Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии, в частности генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую синтез капсульного антигена (F1-антигена) чумного микроба и протективного антигена (PA) сибиреязвенного микроба (Bacillus anthracis).
Капсульный антиген - основной иммуноген чумного микроба. Известны рекомбинантные ДНК, определяющие синтез FI-антигена. EcoRI фрагмент плазмиды pFra, содержащий fra-оперон, клонирован в составе космиды pHC79 [1].
Протективный антиген является основным иммуногеном сибиреязвенного микроба. Ген, кодирующий синтез PA, также клонирован в E.coli в составе вектора pBR322 [2].
Однако в литературе не описано случаев, когда оба этих антигена клонированы в составе одной плазмиды.
Задачей изобретения является получение новой плазмиды, содержащей гены fra-оперона чумного микроба и PA сибиреязвенного микроба.
Задача решается тем, что сконструирована новая рекомбинантная плазмида proPF5, содержащая указанные гены.
Полученная рекомбинантная ДНК при введении ее в аттенуированные штаммы сальмонелл может создать возможность получения бивалентной живой пероральной вакцины против особо опасных инфекций - чумы и сибирской язвы.
Рекомбинантная плазмида proPF5, размером 20 тпо, кодирующая синтез FI-антигена чумного микроба и PA сибиреязвенного микроба, является неконъюгативной и состоит из ClaI-PstI фрагмента малой плазмиды pPstI чумного микроба размером 3,8 тпо, содержащего ген иммунности к пестицину и область начала репликации, PstI-ClaI фрагмента плазмиды pBR325, размером 2,2 тпо, содержащего ген устойчивости к хлорамфениколу, Bam HI фрагмента плазмиды pro+, содержащего ген, кодирующий протективный антиген сибиреязвенного микроба размером 6 тпо и EcoRI фрагмента плазмиды pKM1, размером 8 тпо, содержащего fra-оперон чумного микроба.
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК proPF5.
Плазмидную ДНК pro+ гидролизуют рестриктазой BamHI и лигируют с плазмидной ДНК pUC19, также гидролизованной BamHI, затем полученной смесью трансформируют компетентные клетки штамма E.coli JM83, подращивают их 1 ч в бульоне LB и высевают на плотную среду МакКонки, содержащую 50 мкг/мл ампициллина. Рекомбинантные клоны, имеющие светлую окраску, анализируют на продукцию протективного антигена в реакции диффузионной преципитации (РДП) в геле с гипериммунной моновалентной сывороткой против РА. Из клонов, продуцирующих РА, щелочным методом выделяют плазмидную ДНК, обозначенную pro19. Затем выделенную плазмидную ДНК pro19 гидролизуют рестриктазой BamHI и лигируют с плазмидной ДНК pP5, гидролизованной рестриктазой BglII. При этом сайты BamHI/BglII ликвидируются. Полученной смесью трансформируют компетентные клетки штамма E.coli JM83, подращивают 1 ч в бульоне LB и высевают на чашки с L-агаром, содержащим 20 мкг/мл хлорамфеникола. Клоны, резистентные к хлорамфениколу, анализируют на продукцию РА в РДП в геле с гипериммунной сывороткой против РА. Из клонов, продуцирующих РА, выделяют плазмидную ДНК, обозначенную proP5, и гидролизуют ее рестриктазой PvuII, дающей тупые концы.
На следующем этапе плазмидную ДНК pKM1, содержащую fra-оперон, гидролизуют рестриктазой EcoRI, затем, добавив смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, достраивают липкие концы с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Данную инкубационную смесь соединяют с ранее полученным рестриктом proP5/PvuII и лигируют с помощью ДНК-лигазы фага T4. Полученным лигатом трансформируют компетентные клетки штамма E. coli JM83, подращивают 1 ч в бульоне LB и высевают на чашки с L-агаром, содержащим 20 мкг/мл хлорамфеникола. Выросшие клоны, устойчивые к хлорамфениколу, анализируют на продукцию капсульного антигена (F1) чумного микроба в реакции пассивной гемагглютинации с коммерческим эритроцитарным чумным иммуноглобулиновым диагностикумом. Из клонов, продуцирующих FI и РА, выделяют плазмидную ДНК, обозначенную proPF5.
Плазмида proPF5 стабильно наследуется в E.coli JM83. После 80 генераций в L-бульоне без селективного давления стабильность была 100%.
На фиг. 1 показана схема конструирования плазмиды proPF5, расположение генов и ее рестрикционная карта для основных рестриктаз; на фиг. 2 показано происхождение фрагментов плазмидной ДНК proPF5.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Способ выделения плазмидной ДНК из бактерий E.coli JM83.
