ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к производству питательных сред и может быть использовано в медицине и ветеринарии при микробиологической диагностике бактериальных болезней животных и человека.

Известны жидкие питательные среды на основе сырья животного происхождения, в частности на основе мясной воды (мясопептонный бульон, мясопептонный печеночный бульон и т.д.). Мясную воду как полуфабрикат для изготовления питательных сред готовят на основе мясного фарша (1 кг фарша смешивают с 2 л дистиллированной воды, кипятят 1 час, отстаивают, фильтруют, доливают водой до исходного объема, размешивают в емкости и стерилизуют 30-40 минут при 120°С). Для изготовления мясопептонного бульона к мясной воде добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида и кипятят в течение 30-40 минут, устанавливают необходимый уровень рН и кипятят повторно 30 минут, отстаивают, фильтруют, фасуют и стерилизуют при 1 атм. в течение 30 минут. Плотные и полужидкие питательные среды готовят путем внесения в бульон агар-агара в количестве 2-3% (плотные среды) или 0,15-0,4% (полужидкие среды) (см. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных. Справочник. М., 2005, с.33-41 - прототип).

Однако использование мяса для производства питательных среды не является экономически обоснованным, тем более при использовании мяса, пригодного для питания. Кроме этого среда обладает невысоким спектром выявления различных видов микроорганизмов (т.е. информативностью).

Необходима разработка экономически обоснованной эффективной питательной среды, исключающей использование в качестве сырья дорогостоящего мяса, обладающей повышенной информативностью и при малых сроках культивирования микроорганизмов при первичном посеве.

Указанный технический результат достигается тем, что в качестве жидкой фракции, являющейся основой при изготовлении питательных сред для выращивания микроорганизмов, предварительно полученной путем термически обработанного в водной среде сырья животного происхождения с последующим внесением 1% пептона, 0,5% натрия хлорида при рН 7,6 и 1% агар-агара, используется пантолизат на основе пантового шрота, являющегося побочным продуктом при производстве пантокрина. Пантолизат готовят экстракцией смеси шрота и воды в соотношении шрот: вода 1:4-1:5, температуре процесса 98-99°С, под давлением 1,5 атм, в течение 3-4 часов.

Пантовая мука, из которой путем спиртовой экстракции готовят пантокрин, содержит 31% аминокислот от веса исходного панта (глицин, аспарагиновая кислота, пролин, лизин, аргинин, аланин, лейцин, серии, гистидин, треонин, валин, тирозин, фенилаланин, изолейцин, таурин, саркозин, глюкозилин). Минеральный состав пантовой муки представлен кальцием, магнием, железом, кремнием, фосфором, натрием, алюминием - основа зольных элементов панта. Кроме этого в малых количествах в пантовой муке содержится никель, медь, теллур, марганец, свинец, барий и в микроколичестве - кобальт, вольфрам, стронций, молибден, бор. Класс липидов представлен фосфолипидами, стеринами, жирными кислотами, триглицеридами. В наличии и витамины группы В.

Общий химический анализ пантового шрота показывает, что из 100 г пантовой муки (размолотый пант) в пантокрин переходит 3% сухого вещества, а 90% суммарного содержания аминокислот и 30% липидов остаются в шроте. Предпосылкой для изучения возможности использования водного экстракта пантового шрота в качестве основы для выращивания микроорганизмов являлось следующее.

Для построения тела микробной клетки, а также источника энергии, требуется азот, углерод, водород и кислород, при этом снабжение водородом и кислородом осуществляется за счет воды, углерод является составной частью органических соединений, в том числе белков и аминокислот, а источником азота служат белки животного происхождения. Все микробные клетки состоят из сложного комплекса не только органических, но и минеральных соединений, участвующих в образовании коферментов, посредством которых такие сложные вещества как белки, жиры и полисахариды подвергаются гидролизу до более простых и растворимых в воде соединений, легко ассимилирующихся микробами. Наличие таких минеральных веществ как фосфор, натрий, калий и магний необходимо для создания требуемых для жизни микробных клеток физико-химических условий питательной среды и построения цитоплазмы. Липидная составляющая пантового шрота также представляет собой важный фактор жизнедеятельности микроорганизмов.

Исследования физико-химических свойств пантового шрота приведены в таблице 1.

Таблица 1 Наименование показателя Шрот из панта марала (после изготовления пантокрина для инъекции) Шрот из панта марала (после изготовления пантокрина для внутреннего употребления) Влага (первоначальная), %, % 1,1 3,0 Влага гигроскопическая, %, % 6,5 9,7 Жир, %, % 0,31 0,48 Азот общий, %, % 7,72 7,91 Азот белковый, %, % 7,31 7,76 Азот остаточный, %, % 0,24 0,19 Зола, %, % 43,26 40,34 Белок, %, % 47,74 50,09 Абсолютное сухое вещество, %, % 91,42 90,20 Органическое вещество, %, % 48,34 49,91

Таким образом, физико-химический состав пантового шрота вполне отвечает требованиям, предъявляемым к сырью для производства жидкой основы питательных сред, при условии разработки таких параметров процесса экстрагирования пантового шрота, при которых в пантолизате будет достаточное количество необходимых для выращивания микроорганизмов веществ.

