ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ СИСТЕМА Российский патент 2010 года по МПК C12P21/00 C12N15/70 C12N15/31 C12N1/21 

Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые вызывают иммунный ответ, который является защитным ответом при инфицировании Bacillus anthracis, к способам их получения, к рекомбинантным клеткам Escherichia coli, используемым в этих способах, а также к используемым нуклеиновым кислотам и к трансформирующим векторам.

Существующие системы экспрессии Защитного Антигена (РА) для вакцинных систем в качестве экспрессирующего хозяина используют дефицитный по протеазе Bacillus subtilis. Несмотря на то что такие системы являются подходящими с точки зрения количественной характеристики и чистоты продукта, у них имеются и существенные недостатки. Во-первых, регуляторные системы, как правило, чужды данному хозяину, и это может тормозить экспрессию. Более существенный момент заключается в том, что используемые в настоящее время штаммы Bacillus subtilis образуют термостабильные споры, для которых нужно использовать специально для этого предназначенное растение.

В частности, в WO 00/02522 описываются репликоны VEE-вируса, которые экспрессируют РА или некие иммуногенные фрагменты.

Бактерия E.coli хорошо известна в качестве экспрессирующей системы для ряда человеческих вакцин. Несмотря на способность E.coli легко ферментировать при очень высоких клеточных плотностях, что делает данную бактерию идеальным хозяином для экспрессирования многих белков, предшествующие попытки экспрессировать и выделить рекомбинантный РА из цитозоля E.coli затруднялись из-за низкого выхода белка и протеолитической деградации (Singh и соавт., J. Biol. Chem. (1989) 264; 11099-11102, Vodkin и соавт., Cell (1993) 34; 693-697 и Sharma с соавт., Protein Expr. purif. (1996), 7, 33-38).

Недавно описан подход к сверхэкспрессированию РА в цитозоле E.coli в виде стабильного растворимого белка (Willhite с соавт., Protein and Peptide Letters, (1998), 5; 273-278). Примененный подход является одним из повышающих сродство tag-последовательности к N-концу РА, что позволяет получить простую систему выделения очисткой.

Трудность, присущая данной системе, заключается в том, что она нуждается в применении дополнительной вспомогательной технологической стадии для того, чтобы удалить tag-метку перед использованием РА.

Оптимизация кодона представляет собой методику, которая ныне хорошо известна и используется для конструирования искусственных генов. Существует некоторая избыточность генетического кода, поскольку большинство аминокислот кодируется более чем одной последовательностью кодона. Разные организмы предпочтительно используют тот или иной из этих отличающихся кодонов. Следует ожидать, что в результате оптимизации кодонов уровни экспрессии отдельных белков будут возрастать.

Как правило, это желательно, кроме случая с РА, когда повышенные уровни экспрессии будут приводить к протеолитической деградации и/или клеточной токсичности. В таких случаях возрастание уровней экспрессии может оказаться контрпродуктивным и привести к существенной клеточной токсичности.

Вместе с тем, к своему удивлению, авторы изобретения обнаружили, что этого не происходит в случае с E.coli и что в данной системе оптимизация кодона ведет к неожиданно высоким уровням экспрессии рекомбинантного РА, независимо от наличия или отсутствия протеолитических ферментов у данного штамма.

Кроме того, очевидно, что экспрессия защитного домена из РА не подавляет экспрессию в E.coli.

Была выяснена кристаллическая структура нативного РА (Petosa C. и соавт. Nature 385: 833-838, 1997), и было показано, что РА состоит из четырех разных и функционально независимых доменов: домена 1, разделенного на 1а, 1-167 аминокислот, и 1b, 168-258 аминокислот; домена 2, 259-487 аминокислот; домена 3, 488-595 аминокислот, и домена 4, 596-735 аминокислот.

Авторы изобретения установили, что некоторые домены, при их индивидуальном использовании, при использовании в слитых белках или в сочетании друг с другом, по всей вероятности, оказывают удивительно выраженные защитные эффекты.

В соответствии с настоящим изобретением, создали иммуногенный реагент, который вызывает иммунный ответ, который защищает от Bacillus anthracis, причем указанный реагент включает в себя один или несколько полипептидов, которые вместе представляют до трех доменов полноразмерного Защитного Антигена (РА) из B.anthracis или их варианты, и по меньшей мере один из указанных доменов включает в себя домен 1 или домен 4 РА или их варианты.

В данном случае этот реагент должен включать в себя смесь полипептидов или слитых пептидов, в которой отдельные полипептиды включают в себя один или несколько индивидуальных доменов РА.

В частности, данный реагент содержит полипептид(ы), включающий в себя домен 1, или домен 4 РА, или его вариант в виде, отличающемся от полноразмерного РА. В данном случае домены представлены, соответственно, полностью, в частности домен 1 представлен в его полноте.

Используемый здесь термин "полипептид" включает в себя белки и пептиды.

Используемый здесь экспрессирующий "вариант" относится к последовательностям аминокислот, которые отличаются от базовой последовательности тем, что одна или несколько аминокислот в данной последовательности делетированы или замещены другими аминокислотами, но которые все еще производят иммунный ответ, который защищает от Bacillus anthracis. Аминокислотные замены могут рассматриваться в качестве "консервативных", если та или иная аминокислота заменена отличающейся аминокислотой, в общем, с аналогичными свойствами. Неконсервативные замены - это такие замены, когда аминокислоты заменяются аминокислотами другого типа. В общих чертах, немногочисленные неконсервативные замены будут возможны без изменения биологической активности данного полипептида. Соответствующие варианты должны быть идентичны по меньшей мере на 60%, предпочтительно идентичны по меньшей мере на 75% и более предпочтительно идентичны по меньшей мере на 90% последовательности РА.

