ШТАММ Lactobacillus plantarum - ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКА Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 C12P21/00 C12R1/25 

Изобретение относится к пищевой промышленности, биотехнологии, сельскому хозяйству.

Известны дрожжи Saccharomices cerevisiae расы У-1986 - (Патент RU №2183666, С12F 3/10, опубл. 2002 г.) (1).

Дрожжи данной расы используют для сбраживания зернового сусла в спиртовом производстве. Их функцией является переработка сахаров сусла в спирт. Кормовой продукт при этом не является целевым продуктом, его утилитарное назначение не определено. Он является отходом спиртового производства, загрязняющим окружающую среду. Контроль за качеством и составом данного отхода осуществлять трудно.

Известен штамм дрожжей Candida tropicalis ВСБ-928К - продуцент кормового белка (Патент RU №2042713, С12Р 1/100, опубл. 20.06.2002 г.) (2) (прототип).

Недостатком данного известного штамма является использование для получения кормового белка дрожжей рода Candida, которые являются условно патогенным микроорганизмом, что требует выполнения дополнительного процесса термолиза и наличия специального оборудования, сложной системы обезвреживания стоков и воздушных выбросов при значительных объемах используемого воздуха. Санитарно-эпидемиологическими правилами СанПиН 2.3.2.1078-01 дрожжи рода Candida включены в перечень веществ, которые оказывают вредное воздействие на здоровье человека. Скорость роста клеток известного штамма невысокая, что удлиняет производственный цикл и снижает удельный выход целевого продукта на стадии биосинтеза. Кроме того, при приготовлении кормового белка с использованием данного известного штамма дрожжей требуется большой расход тепло- и энергоресурсов для высушивания биомассы и значительный расход (1,5 г/л) сульфата аммония.

Наиболее близким к данному изобретению является штамм Lactobacillus plantarum 578/25 - продуцент кормового белка (Патент RU №2244001, C1 С12N 1/20, С12F 21/00//(С12N 1/20, C12R 1:25) (опубл. 10.01.2005 г.).

Недостатком данного изобретения является недостаточно высокая концентрация биомассы, накапливаемая в присутствии 2,5% молочной кислоты, а следовательно, недостаточное количество белка, которое могло бы образоваться культурой.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является исключение загрязнения окружающей среды, снижение энергозатрат при приготовлении кормового белка, упрощение аппаратурного оснащения, утилизация отходов производств, использующих природное сырье, повышение биологической ценности кормового белка за счет обеспечении возможности обогащать микрофлору кишечника животных живыми клетками молочнокислых бактерий.

Указанный технический результат достигается тем, что в качестве продуцента кормового белка используют вновь выделенный штамм Lactobacillus plantarum 578/26, депонированный во Всероссийской Государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, регистрационный номер - штамм Lactobacillus plantarum ВГНКИ-08.02.54.-ДЕП (123022, г.Москва, Звенигородское шоссе, 5). Местом хранения штамма определена коллекция микроорганизмов ГНУ ВНИИПБТ (111033, Москва, ул.Самокатная, д.4Б).

Использование бактерий в качестве продуцента белкового корма является более эффективным, так как бактерии образуют до 75% белка по массе, в то время как дрожжи - не более 60%. Использование нового штамма Lactobacillus plantarum 578/26 для приготовления белкового корма не требует расхода воздуха и энергозатрат на его подачу, так как данный штамм молочнокислых бактерий является анаэробом. Штамм обладает широким спектром антимикробного действия, что исключает развитие посторонней микрофлоры в процессе биосинтеза и поэтому не требуется наличие специального оборудования для соблюдения условий стерильности. Возможность утилизации разнообразных отходов отраслей промышленности, использующих природное сырье, при наращивании биомассы нового штамма с целью приготовления белкового корма, решает экологические проблемы предприятий.

Ниже приведены примеры реализации изобретения.

