ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ПРИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к производству питательных сред, и может быть использовано в медицине и ветеринарии при диагностике туберкулеза.

Известны яичные среды для выращивания первичных культур микобактерий туберкулеза, среды: Петраньяни, Гельберта, Левенштейна-Йенсена. Расход яиц на приготовление вышеприведенных сред составляет 10-16 штук на 1 л среды («Наставление по диагностике туберкулеза животных», МСХ РФ Департамент ветеринарии, М., 2002, с.44-48).

Известна яичная среда Финн-2 для выращивания первичных культур микобактерий туберкулеза, которая в бактериологической диагностике (согласно многим исследованиям) характеризовалась более высокой эффективностью. Питательная среда Финн-2 содержит солевую основу, включающую:

- магний сернокислый - 0,5 г;

- натрий лимоннокислый - 1,0 г;

- квасцы железоаммиачные - 0,05 г;

- калий фосфорнокислый однозамещенный - 20,0 г;

- алюминий лимоннокислый однозамещенный - 5,0 г;

- натрий глутоминовокислый однозамещенный - 10,0;

- глицерин - 20 мл;

- вода дистиллированная - до 1000 мл.

Ингредиенты растворяют в указанной последовательности в теплой дистиллированной воде при pH 6,3-6,5. Раствор стерилизуют при 1 атм в течение 20 минут. Цельные яйца в количестве 40 штук (2000 мл) гомогенизируют до образования однородной массы, в которую добавляют 33 мл 2%-ного раствора малахитовой зелени и 1 литр солевого раствора. Смесь фильтруют, разливают по пробиркам и свертывают при температуре 85°С в течение 30 минут (см. там же среда Финн-2 - прототип).

Однако использование яичных сред для выращивания первичных культур микобактерий туберкулеза характеризуется большим расходом яиц, являющихся одним из основных продуктов питания человека. Кроме этого в связи с эволюционной изменчивостью возбудителя, бесконтрольным применением лекарственных средств и биопрепаратов снизилась информативность бактериологических исследований при туберкулезе.

Необходима разработка питательной среды, позволяющей сократить расход яиц при производстве питательных сред и повысить их информативность.

Указанный технический результат достигается тем, что питательная среда, включающая солевую основу, яйца, водный 2%-ный раствор малахитовой зелени, дополнительно содержит пантолизат на основе пантового шрота, являющегося побочным продуктом при производстве пантокрина. Питательная среда представлена следующим соотношением компонентов, мл:

- солевая основа - 1000;

- яйца (20-34 мг) - 1700-1000;

- пантолизат - 300-1000;

- 2%-ный раствор малахитовой зелени - 33

Пантолизат готовят экстракцией смеси шрота и воды в соотношении шрот:вода 1:4-1:5, температуре процесса 98-99°С под давлением 1,5 атм в течение 3-4 часов.

Химический анализ пантового шрота показывает, что в пантокрин при его производстве переходит всего 3% сухого вещества пантовой муки (размолотого панта). 90% суммарного содержания аминокислот и 30% липидов остаются в пантовом шроте. Таким образом, после водной экстракции пантового шрота в пантолизате находится достаточное количество аминокислот, микро- и макроэлементов и липидов. Качественный состав липидов представлен в пантолизате фосфолипидами, стеринами, жирными кислотами, триглицеридами, эфирами стеридов. Микобактерии весьма устойчивы к воздействию факторов внешней среды и химическим веществам, именно из-за наличия в микробной клетке жировосковых веществ. В отличие от других микроорганизмов микобактерии туберкулеза характеризуются высоким содержанием липидов, достигающим 10-40% сухого вещества микобактерий. Фосфолипиды составляют около 20% от всех липидов микобактерий. В растущих клетках микобактерий происходит как синтез, так и расщепление фосфолипидов, являющихся существенными структурными элементами клеточных стенок микобактерий. Глицериды и воски служат запасными внутриклеточными веществами: когда клетка использует весь субстрат среды, она начинает потреблять внутренние резервы. Таким образом, увеличение липидной составляющей в модифицированной среде Финн-2, при более высоком и более разнообразном аминокислотном ее составе, является новой питательной средой, которая должна обеспечить наиболее высокую интенсивность и качественные показатели роста микобактерий.