Клетки бактерий E.coli JM83, содержащие плазмиду pUC19 (аналогично выделяются все остальные плазмиды, указанные в настоящем изобретении), выращивают в 10 мл L-бульона, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, при 30oC до титра 1•109. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 5 мин, 4oC), ресуспендируют в 0,5 мл раствора (лизоцим 2 мг/мл, трис-HCl, pH 8,0 - 25 мМ, ЭДТА 10 мМ, глюкоза 50 мМ), выдерживают 5 мин при 0oC. Далее прибавляют 1 мл раствора, содержащего 0,2 н NaOH и 1% додецилсульфата натрия, смесь перемешивают, выдерживают 3 мин во льду и добавляют 0,8 мл раствора ЗМ ацетата калия (pH 4,8), осторожно перемешивают до заметного снижения вязкости раствора и оставляют на 30 мин во льду. Образовавшийся осадок удаляют из смеси центрифугированием (15000 g, 5 мин, 4oC) и к полученному супернатанту добавляют 1 мл изопропанола, выдерживают 15 мин при комнатной температуре и центрифугируют. Осадок растворяют в 1 мл деионизованной H2O, добавляют 20 мкл 5M NaCl и 2,5 объема этилового спирта, выдерживают 2 ч при 20oC, осадок плазмидной ДНК собирают центрифугированием, промывают его 70%-ным этиловым спиртом и суспендируют в 0,3 мл ТЕ-буфера (трис-HCl 10 мМ, pH 8,0, ЭДТА 1 мМ). Полученные препараты плазмидной ДНК прогревают 5 мин при 68oC и используют для конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК proPF5.
Пример 2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК proPF5.
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК proPF5 проводят следующим образом; 0,5 мкг ДНК плазмиды pUC19 и 1,0 мкг ДНК плазмиды pro+ инкубируют с рестриктазой BamHI (5 ед.) в буфере (10 мМ трис-HCl, pH 7,6, 100 мМ MgCl2, 1 мМ 2-меркаптоэтанол). После инкубации смесь прогревают при 68oC 10 мин. Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза в 0,7% агарозном геле.
Соединение фрагментов ДНК проводят в том же буфере с добавлением АТФ и дитиотреитола до конечной концентрации 0,5 мМ и 5 мМ соответственно и 0,2 ед. ДНК-лигазы фага T4. Лигирование проводят в течение 12 ч при 6oC. Полученную после лигирования смесь используют для трансформации клеток E. coli JM83.
Трансформацию проводят следующим образом: 1 мл ночной культуры E.coli JM83 вносят в 100 мл L-бульона, подращивают на качалке в течение 40 мин при 37oC. Клетки собирают центрифугированием (5000 g, 10 мин, 0oC), промывают равным объемом стерильного физраствора (0oC), суспендируют в 50 мл 0,1 М раствора CaCl2 (0oC) и выдерживают во льду 1 ч. Клетки повторно центрифугируют (5000 g, 10 мин, 0oC), затем ресуспендируют в 3 мл 0,1 М CaCl2 (0oC), выдерживают ночь во льду, добавляют равный объем 20%-ного стерильного глицерина (0oC), разливают по 200 мкл в промороженные эппендорфы, помещают их на -70oC и эти аликвоты компетентных клеток используют для трансформации. В 200 мкл размороженных компетентных клеток добавляют ДНК и выдерживают 30 мин при 0oC, затем 2 мин при 42oC, добавляют 0,8 мл L-бульона, подращивают 1 ч при 37oC и высевают на плотную среду МакКонки, содержащую 50 мкг/мл ампициллина. Трансформанты выращивают при 37oC в течение 18 ч, отбирают светлые колонии и анализируют их на продукцию PA в РДП в геле (0,15 М NaCl, 10 мМ натрий-фосфатный буфер, pH 8,3, 1% агар Дифко), которую проводят следующим образом: в геле делают три лунки, расположенные на равном расстоянии друг от друга (0,5 см), в одну из них вносят раствор РА (40 мкг), в другую - коммерческую моновалентную сыворотку против протективного антигена, в третью - лизированные клетки исследуемых клонов E. coli JM83. Лизирующая смесь имеет следующий состав: 1% тритон X-100, 20 мМ ЭДТА, 0,5 мг/мл лизоцим. После лизина клеток вносим 3 мкл ДНКазы (5 мг/мл), содержащей 60 мМ MgCl2.
Гель с образцами оставляют при комнатной температуре во влажной камере на ночь. Клоны, продуцирующие РА, образуют полосу преципитации, сливающуюся с контрольной.