Пример 1

Штамм Lactobacillus plantarum 578/26 был получен путем многократных (не менее 35) пересевов клеток исходного штамма Lactobacillus plantarum В 578 на плотную питательную среду следующего состава:

Мясная вода 400 мл Дрожжевой экстракт 5,0 г Натрия ацетат 5,0 г Глюкоза 5,0 г Аммония цитрат 2,5 г K₂HPO₄ 2,0 г MgSO₄·7H₂O 0,2 г МnO₄·4Н₂O 0,05 г Твин 80 1 мл Агар 20,0 г Вода дистиллированная до 600 мл

Содержание свободной молочной кислоты в среде постепенно повышали от 0 до 3,5%. Клетки инкубировали на плотной питательной среде при 37°С в течение 24 час. Отбор осуществляли по количеству колоний и по кислотообразующей способности, которую определяли титрованием. Отбирали те колонии, рост которых на плотной питательной среде не ингибировался в присутствии 3,5% молочной кислоты. После 35 пересевов штамм достиг генетической устойчивости. Результаты отбора нового штамма Lactobacillus plantarum 578/26 путем ступенчатого селекционирования приведены в таблице 1, свидетельствующей о том, что при содержании в среде молочной кислоты до 2,5%, рост клеток нового штамма молочнокислых бактерий (в отличие от исходного штамма) не ингибируется и характеризуется достаточно большим количеством клеток. При большем содержании молочной кислоты (3,5%) происходит резкое снижение количества клеток и морфология клеток меняется.

Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1
Сравнение свойств исходного и нового штаммов Lactobacillus plantarum Наименование штамма Концентрация молочной кислоты, % Количество клеток в 1 мл культуральной жидкости Lactobacillus plantarum В 578 0 1,5·10⁹ (исходный штамм) 0,5 1,0·10⁷   1,0 1,0·10⁵   1,25 1,0·10³ Lactobacillus plantarum В 578/26 0 2,0·10¹¹   1,0 1,5·10⁹   2,0 1,0·10⁷   2,5 1,5·10⁵   3,0 2,0·10⁴   3,5 1,0·10³

Для размножения штамма наиболее крупные колонии пересевали на жидкую питательную среду следующего состава:

Мясная вода 400 мл Дрожжевой экстракт 5,0 г Натрия ацетат 5,0 г Глюкоза 2,5 г Аммония цитрат 2,5 г K₂HPO₄ 2,0 г MgSO₄·7H₂O 0,2 г MnSO₄-4H₂O 0,05 г Твин 80 1 мл Вода дистиллированная до 600 мл

Для длительного хранения клетки штамма лиофилизировали в сепарированном молоке и хранили в условиях отсутствия кислорода. Клетки штамма можно также хранить на 10%-ном сахарозно-желатиновом агаре или в полужидкой среде под маслом.

Штамм не является зоопатогенным или фитопатогенным. Он не представляет опасности по другим причинам.

В соответствии с Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9 edition, 1994, Williams & Wilkins, USA, выделенный штамм идентифицирован как Lactobacillus plantarum 578/26.

Культурально-морфологическе особенности штамма: неподвижные палочки размером (0,9-1,2)×(3-8) мкм. Грам-положительные. Неспорообразующие. Аэротолерантные. Сбраживает фруктозу, лактозу, галактозу, глюкозу (кислота), мальтозу, маннит, рибозу, сахарозу, целлобиозу. Образует DL-формы молочной кислоты. Оптимум рН 5,8-6,0. Оптимум температуры 37°С.

Пример 2

Штамм Lactobacillus plantarum 578/26 был оценен по способности образовывать повышенное содержание белка путем культивирования его на жидкой питательной среде состава, указанного в примере 1, по результатам измерения количества образовавшейся в культуральной жидкости биомассы и сырого протеина.