Идентичность отдельной вариантной последовательности РА можно определить, в частности, с использованием метода множественного выравнивания, описанного Lipman и Pearson (Lipman, D.J. & Pearson, W.R. (1985) Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches, Science, vol. 227, p.1435-1441). "Оптимизированная" процентная оценка должна быть вычислена по алгоритму Lipman-Pearson с помощью нижеследующих параметров: ktup=1, штраф за пробел=4 и штраф за длину пробела=12. Последовательности, для которых оценивается сходство, должны использоваться в качестве "тест-последовательности", то есть, базовую последовательность для сравнения, (SEQ ID No 1), необходимо первой включить в данный алгоритм.

Предпочтительно, если реагент согласно изобретению включает в себя полипептид, который обладает последовательностью домена 1 и/или домена 4 из РА дикого типа.

Наиболее предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает в себя домен 4 из РА B.anthracis.

Эти домены содержат следующие последовательности, представленные в нижеследующей Таблице 1.

Таблица 1 Домен Аминокислоты полноразмерного РА* 4 596-735 1 1-258

Эти номера аминокислот относятся к последовательности, которая приведена у Welkos с соавт. Gene 69 (1988) 287-300, и представлены ниже, соответственно, в виде SEQ ID No 15 (Фиг.4) и 3 (Фиг.3).

Домен 1 содержит две области, обозначаемые 1а и 1b. Область 1а включает в себя аминокислоты 1-167, а область 1b состоит из аминокислот 168-258. По-видимому, область 1а существенна для получения хорошего защитного ответа, и данный полный домен может быть предпочтительным.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения сочетание доменов 1 и 4 или их защитных областей используется в качестве иммуногенного реагента, который обусловливает возрастание иммунного защитного ответа на B.anthracis. Данное сочетание, например, в виде химерного (гибридного) пептида может быть экспрессировано с использованием экспрессирующей системы согласно изобретению, которая вкратце изложена ниже.

При использовании домена 1, он соответствующим образом сливается с доменом 2 последовательности РА, но, по-видимому, предпочтительно сливается с доменом 2 и доменом 3.

Такого рода сочетания и их использование для профилактики и терапии создает еще один аспект настоящего изобретения.

Соответственно вышеописанные домены являются частью слитого (химерного или гибридного) белка, предпочтительно с N-концевым глутатион-s-трансферазным белком (GST). Белок GST не только содействует очистке слитого белка, но может также создавать адъювантное (иммуностимулирующее) действие, вероятно, в результате увеличения его размера.

Полипептиды согласно изобретению получают соответствующими традиционными способами. Например, их можно синтезировать, или они могут быть получены с использованием техники рекомбинантных ДНК. В частности, нуклеиновые кислоты, которые кодируют указанные домены, включают в себя экспрессирующий вектор, который используют для трансформации хозяйской клетки. Затем традиционными способами можно осуществить культивирование данной хозяйской клетки с последующим выделением нужного полипептида. Нуклеиновые кислоты, векторы и трансформированные клетки, используемые в данных способах, создают дополнительный аспект настоящего изобретения.

Вообще используемые хозяйские клетки должны представлять собой такие клетки, которые традиционно используются для получения РА, например Bacillus subtilis.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что домены, по отдельности или в сочетании, при определенных условиях могут успешно экспрессироваться в E coli.

Итак, в настоящем изобретении разработан способ получения иммуногенного полипептида, который вызывает иммунный ответ, который является защитным против B.anthracis, причем указанный способ включает в себя трансформирование хозяйской E.coli с помощью нуклеиновой кислоты, которая кодирует либо (а) защитный антиген (РА) из Bacillus anthracis или его вариант, который может вызвать защитный иммунный ответ, либо (b) полипептид, включающий в себя по меньшей мере один защитный домен данного защитного антигена (РА) из Bacillus anthracis или его вариант, который может вызвать защитный иммунный ответ, что описано выше, культивирование трансформированного хозяина и извлечение из него данного полипептида, при условии, что в тех случаях, когда данный полипептид представляет собой защитный антиген (РА) из Bacillus anthracis или его вариант, который может вызывать защитный иммунный ответ, процентная доля гуанидиновых и цитозиновых остатков в указанной нуклеиновой кислоте превышает 35%.

С использованием этих вариантов и с применением подходящего экспрессирующего хозяина можно добиться высокого выхода продукта.

Таблица, представляющая кодоны и частоты, с которыми они появляются в геномах Escherichia coli и Bacillus anthracis, приведена на Фиг.1. Ясно, что гуанидин и цитозин встречаются чаще у E.coli, чем у B.anthracis. Анализ содержания используемого данного кодона обнаруживает следующее:

Виды 1-я буква кодона GC 2-я буква кодона GC 3-я буква кодона GC Общее GC-содержание E.coli 58,50% 40,70% 54,90% 51,37% B.anthracis 44,51% 31,07% 25,20% 33,59%

Таким образом, по-видимому, кодонами, предпочтительно встречающимися у E.coli, являются такие кодоны, которые включают в себя, по возможности, гуанидин или цитозин.

C увеличением процентной доли нуклеотидов гуанидина и цитозина в указанной последовательности, используемой для кодирования иммуногенного белка, сверх того, что обычно обнаруживается в гене B.anthracis дикого типа, использование данного кодона будет улучшать экспрессию в E.coli.