Предварительными исследованиями по изучению ряда технологических параметров на процесс экстракции было определено положительное влияние избыточного давления, степени разведения шрота водой и времени проведения процесса экстракции на выход компонентов. На основании предварительных исследований был проведен опыт по выявлению оптимального сочетания параметров процесса экстракции, характеризующегося наибольшим процентом выхода сухого вещества при щадящей температуре 98-99°С, соотношениях шрот: вода 1:4, 1:5, 1:6 в течение 2, 3, 4, 5 часов при давлении 1, 1,5, 2 атм. Результаты влияния параметров процесса экстрагирования пантового шрота на процент выхода сухого вещества отражены в таблице 2.

Таблица 2 Давление, атм Время проведения процесса, (час) при соотношении шрот: вода 2 3 4 5 1:4 1:5 1:6 1:4 1:5 1:6 1:4 1:5 1:6 1:4 1:5 1:6 1 1,3 1,7 2,0 2,1 2,3 2,3 2,2 2,4 2,4 2,3 2,4 2,4 1,5 1,8 2,2 2,4 3,6 4,2 4,3 3,8 4,6 4,6 3,7 4,5 4,5 2,0 1,8 2,3 2,4 3,8 4,3 4,3 3,9 4,6 4,5 3,9 4,6 4,6

Как видно из таблицы 2 проведения процесса экстракции при атмосферном давлении, он характеризовался максимальным выходом сухого вещества на уровне 2,4%, обеспечивая величину содержания общего азота в 100 мл пантолизата на уровне 190 мг. Проведение процесса при избыточном давлении (на наш взгляд в связи с уменьшением вязкости бульона и более интенсивного растворения белков) - 1,5 атм выход сухого вещества резко возрастал и достигал при разведении 1:4 и 1:5 и времени проведения экстракции 3 и 4 часа 3,6-4,6%, обеспечивая величину содержания общего азота на уровне 294-375 мг в 100 мл пантолизата. Общеизвестно, что для интенсивного роста большинства микроорганизмов необходимо содержание общего азота в 100 мл бульона на уровне не менее 200-300 мг.

Таким образом, оптимальным режимом водной экстракции пантового шрота при получении пантолизата следует считать режим: температура 98-99°С, в течение 3-4 часов, соотношении шрот: вода 1:4 и 1:5 при давлении 1,5 атм, обеспечивающий выход общего азота на уровне 294-375 мг на 100 мл пантолизата. Проведение процесса при 2 атм при всех прочих параметрах не обеспечило достоверного различия в сравнении с 1,5 атм, как и 5-ти часовая экстракция по сравнению с 4-часовой.

Питательная среда на основе пантолизата была испытана на 5 представителях 2-х семейств микроорганизмов: Micrococcaceae и Enterobacteriaceae. В таблице 3 приведены сравнительные испытания питательной смеси (характер роста микроорганизмов) по прототипу (мясопептонный бульон) и питательных смесей, приготовленных на основе пантолизата, полученного в режимах:

- соотношение шрот: сырье 1:5, экстракция в течение 3 часов при 1,5 атм и 98-99°С;

- соотношение 1:4, время 4 часа, 1,5 атм, 98-99°С.