Инокулят в количестве десяти объемных процентов вносили в колбы с жидкой питательной средой объемом 750 мл и проводили культивирование в стационарных условиях при соблюдении следующих параметров: температура 37°С, рН 6,0. В качестве нейтрализующего агента использовали 20%-ный раствор гидроокиси натрия. После 24 часов культивирования определяли рост бактерий и количество образовавшейся в процессе биосинтеза биомассы и сырого протеина в культуральной жидкости. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Характеристика выделенного штамма Lactobacillus plantarum 578/26 Наименование показателя Величина показателя Количество клеток в 1 мл культуральной жидкости 2,0·10⁹ Удельный выход от субстрата, мас % 96,0 Массовая доля сырого протеина, % 49,5

На основании полученных результатов сделан вывод о том, что селекционированный штамм обладает высокой продуктивностью в отношении целевого продукта - накопления биомассы (исходное содержание бактериальных клеток было равно 1,0·10⁵), высоким удельным выходом от используемого субстрата и накоплением сырого протеина до 49,5% против 25% у исходного штамма. Штамм может быть использован в промышленном масштабе.

Новый штамм Lactobacillus plantarum 578/26 позволяет получать белковый корм с высоким выходом при утилизации отходов производств: послеспиртовой барды, пивной дробины, отходов мукомольного и крахмального производств, отходов переработки зернового и плодового сырья.

Пример 3

На послеспиртовой барде выращивают чистую культуру Lactobacillus plantarum 578/26.

По окончании процесса ферментации полученную массу разделяют на твердую и жидкую фазу путем фильтрования.

Твердую фазу направляют на высушивание при температуре (80-90)°С.

Кормопродукт, получаемый после высушивания твердой фазы, содержит 46,0% сырого протеина и имеет следующий состав:

массовая доля углеводов, % по св. 45,0 массовая доля золы, % по св. 2,5 общее содержание аминокислот, % 43,4

из них

лизин+гистидин 2,2 аргинин 1,25 аспарагиновая кислота 4,25 треонин 2,0 серии 2,08 глутаминовая кислота 14,84 метионин+цистин 1,3 глицин 2,6 пролин 3,14 фенилаланин+тирозин 2,65 аланин 4,4 изолейцин+лейцин 2,53 массовая доля белка по Барштейну, % по св. 37,1 массовая доля жира, % по св. 5,1 общее содержание микроэлементов, мг/кг 21800

из них

фосфор 5900 калий 3500 натрий 500 кальций 11600 магний 1000 железо 750 кобальт 4,9

содержание витаминов, мг/кг

Е(токоферол) 43,5 B₁(тиамин) 3,3 В₂(рибофлавин) 8,0 В₃(пантотеновая кислота) 35,3 В₄(холин) 800 В₅(никотиновая кислота) 26,8 В₆(пиридоксин) 8,2 В₉(фолиевая кислота) 18,0 обменная энергия, МДж 13,4 кормовых единиц, кг 1,39

Полученная после фильтрации жидкая фаза с содержанием в г/л:

сухих веществ 10,1 массовая доля азотистых веществ 1,04 массовая доля золы 1,3 массовая доля жира 0,006 массовая доля углеводов 1,7 массовая доля аммонийного азота 0,04 общее содержание аминокислот,% 0,29 общее содержание микроэлементов 1,05 общее содержание витаминов 1,01 содержание лактата, г/100 мл 3,0

Полученный кормовой продукт содержит живые клетки молочнокислых бактерий, обогащающие микрофлору кишечника животных, потребляющих корм, что приводит к повышению его биологической ценности.

Пример 4

Культуральную жидкость после ферментации с помощью Lactobacillus plantarum 578/26 по примеру 3 подвергают предварительной фильтрации. После фильтрации получается осадок влажностью 50-61%, который может использоваться в качестве готового влажного корма.

Пример 5

В молочную сыворотку с содержанием сухих веществ 4-5%, подогретую до 50°С, вносят 20% об. клеток чистой культуры Lactobacillus plantarum 578/26. Инкубацию проводят в течение 4 час, при температуре 45°С и рН 5,9-6,0. После высушивания полученной биомассы получают белково-витаминный корм, содержащий живые клетки молочнокислых бактерий в экспоненциальной фазе роста.