Соответственно, процентная доля гуанидиновых и цитозиновых остатков в кодирующей нуклеиновой кислоте, используемой в настоящем изобретении, по меньшей мере, в тех случаях, когда данный полипептид представляет собой защитный антиген (РА) Bacillus anthracis или его вариант, который может вызывать защитный иммунный ответ, превышает 40%, предпочтительно превышает 45% и наиболее предпочтительно превышает 50-52%.

Высокие уровни экспрессии защитных доменов могут быть достигнуты при использовании последовательности из B.anthracis дикого типа, кодирующей эти структурные единицы. Однако показатели экспрессии можно дополнительно улучшить путем повышения содержания GC в данной нуклеиновой кислоте, что описано выше.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ включает в себя экспрессию РА B.anthracis.

Далее, в соответствии с настоящим изобретением, создали рекомбинантную клетку Escherichia coli, которую трансформируют с помощью нуклеиновой кислоты, которая кодирует защитный антиген (РА) из Bacillus anthracis или его вариант, который может вызывать защитный иммунный ответ, отличающуюся тем, что процентная доля остатков гуанидина и цитозина в данной нуклеиновой кислоте превышает 35%.

Как и раньше, соответствующая процентная доля остатков гуанидина и цитозина в данной кодирующей нуклеиновой кислоте превышает 40%, предпочтительно превышает 45% и наиболее предпочтительно превышает 50-52%.

Соответственно, нуклеиновая кислота согласно изобретению, используемая для трансформации клеток E.coli, представляет собой синтетический ген. В частности, данная нуклеиновая кислота представляет собой SEQ ID No 1, которая приведена на Фиг.2, или ее модифицированную форму.

Экспрессируемая "модифицированная форма" относится к другим нуклеиновокислотным последовательностям, которые кодируют РА или его фрагменты или варианты, которые вызывают защитный иммунный ответ, но которые используют несколько иные кодоны, обеспечивая выполнение требования о процентном содержании GC в соответствии с настоящим изобретением. Соответствующие модифицированные формы должны быть сходны по меньшей мере на 80%, предпочтительно сходны на 90% и наиболее предпочтительно сходны по меньшей мере на 95% с SEQ ID No 1. В частности, данная нуклеиновая кислота включает в себя SEQ ID No 1.

В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения, в настоящем изобретении создали рекомбинантную клетку Escherichia coli, которая была трансформирована нуклеиновой кислотой, которая кодирует защитный домен защитного антигена (РА) из Bacillus anthracis или его вариант, который может вызывать защитный иммунный ответ.

Предпочтительно, данная нуклеиновая кислота кодирует домен 1 или домен 4 B. anthracis.

Далее, в соответствии с настоящим изобретением, разработали способ получения иммуногенного полипептида, который вызывает иммунный ответ, который является защитным от B.anthracis, причем указанный способ включает в себя культивирование клетки, что описано выше, и извлечение нужного полипептида из данной культуры. Такие способы хорошо известны в данной области техники.

В соответствии еще с одним аспектом, в настоящем изобретении создали вектор, трансформирующий E.coli, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует защитный антиген (РА) из Bacillus anthracis или его вариант, который может вызывать защитный иммунный ответ, отличающийся тем, что процентная доля гуанидиновых и цитозиновых остатков в данной нуклеиновой кислоте превышает 35%.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к вектору, трансформирующему E.coli и содержащему нуклеиновую кислоту, которая кодирует защитный домен защитного антигена (РА) из Bacillus anthracis или его вариант, который может вызывать защитный иммунный ответ.

Соответствующие векторы, используемые для трансформации E.coli, хорошо известны в данной области техники. Например, Т7-экспрессирующая система обеспечивает высокие уровни экспрессии. Но, особенно предпочтительный вектор содержит pAG163, получаемый у Avecia (UK).

Нуклеиновая кислота SEQ ID No 1, или ее вариант, которая кодирует РА и которая обладает по меньшей мере 35%-ным, предпочтительно по меньшей мере 40%-ным, более предпочтительно по меньшей мере 45%-ным и наиболее предпочтительно 50-52%-ным содержанием GC, создает дополнительный аспект настоящего изобретения.

По необходимости, указанные варианты РА или домены могут экспрессироваться в виде соединения с другим белком, например с белком, который обеспечивает иную иммунность, с белком, который содействует очистке данного продукта, или с высокоэкспрессируемым белком (например, тиоредоксин, GST), который гарантирует подходящую инициацию или трансляцию.

При необходимости к данной экспрессирующей системе следует добавить дополнительные системы, такие как Т7-лизоцим, который улучшает репрессию данной системы, хотя в случае настоящего изобретения трудности, связанные с клеточной токсичностью, не отмечены.

В способе согласно изобретению можно использовать любой подходящий штамм E.coli. Пригодны штаммы, которые характеризуются недостаточностью по ряду протеаз (например, IonЇ, ompTЇ) и в отношении которых предполагается, что они должны минимизировать протеолиз. Однако авторы изобретения обнаружили, что нет необходимости использовать такие штаммы для достижения хорошего выхода продукта и что другие штаммы, такие как К12, как ни странно, производят большие количества продукта.

Ферментация штамма осуществляется, как правило, в стандартных условиях, которые известны в данной области техники. Например, ферментацию можно осуществлять в виде периодических культур, предпочтительно в больших колбах для встряхивания, с использованием сложной среды, содержащей антибиотики для сохранения плазмиды и с добавлением IPTG для индукции.

После культивирования клетки собирают и хранят при -20°С до тех пор, пока не потребуется операция по выделению очисткой.

