратов или сольватов,
представленное в виде чистого энантиомера с чистотой по меньшей мере 85% ее.

2. Соединение формулы 1 по п.1, в которой
R¹ обозначает водород или галоген,
R² обозначает водород или галоген,
R³ обозначает водород, С₁-С₄алкоксигруппу или галоген,
R⁴ обозначает водород или галоген, и
X^- обозначает однозарядный анион, выбранный из хлорида, малеата, салицилата, фумарата, сукцината,
необязательно в виде его таутомеров, смесей таутомеров, гидратов или сольватов.

3. Соединение формулы 1 по п.1, в которой
R¹ обозначает водород, фтор или хлор,
R² обозначает водород, фтор или хлор,
R³ обозначает водород, метоксигруппу, этоксигруппу, фтор или хлор,
R⁴ обозначает водород, фтор или хлор, и
X^- обозначает однозарядный анион, выбранный из хлорида, малеата, салицилата, фумарата, сукцината,
необязательно в виде его таутомеров, смесей таутомеров, гидратов или сольватов.

4. Соединение формулы 1 по п.1, в которой
R¹ обозначает водород или фтор,
R² обозначает водород,
R³ обозначает метоксигруппу, этоксигруппу или фтор,
R⁴ обозначает водород, и
X^- обозначает хлорид, малеат, салицилат или фумарат,
необязательно в виде его таутомеров, смесей таутомеров, гидратов или сольватов.

5. Соединение формулы 1 по п.1, в которой
R¹ обозначает водород,
R² обозначает водород, фтор или хлор,
R³ обозначает водород,
R⁴ обозначает водород, фтор или хлор, и
X^- обозначает хлорид, малеат или салицилат,
необязательно в виде его таутомеров, смесей таутомеров, гидратов или сольватов.

6. Соединение формулы 1 по п.1, представленное в кристаллической форме, необязательно в виде его кристаллических таутомеров, кристаллических гидратов или кристаллических сольватов.

7. Соединение по одному из пп.1-3, в котором однозарядный анион представляет собой хлорид, малеат, салицилат, фумарат, сукцинат.

8. Фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболеваний дыхательных путей, содержащая соединение формулы 1 по одному из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Применение соединения формулы 1 по одному из пп.1-7 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболеваний дыхательных путей.

10. Соединение формулы 5
,
в которой OPG представляет собой защищенную защитной группой PG функциональную гидроксигруппу и обозначает -O-бензил.

11. Соединение формулы 7
,
в которой OPG представляет собой защищенную защитной группой PG функциональную гидроксигруппу и обозначает -O-бензил,
R¹ обозначает водород или галоген,
R² обозначает водород или галоген,
R³ обозначает водород, С₁-С₄алкоксигруппу, галоген, и
R⁴ обозначает водород, С₁-С₄алкил, С₁-С₄алкоксигруппу или галоген.