Таблица 3 Вид микроорганизма и показатели роста Питательные среды на основе мясной воды (МПБ) пантолизата (в режиме 1:5, 3 часа, 1,5 атм, 98-99°С) пантолизата (в режиме 1:4, 4 часа, 1,5 атм, 98-99°С) 1. Staphylococcus St. aureus, St. epidermidis       Время появления роста 12 часов 9 часов 11 часов Характер роста Интенсивное, равномерное помутнение среды Равномерное помутнение среды Прозрачная среда Осадок Легко суснендируемый слизистый осадок Легко суспендируемый слизистый осадок Легко суспендируемый слизистый осадок 2. Streptococcus Str. pneumonic       Время появления роста Роста нет 15 часов 21 час Характер роста   Равномерное помутнение Среда прозрачная Осадок   Осадок, подымающийся в виде "косички" Осадок, подымающийся в виде "косички" 3. Enterobacteriaceae E.coli, Enterobacter aerogenes       Время 11 часов 4 часа 9 часов появления роста Помутнения нет Слабое помутнение Слабое Характер роста     помутнение Осадок Осадок, подымающийся в виде "косички" Осадок, подымающийся в виде"косички" Осадок, подымающийся в виде "косички" Характер роста мясной воды (МПА) пантолизата (в режиме 1:5, 3 часа, 1,5 атм, 98-99°С) пантолизата (в режиме 1:4, 4 часа, 1,5 атм, 98-99°С) 1. Staphylococcus St. aureus, St. epidermidis       Время появления роста 12 ч 9 ч 9 ч Количество колоний 35, 80 70, 130 47, 115 Размер колоний 4-5 мм 2-4 мм 2-5 мм Форма колоний Круглая Круглая Круглая Края Ровные Ровные Ровные Поверхность Гладкая, блестящая Гладкая, блестящая Гладкая, Рельеф Выпуклые Выпуклые блестящая Прозрачность Непрозрачные Непрозрачные Выпуклые Консистенция Слизистая Слизистая Непрозрачные Цвет Серо-белый с желтым оттенком, серо-белый Желтый, серо-белый Слизистая
Желтый, серо-белый 2. Streptococcus
Str. pneumonic       Время появления роста роста нет 15 ч 15 ч Количество колоний   100 26 Размер колоний   1 мм 1 мм Форма колоний   Правильная Правильная Края   круглая круглая Поверхность   Ровные Ровные Рельеф   Блестящая, гладкая Блестящая, Прозрачность   Выпуклые гладкая Консистенция   Полупрозрачные Выпуклые Цвет   Слизистые Полупрозрачные     Белый с голубоватым оттенком Слизистые
Белый с голубоватым оттенком 3. Enterobacteriaceae E.coli, Enterobacter aerogenes       Время появления роста 12-14 ч 9-10 ч 12 ч Количество 20; 40 17, 54 15, 46 колоний 3-4 мм 2-3 мм 2-4 мм Размер колоний Правильная круглая Правильная Правильная Форма колоний Ровные круглая круглая Края Гладкая, блестящая Ровные Ровные Поверхность Выпуклые Гладкая, блестящая Гладкая, Рельеф Полупрозрачная Выпуклые блестящая Прозрачность Пастообразная Полупрозрачная Выпуклые Консистенция Кремово-белый Пастообразная Полупрозрачная Цвет   Кремово-белый Пастообразная Кремово-белый

Анализируя данные таблицы, видно, что при использовании питательной среды с пантолизатом повышается ее информативность при культивировании E.coli, Enterobacter aerogenes, St. aureus, St. epidermidis, а при культивирования Str. pneumonic нет необходимости в добавлении 20% сыворотки крови лошади, без добавления которой этот микроорганизм не растет на общепринятых средах МПБ и МПА. Таким образом, новая среда с добавлением пантолизата позволяет не использовать мясо (снизить себестоимость приготовления среды) в изготовлении среды; улучшает информативность среды; сокращает сроки появления первичного роста и накопления бактериальной массы микроорганизмов; позволяет обойтись без дополнительных факторов роста, необходимых для культивирования Str. pneumonic, что делает данную среду предпочтительнее для первичного посева, так как на ней культивируется большее количество микроорганизмов.

Пример. Питательную среду для выращивания микроорганизмов готовят следующим образом: 200 г пантового шрота смешивают с 1 л дистиллированной воды, смесь помещают в экстрактор и экстрагировали при 98°С под давлением 1,5 атм в течение 3-х часов. Содержимое емкости фильтровали через ватно-марлевый фильтр с последующей стерилизацией при 120°С в течение 40 минут. После стерилизации экстракт фильтровали вторично. Для приготовлении 500 грам среды берут 487,5 г экстракта (пантолизата) и смешивают с 5 г пептона, 2,5 г натрия хлорида и 5 г агар-агара (для приготовления плотной среды), доводят рН до 7,6. После установления рН среду кипятят в течение 30 минут, отстаивают, фильтруют, фасуют в пробирки и стерилизуют при 1 атм в течение 30 минут.

Таким образом, использование отходов пантокринового производства (пантового шрота) в качестве сырья в производстве питательных сред для выращивания микроорганизмов (при найденных технологических параметрах процесса экстракции пантового шрота, обеспечивающих достаточное количество извлеченных из шрота компонентов для роста и развития микроорганизмов) позволяет сократить расход мясного сырья и обеспечить высокую эффективность полученной питательной среды путем расширения спектра выявления различных видов микроорганизмов и сокращения сроков их культивирования.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при микробиологической диагностике бактериальных заболеваний животных и человека. Питательная среда содержит пантолизат из пантового шрота, полученный путем экстракции пантового шрота водой в соотношении 1:4-1:5 соотвествено при температуре 98-99°С под давлением 1,5 атм в течение 3-4 часов, пептон, хлорид натрия и агар - агар в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки культивирования микроорганизмов и повысить селективные качества питательной среды. 3 табл.

Питательная среда для выращивания микроорганизмов, содержащая в качестве основы термически обработанное в водной среде сырье животного происхождения, пептон, натрия хлорид, агар-агар, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы среда содержит пантолизат из пантового шрота, полученный путем экстракции пантового шрота водой в соотношении 1:4-1:5 соответственно при температуре 98-99°С под давлением 1,5 атм в течение 3-4 ч, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
пептон 1,0 хлорид натрия 0,5 агар-агар 1,0 пантолизат остальное