Соответствующие схемы выделения очисткой экспрессируемого E.coli РА (варианта либо домена) можно адаптировать для схем, используемых для B.subtilis. Отдельные используемые стадии выделения очисткой зависят от физических характеристик рекомбинантного РА. Обычно осуществляют разделение с помощью ионообменной хроматографии в условиях, которые позволяют наибольшее дифференциальное связывание с данной колонкой и последующим сбором фракций с небольшим градиентом. В некоторых случаях для получения продукта с нужной технической характеристикой достаточной может оказаться единственная хроматографическая стадия.

При необходимости фракции можно анализировать на наличие данного продукта с использованием SDS PAGE или Вестерн-блоттинга.

Ниже иллюстрируется осуществление успешного клонирования и экспрессии панели химерных белков, представляющих собой интактные или неполные домены rPA. Иммуногенность и защитную эффективность этих химерных белков от заражения STI-спорами оценивают на модели A/J-мышей.

Все доменовые белки rPA оказываются иммуногенными для A/J-мышей и обеспечивают по меньшей мере частичную защиту при заражении по сравнению с контрольными GST-иммунизированными мышами. Белок-переносчик, GST присоединяется к N-концу доменных белков, не ослабляя иммуногенность слитых белков ни в условиях in vivo, что показано на антительном ответе, стимулированном у иммунизированных животных, ни в условиях in vitro в виде слитых белков, которые можно детектировать с помощью антисыворотки к rPA после Вестерн-блоттинга, что свидетельствует о том, что GST-метка не препятствует распознаванию rPA-эпитопа. Иммунизация крупными химерными белками дает наивысшие титры. В частности, мыши, иммунизированные полноразмерным химерным белком GST 1-4, в среднем продуцируют антисыворотку rPA с восьмикратной концентрацией по сравнению с группой, иммунизированной rPA (Фиг.5). Иммунизация мышей доменами 1-4 rPA с отщепленным GST дает приблизительно половину титра, продуцируемого при иммунизации указанным химерным белком. Отчего данный слитый белок должен быть гораздо более иммуногенным, остается невыясненным. Возможно, увеличенный размер данного белка может оказывать повышенное иммуногенное действие на иммунные эффекторные клетки. Но это не стимулирует такой ответ в такой же степени в других химерных белках, к тому же любое усиливающее иммуногенность действие GST-метки не повышает защиту от заражения, поскольку отщепляемые белки аналогичным образом защищены их химерными аналогами.

Несмотря на наличие высоких титров анти-rPA, в группах животных, иммунизированных с помощью GST1, отщепленного 1, GST1b-2, GST1b-3 и GST1-3, при сниженном уровне заражения 10² MLD, имеет место некоторый сбой в защите, и иммунизация этими белками не пролонгирует время выживания тех мышей, которые не выдержали заражения, в отличие от контрольных мышей, иммунизированных GST. Это дает основание полагать, что этот иммунный ответ не был соответствующим образом индуцирован этими белками для достижения полной резистентности к данному заражению. Как было показано в других исследованиях на мышах и морских свинках (Little S.F. и соавт. 1986. Infect. Immun. 52:356-363), не существует точной корреляции между титром антител против РА и защитой от заражения. Тем не менее, для защиты требуется некоторая пороговая величина антител (Cohen S. и соавт., 2000 Infect. Immun. 68:4549-4558), и это заставляет полагать, что клеточно-опосредованные компоненты иммунного ответа также нужны для стимулирования защиты (Williamson, 1989).

Как свидетельствуют результаты SDS-Page и Вестерн-блоттинга, полученные химерные белки GST1, GST1b-2 и GST1-2 оказались наименее стабильными, что, вероятно, связано с тем, что данные белки, в отсутствие домена 3, более подвержены деградации, и эта нестабильность, возможно, привела к утрате защитных эпитопов.

Определенная структурная конформация данных белков также, по-видимому, существенна для стимуляции защитного иммунного ответа. Удаление из данных химерных белков домена 1а приводит и к снижению титра антител и к ослаблению защиты при заражении по сравнению с их интактными аналогами GST1-2 и GST1-3. Аналогично этому мыши, иммунизированные с помощью одного лишь GST 1, были лишь частично защищены от заражения, но при объединении с доменом 2, в виде химерного белка GST1-2, отмечена полная защита при уровне заражения 10² MLD. Однако иммунный ответ, индуцированный в результате иммунизации с помощью химерного белка GST1-2, был недостаточным для создания полной защиты при более высоком уровне заражения в 10³ MLD, что опять-таки могло быть связано с утратой защитных эпитопов в результате деградации данного белка.

Все группы животных, иммунизированных укороченными белками, содержащими домен 4, в том числе отдельно взятым GST 4, отдельно взятым отщепленным доменом 4, а также смесью из двух индивидуально экспрессируемых доменов, GST 1 и GST 4, были полностью защищены от заражения STI-спорами при 10³ MLD (Таблица 1). Brossier с соавт. продемонстрировали снижение защиты у мышей, иммунизированных мутантным штаммом B. anthracis, который экспрессирует РА без домена 4 (Brossier F. и соавт. 2000. Infect. Immun. 68: 1781-1786), и это было подтверждено в данном исследовании, где иммунизация с помощью GST1-3 приводила к сбою в защите несмотря на высокие титры антител. Эти данные свидетельствуют, что домен 4 представляет собой иммунодоминантную субъединицу РА. Домен 4 представлен 139 аминокислотами на карбокси-конце полипептида РА. Он содержит рецепторный участок связывания хозяйской клетки (Little S.F. и соавт., 1996 Microbiology 142:707-715), идентифицированный как находящийся внутри и вблизи малой петли, расположенный между аминокислотными остатками 679-693 (Varughese M. и соавт. 1999 Infect. Immun. 67:1860-1865).