Для разработки модифицированной среды на основе питательной среды Финн-2 15%, 25 и 50% яичной массы заменяли на равное количество пантолизата, с условием, что объем 1-го яйца - 50 мл, при прежнем количестве солевой основы и 2%-ного раствора малахитовой зелени.

Результаты исследований отражены в таблице 1.

Таблица 1 Вид микроорганизма и показатели роста Питательные среды в опытах Финн-2 (контроль) Финн-2 с пантолизатом (15%) Финн-2 с пантолизатом (25%) Финн-2 с пантолизатом (50%) прототип 1 опыт 2 опыт 3 опыт M.flavescens (атипичные)         Первичный рост, суток 3 3 3 3 Первичный рост, % 100 100 100 100 Характер роста сплошной рост сплошной рост сплошной рост сплошной рост М. bovis         Первичный рост, суток 6 6 6 6 Интенсивный рост, суток 21 16 17 19 Первичный рост, % 61 80 80 60 Характер роста 75 точечных колоний 150 точечных колоний 147 точечных колоний 100 точечных колоний Биоматериал от морской свинки (органы с характерными изменениями)         Первичный рост, суток 16 16 16 16 Интенсивный рост, суток 26 20 20 21 Первичный рост, % 50 100 100 70 Характер роста 87 точечных колоний 140 точечных колоний 136 точечных колоний 95 точечных колоний

Как видно из таблицы 1, замена 15, 25 и 50% яичной массы на пантолизат существенно повлияла на улучшение ростовых качеств при выращивании М. bovis и микобактерий из биоматериала от морской свинки. При выращивании М. flavescens (являющейся одной из многочисленных в количественном отношении микобактерий, изолированных из биоматериала маралов (18,8%) и обуславливающих сенсибилизацию животных к туберкулезу) ростовые качества среды не уступают данным показателям среды Финн-2 (контроль).

Сроки появления первичных колоний М. bovis были одинаковы на всех испытуемых средах (6 суток), однако на среде Финна-2 первичный рост на 6 сутки был отмечен лишь в 6 пробирках из 10 (60%), как и на модифицированной среде при 50%-ной замене яичной массы на пантолизат (3 опытная среда), в то время как на 1 и 2 опытных средах (при 15 и 25%-ной замене) первичный рост на 6 сутки наблюдался в 8 пробирках из 10 (80%). В дальнейшем во всех 40 пробирках происходил интенсивный рост колоний, однако сроки накопления бактериальной массы в 1 и 2 опытных группах были значительно меньше. На 21 сутки на среде по прототипу было отмечено 75 точечных колоний (в среднем на одну пробирку), на 1, 2, 3 опытных средах уже на 16, 17 и 19 день этот показатель составил 150, 147 и 100 колоний соответственно.

Высокая результативность опытных сред наблюдалась и при изоляции М. bovis из биоматериала от морской свинки (органы с характерными изменениями). Интенсивный рост культур был обнаружен на 5 (21-16) суток раньше на 3 опытной среде при наличии 95 точечных колоний и на 6 суток раньше на 1 и 2 опытных средах при наличии 140 и 136 точечных колоний, в отличие от прототипа (среда Финн-2), где на 26 сутки насчитывалось всего 87 колоний.

Как видно из таблицы 1, испытания опытных сред были проведены на средах от 15 до 50%-ной замене яичной массы на пантолизат и, поскольку с увеличением процента замены от 25 до 50 несколько снижалась результативность показателей роста по сравнению с 25%-ной заменой, исследования с еще более высоким процентом замены следовало считать нецелесообразным, тем более что показатели роста на 3 опытной среде (50% замены) были хотя и несколько выше, но очень близки показателям по прототипу (среда Финн-2). Таким образом, опытные среды с 15-50%-ной заменой яичной массы на пантализат заметно стимулирует рост микобактерий, повышая информативность питательной среды.

Пример 1. Модифицированную питательную среду готовят следующим образом:

1) 1 литр солевой основы (включающей 0,5 г магния сернокислого (MgSО₄·7H₂О), 1,0 г натрия лимоннокислого, 0,05 г квасцов железоаммиачных, 20 г калия фосфорнокислого однозамещенного (K₂НРО₄), 5,0 г аммония лимоннокислого однозамещенного, 20 мл глицерина (С₃Н₈О₃), и растворенных в указанной последовательности в теплой дистиллированной воде) стерилизуют при 1 атм в течение 20 минут.