Из отобранных клонов, продуцирующих РА, выделяют плазмидную ДНК pro19, проводят гидролиз 1 мкг этой плазмидной ДНК рестриктазой BamHI (5 ед.) в условиях, описанных выше, и лигируют с 0,5 мкг векторной плазмидной ДНК pP5, гидролизованной рестриктазой BglII (5 ед.) в буфере (10 мМ трис-HCl, pH 7,6, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ 2-меркаптоэтанол), предварительно прогрев реакционные смеси 10 мин при 68oC. Лигирование проводят, как описано выше. Полученную лигирующую смесь используют для трансформации компетентных клеток E. coli JM83. Трансформацию проводят, как описано выше, только после подращивания клетки высевают на чашки с L-агаром, содержащим 20 мкг/мл хлорамфиникола и выращивают 18 ч при 37oC. Выросшие клоны анализируют на продукцию РА в РДП, как описано выше. Из клонов, продуцирующих РА, выделяют плазмидную ДНК pro5 описанным выше способом, и используют ее в качестве вектора, предварительно гидролизовав 0,5 мкг плазмидной ДНК proP5 5 ед. рестриктазы PvuII в буфере (10 мМ трис-HCl, pH 7,6, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ 2-меркаптоэтанол) в течение 1 ч при 37oC и прогреве 10 мин при 68oC. 1 мкг Плазмидной ДНК pKM1 гидролизуют 5 ед. рестриктазы EcoRI в буфере (50 мМ трис-HCl, pH 7,6, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ 2-меркаптоэтанол) 1 ч при 37oC, после этого в инкубационную смесь вносят по 1 мкл 2 мМ раствора всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1 ед. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli и инкубируют смесь 10 мин при комнатной температуре, затем ее прогревают 10 мин при 68oC. После прогрева инкубационную смесь соединяют с плазмидной ДНК proP5, гидролизованной рестриктазой PvuII, добавляют дитиотрейтол до конечной концентрации 5 мМ, 1 мМ АТФ, 1 ед. ДНК - лигазы фага T4 и инкубируют 12 ч при 6oC. Полученным лигатом трансформируют компетентные клетки E. coli JM83 описанным выше способом, высевая клетки на чашки с L-агаром, содержащим 200 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивают 18 ч при температуре 37oC. Выросшие клоны анализируют на продукцию FI-антигена чумного микроба в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с коммерческим эритроцитарным иммуноглобулиновым диагностикумом. РПГА проводят следующим образом: в 8 лунок микротитровальной пластинки вносят по 50 мкл раствора твина 80 1 : 50 тыс. Затем в первую луночку вливают 50 мкл суспензии клеток исследуемого клона, выращенного при 37oC, и титруют по 50 мкл. Таким образом получают ряд двукратных последовательных разведений. Затем во все луночки добавляют по 25 мкг диагностикума чумного эритроцитарного иммуноглобулинового 0,6% концентрации и пластинки ставят в термостат на 37oC. Через 30 мин учитывают результат. Его считают положительным при равномерном выпадении эритроцитов на дно лунок. Клоны, продуцирующие капсульный антиген, тестируют повторно на продукцию РА, как описано выше.
Источники информации.
1. Galyov E.E., Smirnov O.Ju., Karlishev A.V., Volkovoy K.J., Denesyuk A.J., Nazimov J.V., Rubtsov K.S., Abramov V.M., Dalvadyanz S.M., Zavyalov V. P. Nucleotide sequence of the Jersinia pestis gene encoding FI antigen and the primary structure of the protein. FEBS Lett., 1990, v. 277, N 1,2, p. 230 - 232.
2. Vodkin M.H., Leppla S.H., Cloning of the protective antigen gene of Bacillus anthracis. Cell, 1983, v. 34, p. 693 - 697.
Использование: биотехнология, разработка диагностических и профилактических препаратов в области микробиологии. Сущность: получение рекомбинантной плазмидной ДНК pro PF5, определяющей синтез капсульного антигена F1 возбудителя чумы и протективного антигена возбудителя сибирской язвы. Плазмиду pro PF5 получают путем соединения фрагмента плазмиды pro P5, кодирующего протективный антиген возбудителя сибирской язвы, и фрагмента плазмиды pKM1, содержащего fra-оперон с геном, кодирующим капсульный антиген F1 возбудителя чумы. Рекомбинантная плазмидная ДНК pro PF5 стабильно наследуется в E. coli JM83. После 80 генераций в L-бульоне без селективного давления стабильность составляет 100%. 2 с.п. ф-лы, 2 ил.