По этой причине интоксикация для хозяйской клетки является существенной, хотя было показано, что экспрессируемые формы РА, содержащие мутации (Varughese 1999, выше) или делеции (Brossier 1999, выше) на участке домена 4, не являются токсичными. Кристаллическая структура РА, представляющая собой домен 4 и, в частности, петлю этого домена, состоящая из 19 аминокислот (703-722), в большей степени не защищена, чем остальные три домена, которые плотно ассоциированы друг с другом (Petrosa 1997, выше). Данная структурная компоновка может превращать домен 4 в очень рельефный эпитоп для распознавания иммунными эффекторными клетками, и поэтому химерные белки, содержащие домен 4, должны вызывать наибольший иммунный ответ.

Кроме того, в настоящем исследовании проливается свет на роль РА в стимуляции защитного иммунного ответа, демонстрирующего, что защита от инфицирования сибирской язвой может быть отнесена на счет отдельных доменов РА.

Далее настоящее изобретение описывается подробно в примерах, со ссылками на прилагаемые чертежи.

На Фиг.1 представлены частоты кодонов, найденные у E.coli и B.anthracis;

на Фиг.2, в соответствии с настоящим изобретением, приведена последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует РА B.anthracis, как опубликовано у Welkos с соавт. выше;

на Фиг.3 приведены SEQ ID No 3-14, которые представляют собой последовательности аминокислот и ДНК, используемые для кодирования разных доменов или сочетаний доменов из РА, что детализировано ниже;

на Фиг.4 приведены SEQ ID No 15-16, которые представляют собой соответственно последовательности аминокислот и ДНК домена 4 РА;

Фиг.5 представляет собой таблицу, в которой показана концентрация IgG против rPA у A/J-мышей, иммунизированных внутримышечно в 1-й и 28-й дни 10 мкг химерного белка, содержащего РА-фрагмент, через 37 дней после первой иммунизации; представленные результаты соответствуют среднему значению ± стандартная ошибка (sem) в образцах, взятых у 5 мышей подопытной группы.

Пример 1

Исследование экспрессии у E. coli

Плазмиду pAG163::rPA, экспрессирующую rPA, модифицируют, заменяя Km^R-маркер исходным Tc^R-геном. Эту плазмиду трансформируют в экспрессирующую клетку-хозяина E.coli BLR (DE3), а затем оценивают уровень экспрессии и растворимость. Данный штамм является дефицитным по внутриклеточной протеазе La (продукт гена Ion) и по протеазе наружной мембраны Ompt.

Однако проведенные исследования по экспрессии не показали какого-либо улучшения в накоплении растворимого белка у данного штамма в сравнении с хозяйскими штаммами K12 Ion+ (т.е. накопление компенсируется избыточным протеолизом). Сделан вывод о том, что никакой внутриклеточный протеолиз rPA не обусловлен действием La-протеазы.

Пример 2

Анализ ферментации

Осуществляли дополнительный анализ ферментации, который выполняли с использованием штамма K12 UT5600 (DE3) pAG163::rPA.

Установлено, что rPA в данной культуре распределяется между растворимой и нерастворимой фракциями (предположительно 350 мг/л для нерастворимого rPA, 650 мг/л для полноразмерного растворимого rPA). В используемых условиях (37°С, 1 мМ IPTG для индукции) растворимый rPA во встряхиваемых культурах в колбах обнаружению не поддается, но, с учетом результатов, описанных выше в Примере 1, вызывает удивление наличие большого количества растворимого rPA. Как бы то ни было, представляется, что регулирование ферментации, запуска и момента сбора клеток, выращенных в культуре, позволяет стабильно накапливать rPA в экспрессирующих штаммах K12 E.coli.

Пример 3

Образец rPA получают из материала, первоначально выделенного в виде нерастворимых внутриклеточных включений (внутриклеточные тельца) из ферментируемого штамма UT5600 (DE3) pAG163::rPA. Внутриклеточные включения дважды промывают с помощью 25 мМ трис-HCl рН 8,0 и один раз - с помощью этого же буфера + 2М мочевина. Затем их солюбилизируют в буфере с +8М мочевиной и дебрис осаждают. Мочевину удаляют путем разведения в 25 мМ трис-HCl рН 8,0 и статически инкубируют в течение ночи при 4°С. Разбавленный образец наносят на колонку с Q-сефарозой и белок элюируют NaCl-градиентом. Фракции, содержащие наиболее чистый rPA, объединяют, отбирают аликвоты и замораживают при -70°С. Тестирование данного образца с использованием 4-12% MES-SDS NuPAGE геля против известного стандарта свидетельствует о его высокой чистоте и низкой контаминации эндотоксином.

Пример 4

Дополнительная характеристика полученного продукта

N-концевое секвенирование полученного продукта показывает, что N-концевая последовательность состоит из MEVKQENRLL (SEQ ID NO 2).

Это подтверждает, что данный продукт, как и предполагалось, находится слева по отношению к инициаторному метионину.

Обнаружили, что полученный материал реагирует в Вестерн-блоте; по данным MALDI -MS, данный образец обладает массой приблизительно 82700 (по сравнению с предполагаемой массой 82915). Разницу между большой молекулярной массой полученного материала и массой используемого стандарта (66 кДа) рассматривают как указание на то, что материал существенно не укорочен, но и не исключает микрогетерогенности анализируемого образца.