2) 20 цельных яиц моют в теплой воде с мылом, обрабатывают спиртом, разбивают в стерильную колбу и взбалтывают до образования однородной массы.

3) 2 г малахитового зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды, стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 30 минут.

4) К 1000 мл яичной массы (20 яиц, т.е 50%-ная замена яиц пантолизатом), смешанной с 1000 мл пантолизата добавляют 33 мл 2%-ного раствора малахитовой зелени и 1000 мл солевого раствора. Смесь фильтруют через марлевый фильтр, разливают в пробирки по 4-5 мл и свертывают при температуре 85°С в течение 30 минут.

Пример 2. Технология приготовления ингредиентов и модифицированной питательной среды по примеру 1. Соотношение ингредиентов:

- солевая основа - 1000 мл;

- яичная масса (30 яиц, т.е 25%-ная замена яичной массы на пантолизат) - 1500 мл;

- пантолизат - 500 мл;

- 2%-ный раствор малахитовой зелени - 33 мл.

Пример 3. Технология приготовления ингредиентов и модифицированной питательной среды по примеру 1. Соотношение ингредиентов:

- солевая основа - 1000 мл;

- яичная масса (24 яйца, т.е. при 40% замены яичной массы на пантолизат) - 1200 мл;

- пантолизат - 800 мл;

- 2%-ный раствор малахитовой зелени - 33 мл.

Пример 4. Технология приготовления ингредиентов и модифицированной питательной среды по примеру 1. Соотношение ингредиентов:

- солевая основа - 1000 мл;

- яичная масса (34 яйца, при 15%-ной замене яичной массы на пантолизат) - 1700 мл;

- пантолизат - 300;

- 2%-ный раствор малахитовой зелени - 33.

Таким образом, использование заявленной питательной среды для выращивания первичных культур микобактерий при бактериологической диагностике туберкулеза позволяет сократить расход яиц при производстве питательных сред и повысить их информативность.

Питательная среда для выращивания первичных культур микобактерий включает солевую основу в составе: магний сернокислый - 0,5 г, натрий лимоннокислый - 1,0 г, квасцы железоаммиачные - 0,05 г, калий фосфорнокислый однозамещенный - 20,0 г, алюминий лимоннокислый однозамещенный - 5,0 г, натрий глутаминовокислый однозамещенный - 10,0, глицерин - 20 мл, вода дистиллированная - до 1000 мл, яичную массу, 2%-ный раствор малахитовой зелени и пантолизат пантового шрота, при следующем соотношении компонентов, мл: солевая основа 1000, яичная масса 700-1000, пантолизат 300-1000, 2%-ный раствор малахитовой зелени 33. Пантолизат пантового шрота готовят путем водной экстракции пантового шрота при соотношении шрот: вода 1:4-1:5, температуре процесса 98-99°С под давлением 1,5 атм в течение 3-4 ч. Это обеспечивает улучшение ростовых качеств среды и повышение ее информативности. 1 табл.

Питательная среда для выращивания микобактерии при бактериологической диагностике туберкулеза, включающая солевую основу в составе: магний серно-кислый - 0,5 г, натрий лимонно-кислый - 1,0 г, квасцы железоаммиачные - 0,05 г, калий фосфорно-кислый однозамещенный - 20,0 г, алюминий лимонно-кислый однозамещенный - 5,0 г, натрий глутаминово-кислый однозамещенный - 10,0, глицерин - 20 мл, вода дистиллированная - до 1000 мл, яичную массу, 2%-ный раствор малахитовой зелени, отличающаяся тем, что питательная среда дополнительно содержит пантолизат пантового шрота, приготовленный путем водной экстракции пантового шрота при соотношении шрот: вода 1:4-1:5, температуре процесса 98-99°С под давлением 1,5 атм в течение 3-4 ч, при следующем соотношении компонентов, мл:
солевая основа 1000 яичная масса 1700-1000 пантолизат 300-1000 2%-ный раствор малахитовой зелени 33