Пример 6

Пивную дробину разводят водопроводной водой в соотношении 1:1, устанавливают рН на уровне 5,8-6,0, температуру 59-61°С и вносят 1,4 ед/г условного крахмала α-амилазы. Смесь выдерживают в этих условиях в течение 55 мин, а затем - 55 мин при температуре 74-76°С. После охлаждения смеси до 59-61°С вводят в нее 0,4 ед/г α-амилазы и выдерживают в этих условиях в течение 35 мин. Смесь охлаждают до 45-50°С и вносят 5,5 ед/г условного крахмала глюкоамилазы и выдерживают при рН 5,0 до достижения содержания редуцирующих веществ 6%, после чего в приготовленный ферментолизат пивной дробины вносят чистую культуру Lactobacillus plantarum 578/26 в количестве 10% об. Инкубацию ведут при периодическом перемешивании в течение 18 час при температуре 50°С и рН 5,9-6,0.

Полученную биомассу молочнокислых бактерий, находящихся в экспоненциальной фазе роста, высушивают и получают белково-витаминный корм.

Жизнеспособность клеток в готовом высушенном белковом корме сохранилась.

Полученный белково-витаминный продукт содержал протеина 49,7% по св., аминокислот 44,3% по св., углеводов 37,8% по св.

Пример 7

Мукомольные отходы измельчают до прохода не менее 80% через сито с ячейками диаметром 1 мм. Готовят водную суспензию измельченных мукомольных отходов путем их смешивания с водой в соотношении 1:3. В приготовленную суспензию вносят 20 ед/г сухого вещества целлюлозы целлюлолитического фермента β-глюканазы и выдерживают приготовленную смесь при температуре 59-61°С и рН 6,0 в течение 55 мин, а затем при температуре 105°С в течение 25 минут до достижения содержания редуцирующих веществ 3-5%, после чего дополнительно вносят 8 ед/г целлюлозы β-глюканазы и 5 ед./г условного крахмала глюкоамилазы. Приготовленную смесь выдерживают при температуре 45°С и рН 5,0 в течение 30 мин до достижения содержания редуцирующих веществ 7-10%.

После обработки осахаренную массу используют для инкубации на ней микроорганизмов Lactobacillus plantarum 578/26 при температуре 45°С и рН 5,9-6,0. Через 24 часа образуется белково-витаминный продукт с массовой долей протеина до 49,7% по св., с содержанием аминокислот 44,3% по св., содержанием углеводов 37,8% по св.

Пример 8

Крахмальные отходы обрабатывают аналогично зерновому сырью и мукомольным отходам, исключая стадию измельчения. При приготовлении смеси - крахмальные отходы - вода, количество воды регулируют так, чтобы получить суспензию концентрацией 14-16%.

На полученной среде проводят инкубацию Lactobacillus plantarum 578/26.

Получают корм, богатый биологически активными веществами и белком.

Пример 9

Измельченное зерно, мукомольные отходы или крахмальные отходы используют для приготовления ферментолизатов путем обработки их водных суспензий амилолитическими ферментами. Для этого в водную суспензию вносят 1,4 ед/г условного крахмала α-амилазы, смесь выдерживают 55 мин при температуре 59°С и рН 5,8, затем 35 мин при 95°С, после чего смесь охлаждают до 45°С, вводят в нее 0,4 ед/г условного крахмала α-амилазы и 6,5 ед/г условного крахмала глюкоамилазы. Выдерживают приготовленную смесь 30 мин при температуре 45°С и рН 5,0 до достижения содержания редуцирующих веществ 7% с получением ферментолизата, на котором инкубируют чистую культуру Lactobacillus plantarum 578/26 с получением полноценного белково-витаминного корма.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве для приготовления корма. Штамм Lactobacillus plantarum 578/26 депонирован в коллекции ВГНКИ под номером ВГНКИ - 08.02.54. - ДЕП. Данный штамм является продуцентом кормового белка. Изобретение позволяет исключить загрязнение окружающей среды при производстве белкового корма, повысить удельный выход белка, снизить энергозатраты при приготовлении белкового корма, упростить и ускорить процесс его приготовления, упростить аппаратурное оснащение, утилизировать отходы производств, использующих природное сырье. 2 табл.

Штамм Lactobacillus plantarum 578/26 - продуцент белкового корма, депонированный в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте пищевой биотехнологии (ГНУ ВНИИПБТ Россельхозакадемии).