Пример 5

Тестирование отдельных доменов РА

Индивидуальные домены РА получают в виде рекомбинантных белков в E.coli в виде химерных белков с белком-носителем глутатион-s-трансферазой (GST) и с использованием экспрессирующей системы Pharmacia pGEX-6P-3. Последовательности разных доменов и ДНК-последовательность, используемая для их кодирования, прилагаются в виде Фиг.3. Соответствующие аминокислотные и ДНК-последовательности даны ниже в Таблице 2.

Данные химерные белки используются для иммунизации A/J-мышей (Harlan Olac) путем внутримышечного введения 10 мкг соответствующего химерного белка, адсорбированного на 20% об/об алгидрогеле в общем объеме 100 мкл.

Животных дважды иммунизируют случайным образом, и развитие их защитного иммунитета определяется путем заражения спорами B. anthracis (STI-штамм) на уровне индикаторных доз. В нижеследующей таблице приведены данные о животных, оставшихся в живых к 14 дню после заражения.

Таблица 2 Степень заражения спорами/мышь Домены Аминокислотная SEQ ID No ДНК SEQ ID No 5х10 ⁴ 9х10 ⁴ 9х10 ⁵ 1х10 ⁶ 5х10 ⁶ GST-1 3 4 4/4 3/5       Домены Аминокислотная SEQ ID No ДНК SEQ ID No 5х10 ⁴ 9х10 ⁴ 9х10 ⁵ 1х10 ⁶ 5х10 ⁶ GST-1+2 5 6 4/4
5/5 4/5
5/5       GST-1b+2 7 8 2/5 1/5       GST-1b+2+3 9 10 2/5 3/5       GST-1+2+3 11 12 Nd 4/5 3/5     GST-1+2+3+4 13 14 Nd 5/5 5/5     1+2+3+4 13 14 Nd Nd   5/5 5/5

Представленные данные свидетельствуют о том, что сочетание всех 4 доменов РА, представленное ли в виде химерного белка с GST или без нее, оказывает защитное действие и при самом высоком уровне заражения. Удаление домена 4, когда остаются 1+2+3, приводит к сбою защиты при наивысшем протестированном уровне заражения, 9х10⁵. Домены 1+2 оказываются защитными в сочетании доменов 1+2+3 при уровне заражения 9х10⁴ спор. Однако удаление домена 1а, когда остается слияние GST с доменами 1b+2, приводит к нарушению защиты при наивысших протестированных уровнях заражения (9х10⁴), которая несколько улучшается при добавлении домена 3.

Полученные данные свидетельствуют о том, что защитный иммунитет, стимулированный РА, может быть связан с отдельными доменами (интактным доменом 1 и доменом 4) или с сочетаниями всех 4-х доменов, взятыми в измененном порядке.

Аминокислотная последовательность и ДНК-последовательность домена 4 представлены на Фиг.4 соответственно в виде SEQ ID No 15 и 16.

Пример 6

Дополнительное тестирование доменов в качестве вакцин

ДНК из B.anthracis Sterne, кодирующую домены РА, аминокислоты 1-259, 168-488, 1-488, 168-596, 1-596, 260-735, 489-735, 597-735 и 1-735 (соответственно укороченные GST1, GST1b-2, GST1-2, GST1b-3, GST1-3, GST2-4, GST3-4, GST4 и GST1-4), амплифицируют с помощью PCR и клонируют в XhoI/BamHI-сайты экспрессирующего вектора pGEX-6-P3 (Amersham-Pharmacia) правее от точки старта транскрипции и под lac-промотором. Белки, продуцируемые с использованием данной системы, экспрессируются в виде химерных (гибридных) белков с белком глутатион-s-трансфераза (GST) на N-конце. Затем рекомбинантную плазмидную ДНК, несущую вышеуказанную ДНК, кодирующую домены РА, трансформируют в E.coli BL21 для анализа экспрессируемого белка.

E.coli BL21, заякоренную плазмидами pGEX-6-P3, культивируют в L-среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, 30 мкг/мл хлорамфеникола и 1% вес/объем глюкозы. Перед индуцированием с помощью 0,5 мМ IPTG культуры инкубируют в режиме встряхивания (170 об/мин^-1) при 30°С и А_600нм 0.4. Далее культуры инкубируют в течение 4 ч, с последующим сбором клеток путем центрифугирования при 10000 об/мин в течение 15 мин.

В результате начального экстрагирования укороченных химерных белков РА обнаружено, что они были получены в виде внутриклеточных телец. Осажденные клетки ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере (PBS) и обрабатывают ультразвуком в течение 4х20 с на водяной бане с кусочками льда. Обработанную ультразвуком суспензию центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин и затем осадок клеток экстрагируют мочевиной путем их суспендирования в 8М мочевине и перемешивания при комнатной температуре в течение 1 ч. Эту суспензию центрифугируют в течение 15 мин при 15000 об/мин и полученный супернатант диализуют против 100 мл Трис, рН 8,0, содержащим 400 мМ L-аргинина и 0,1 мМ ЭДТА перед диализом в PBS.

Успешная повторная упаковка укороченных химерных белков РА позволяет осуществить их выделение путем очистки на колонке по сродству с глутатионовой сефарозой CL-4B. Все экстракты (за исключением укороченного GST1b-2, аминокислотные остатки 168-487) наносят на 15 мл колонку с глутатионовой CL-4B сефарозой (Amersham-Parmacia), предварительно уравновешенную PBS и инкубированную с покачиванием в течение ночи при 4°С. Эту колонку промывают с помощью PBS и химерный белок элюируют 50 мМ Трис, рН 7,0, содержащим 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ восстановленного глутатиона. Фракции, содержащие укороченные РА, идентифицируют путем анализа в SDS-PAGE, объединяют и диализуют против PBS. Концентрацию белка определяют с использованием ВСА (Perbio).

Однако укороченный GST1b-2 невозможно элюировать с колонки по сродству с глутатионсефарозой CL-4B при использовании восстановленного глутатиона, и поэтому его выделяют путем очистки с использованием ионообменной хроматографии. В данном случае укороченный GST1b-2 перед загрузкой в колонку HiTrap Q (Amersham-Parmacia), уравновешенную 20 мМ Трис рН 8,0, диализуют против этого же буфера. Химерный белок элюируют возрастающим градиентом NaCl 0-1 М в 20 мМ Трис, рН 8,0. Фракции, содержащие указанный GST-белок, объединяют, концентрируют и загружают в гель-фильтрационную колонку HiLoad 26/60 Superdex 200 (Amersham-Parmacia), предварительно уравновешенную PBS. Фракции, содержащие химерный белок, объединяют и концентрацию данного белка определяют с помощью ВСА (Perbio). Выход колеблется между 1 и 43 мг на литр культуры.

Молекулярные массы фрагментов и их распознавание антителами против РА подтверждают с использованием SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга. Анализ укороченных rPA с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга обнаруживает белковые полосы ожидаемого размера. Некоторая деградация всех исследованных укороченных rPA обнаруживает их явное сходство с рекомбинантным РА, экспрессируемым B.subtilis. Укороченные rPA GST1, GST1b-2 и GST1-2, в отсутствие домена 3, оказываются особенно чувствительными к деградации. Это аналогично тому, о чем сообщалось в отношении конструкций rPA, содержащих мутации в домене 3, которые невозможно выделить путем очистки из культуральных супернатантов B.anthracis (Brossier 1999), что свидетельствует о том, что домен 3, вероятно, стабилизирует домены 1 и 2.

В данном исследовании используют самок совершенно здоровых A/J-мышей (Harlan UK), поскольку они являются подходящей моделью для заражения сибирской язвой (Welkos, 1986). К началу данного исследования мыши были половозрелыми в возрасте семи недель.

A/J-мышей иммунизируют в 1-й и 28-й дни данного исследования 10 мкг химерного белка, адсорбированного до 20% 1,3% об/об Alhydrogel (HCI Biosector, Denmark) в общем объеме 100 мкл PBS. Были также включены группы животных, иммунизированных rPA из B.subtilis (Miller 1998) вместе с рекомбинантным контрольным белком GST или химерными белками, кодирующими домены 1, 4 и 1-4, которые содержат удаляемую GST-метку. Иммунизирующие дозы вводят внутримышечно в участки на задних лапках. У мышей берут образцы крови через 37 дней после первой иммунизации на анализ сывороточных антител с помощью фермент-зависимого иммуносорбентного анализа (ELISA).

Планшеты для микротитрования (Immulon 2, Dynex Technologies) покрывают в течение ночи при 4°С 5 мкг/мл rPA, экспрессируемого B.subtilis (Miller, 1998), в PBS, за исключением двух рядов на планшете, которые покрывают 5 мкг/мл мышиных антител против Fab (Sigma, Poole, Dorset). Планшеты промывают PBS, содержащим 1% об/об Твина 20 (PBS-T), и блокируют 5% вес/об обезжиренным порошковым молоком в PBS (реагент для анализа вестерн-блоттингом) в течение 2 ч при 37°С. В лунки, покрытые rPA, приливают сыворотку, разбавленную в два раза 1%-ным реагентом для анализа вестерн-блоттингом, и анализируют в повторе со стандартным мышиным IgG (Sigma), добавляемым к анти-Fab- антителам, покрывающим лунки, и инкубируют в течение ночи при 4°С. После промывки во все лунки добавляют пероксидазу хрена, конъюгированную с антителами козы против IgG мыши (Southern Biotechnology Associates Inc.), разбавленными 1:2000 в PBS, и инкубируют в течение 1 ч при 37°С. Планшеты вновь промывают перед добавлением субстрата 2,2'-Azinobis (3-этилбензтиазолинсульфоновая кислота) (1,09 мМ ABTS, Sigma). Через 20 мин инкубации при комнатной температуре измеряют поглощение в лунках при 414 нм (Titertek Multiscan, ICN Flow). Стандартные кривые рассчитывают с использованием программного обеспечения Titersoft version 3.1c. Титры были представлены в виде мкг IgG на мл сыворотки с вычислением групповых средних ± стандартная ошибка для данной средней (sem). Полученные результаты представлены на Фиг.5.

Все полученные укороченные rPA оказались иммуногенными и повышали у A/J-мышей средние значения концентраций IgG антисыворотки к rPA в диапазоне от 6 мкг на мл в группе, иммунизированной укороченным GST1b-2, до 1488 мкг на мл в группе, иммунизированной укороченным GST 1-4 (Фиг.5). У контрольных мышей, иммунизированных GST, антитела против rPA не обнаруживались.

Мышей заражали спорами B. anthracis STI на 70-й день режима иммунизации. Из штамма выделяли достаточное количество STI-спор, промывали дистиллированной водой и ресуспендировали в PBS до концентрации 1х10⁷ и 1х10⁶ спор на мл. Мышей заражали внутрибрюшинно 0,1 мл объемами, соответственно содержащими 1х10⁶ и 1х10⁵ спор на мышь, и контролировали их в течение 14 дней после заражения для установления их защитного статуса. Гуманное отношение к животным строго соблюдалось в том отношении, что выбраковывались те животные, у которых наблюдались клинические симптомы, сочетание которых указывает на наличие у него смертельной инфекции. Численность иммунизированных мышей, которые выживали к 14-му дню после заражения, приведена в Таблице 3.

Таблица 3 Домен Уровни заражения MLD выжившие/количество зараженных (%)     10² MLD 10³ MLD GST 1 3/5 (60) 1/5 (20) GST 1b-2 1/5 (20) Nd GST 1-2 5/5 (100) 3/5 (60) GST 1b-3 3/5 (60) Nd GST 1-3 4/5 (80) Nd GST 1-4 Nd 5/5 (100) GST 2-4 Nd 5/5 (100) GST 3-4 Nd 5/5 (100) GST 4 5/5 (100) 5/5 (100) GST 1+ GST 4 Nd 5/5 (100) Отщепляемый 1 1/5 (20) 2/5 Отщепляемый 4 5/5 (100) 5/5 Отщепляемый 1-4 Nd 5/5 rPA Nd 4/4 (100) контроль 0/5 (0) 0/5 (0) MLD = приблизительно 1х10³ STI-спор
Nd = не определялось

Все группы, зараженные 10³ MLD STI-спор, были полностью защищены, за исключением групп, иммунизированных GST1, GST1-2 и отщепленным доменом 1, где отмечен некоторый сбой в защите, и в контрольной группе, иммунизированной лишь GST, в которой все оказались восприимчивы к инфекции, со средним временем гибели (MTTD) 2,4±0,2 дня. При самом низком уровне заражения 10² MLD GST1-2, GST4 и отщепленным доменом 4 все иммунизированные группы были полностью защищены, но в других группах отмечен некоторый сбой в защите. Мыши, которые погибли в этих группах, характеризовались MTTD 4,5±0,2 дня, что несущественно отличается от контрольной группы, иммунизированной GST, в которой все погибли с показателем MTTD 4±0,4 дня.

Изобретение касается способа получения иммуногенного реагента, который вызывает иммунный ответ на инфекцию Bacillus anthracis, включающего в себя один или несколько полипептидов, которые вместе представляют три домена полноразмерного защитного антигена (РА) из В. anthracis или их варианты, и по меньшей мере один из указанных доменов включает в себя домен 1 или домен 4 РА или его вариант. Данные полипептиды указанного иммуногенного реагента, а также полноразмерный РА продуцируются в результате экспрессии в рекомбинантной клетке E.coli. Изобретение раскрывает также вектор экспрессии и нуклеиновую кислоту с процентной долей остатков гуанидина и цитозина более 35%, кодирующую иммуногенный полипептид, являющийся защитным антигеном (РА). Использование данного способа обеспечивает высокий выход иммуногенного полипептида. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл.

1. Способ получения иммуногенного полипептида, являющегося защитным антигеном (PA) Bacillus anthracis, или его варианта, которые способны вызвать защитный иммунный ответ, включающий трансформирование Escherichia coli, кодирующей указанный полипептид нуклеиновой кислотой, у которой процентная доля остатков гуанидина и цитозина более 35%, культивирование трансформированной клетки Escherichia colt-хозяина и извлечение из нее иммуногенного полипептида.

2. Способ по п.1, где процентная доля остатков гуанидина и цитозина в указанной нуклеиновой кислоте составляет более 45%.

3. Способ по п.2, где процентная доля остатков гуанидина и цитозина в указанной нуклеиновой кислоте составляет от 50-52%.

4. Рекомбинантная клетка Escherichia coli, трансформированная нуклеиновой кислотой с процентной долей остатков гуанидина и цитозина более 35%, кодирующей защитный антиген (PA) Bacillus anthracis или его вариант, способные вызывать защитный иммунный ответ, и экспрессирующей иммуногенный полипептид, являющийся защитным антигеном (PA) Bacillus anthracis, или его вариант, способные вызывать защитный иммунный ответ.

5. Рекомбинантная клетка Escherichia coli по п.4, где процентная доля остатков гуанидина и цитозина в указанной нуклеиновой кислоте составляет более 45%.

6. Рекомбинантная клетка Escherichia coli no п.5, где процентная доля остатков гуанидина и цитозина в указанной нуклеиновой кислоте составляет от 50-52%.

7. Рекомбинантная клетка Escherichia coli по п.6, где указанная нуклеиновая кислота представляет собой SEQ ID NO 1, которая приведена на Фиг.2, или ее модифицированную форму.

8. Рекомбинантная клетка Escherichia coli по п.7, где указанная нуклеиновая кислота представляет собой последовательность SEQ ID NO 1.

9. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту с процентной долей остатков гуанидина и цитозина более 35%, кодирующую защитный антиген (РА) Bacillus anthracis, или его вариант, способные вызывать защитный иммунный ответ, для трансформации клетки Escherichia coli для экспрессии иммуногенного полипептида, являющегося защитным антигеном (PA) Bacillus anthracis, или его варианта, способных вызывать защитный иммунный ответ.

10. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуногенный полипептид, являющийся защитным антигеном (PA) Bacillus anthracis, или его вариант, способные вызывать защитный иммунный ответ, имеющая или содержащая нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO 1, или по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO 1 при условии, что процентная доля остатков гуанидина и цитозина составляет 35%.

11. Нуклеиновая кислота по п.10, которая представляет собой последовательность SEQ ID NO 1.

12. Нуклеиновая кислота по п.10, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO 1.

13. Нуклеиновая кислота по п.12, которая содержит последовательность SEQ ID NO 1.