ЭКОБИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ ОТ НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/26 C02F3/34 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для очистки естественных водоемов, загрязненных нефтью и продуктами ее переработки.

Экобиопрепарат представляет собой культуру клеток микроорганизма - деструктора нефтепродуктов, иммобилизованных на сорбенте-носителе. В качестве сорбента-носителя используются алюмосиликатные микросферы [1, 2, 3, 4], представляющие собой полые сферические частицы правильной формы диаметром от 30 до 350 мкм с толщиной стенки от 2 до 10 мкм, внутренняя полость которых заполнена в основном азотом и двуокисью углерода, следующего состава (мас.%):

SiO₂ - 50÷60; Al₂O₃ - 25÷35; Fe₂O₃ - 1,8÷2,0; CaO - 1÷5; MgO - 0,5÷1,5; Na₂O - 0,3÷1,5; K₂O - 0,2÷2,9,  

а в качестве биодеструктора нефтепродуктов используется штамм Pseudomonas fluorescens ВКПМ 6844.

Аналогами изобретения являются экобиопрепараты, предназначенные для очистки нефтезагрязненных водоемов: «Путидойл», «Авалон», «Эконадин» и другие.

Известен способ очистки воды от нефтепродуктов с помощью экобиопрепарата «Эконадин» (разработка Кожановой Г.А., UA), предназначенный для очистки воды от нефтяных загрязнений [5]. Основой данного экобиопрепарата являются иммобилизованные на сфагновом торфе клетки природного штамма Pseudomonas fluorescens 2-a.

Несмотря на высокую скорость утилизации нефтепродуктов недостатком данного экобиопрепарата является то, что после адсорбции нефтяной пленки он оседает на дно водоема, принося значительный ущерб бентосным организмам. Такой способ очистки водной поверхности от нефтепродуктов нельзя считать эффективным и экологически безопасным.

Наиболее близок изобретению по совокупности существенных признаков экобиопрепарат «Авалон» (разработка Лимбах И.Ю. с соавторами, С.Петербург), где в качестве пористого носителя используются вспененные стеклообразные метафосфаты переменного состава, а в качестве биодеструкторов используются штаммы нефтеокисляющих микроорганизмов Serracia marcescens PL-1, Pseudomonas fluorescens biovar II 10-1, Acidovorax delafieldii 3-1, клетки которых иммобилизованы в поры носителя [6].

Несмотря на то, что в данном экобиопрепарате обеспечиваются оптимальные условия для иммобилизации и жизнедеятельности клеток микроорганизмов на пористой структуре в течение длительного времени, недостатком данного экобиопрепарата является низкая скорость утилизации нефтепродуктов.

В таблице 1 представлены данные по составу экобиопрепаратов - аналогов, условиям и эффективности их применения [5-8].

Представленные в таблице 1 экобиопрепараты после нанесения их на загрязненную нефтепродуктами поверхность воды либо оседают на дно водоема, либо имеют невысокую скорость нефтеокисляющей активности.

Цель изобретения - создание нового экобиопрепарата, способного быстро локализовать разлив нефтепродукта, обладающего высокой углеводородокисляющей активностью и способностью длительно находиться на поверхности воды в зоне максимального загрязнения, позволяющего более эффективно осуществлять мероприятия по очистке водоемов, загрязненных нефтепродуктами, по сравнению с существующими аналогами.

Данная цель достигается тем, что в качестве сорбента-носителя используются алюмосиликатные микросферы, представляющие собой полые сферические частицы правильной формы диаметром от 30 до 350 мкм, с толщиной стенки от 2 до 10 мкм, внутренняя полость которых заполнена азотом и двуокисью углерода, имеющие следующий состав (мас.%):

SiO₂ - 50÷60; Al₂O₃ - 25÷35; Fe₂O₃ - 1,8÷2,0; CaO - 1÷5; MgO - 0,5÷1,5; Na₂O - 0,3÷1,5; K₂O - 0,2÷2,9,  

вследствие чего сорбент-носитель обладает высокой плавучестью и нефтепоглощающей способностью и позволяет создавать высокую концентрацию активных микробных клеток на поверхности раздела фаз вода-нефть.

Высокая углеводородокисляющая активность в отношении нефти и продуктов ее переработки в широком интервале температур при высокой исходной концентрации нефти (нефтепродуктов) в загрязненной среде достигается благодаря использованию в качестве основы экобиопрепарата штамма Pseudomonas fluorescens B-6844, активно утилизирующих углеводороды нефти.

Культура микроорганизма выделена из почв Уральского региона, загрязненных горюче-смазочными материалами, на селективных питательных средах, содержащих в качестве единственного источника углеродного питания углеводороды нефтепродуктов. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Штамм хранят на агаризованной питательной среде (мясо-пептонный агар) при температуре (4±2)°С.

Штамм Pseudomonas fluorescens B-6844 представляет собой аэробные грамотрицательные мелкие подвижные палочки с закругленными концами, расположенные одиночно или попарно, размером 0,6-1,1*1,3-4,5 мкм.

На белковых средах образует круглые колонии 3,0-3,5 мм в диаметре, выпуклые, гладкие, с более плотным центром и плоским краем, цвета агара, блестящие, непрозрачные, со временем приобретающие матовую поверхность и розовый оттенок. Быстро (в течение 3 суток) растет при температуре (4±2)°С; при температуре +41°С и выше роста нет. Продуцирует внеклеточный флюоресцирующий желто-зеленый пигмент на белковых средах, особенно на МПА с глицерином при пониженных температурах. Аэроб. Окислительный тип метаболизма в тесте O/F. Оксидаза и каталаза положителны. Нитратредукция отсутствует. Галофильных свойств культура не проявляет, потребляет цитрат натрия. Желатин не разжижает, глюкозу не ферментирует.

Сущность изобретения заключается в получении экобиопрепарата путем глубинного культивирования клеток штамма Pseudomonas fluorescens В-6844 на минеральной среде следующего состава: K₂HPO₄ - 2,5 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; FeSO₄·7H₂O - 0,1 г; MgSO₄·7H₂O - 0,3 г; вода очищенная - до 1,0 дм³; глюкоза - 1% и нефть или дизельное топливо - 1%. Процесс культивирования проводят в ферментере при температуре (28±1)°С, рН (6,9±0,1) в течение (15±3) часов в аэробных условиях. После этого проводят иммобилизацию бактериальных клеток на сорбенте-носителе путем смешивания его с культуральной жидкостью, содержащей микроорганизмы с титром не менее 5-7·10⁹ кл.·см^-3. Поверхностное культивирование бактериальных клеток на сорбенте-носителе проводят при (28±1)°С в течение двух суток. Титр микроорганизмов составляет не менее 10¹⁰ жизнеспособных клеток в 1 г экобиопрепарата.

Принцип очистки предложенным способом заключается в следующем. При нанесении экобиопрепарата на загрязненную нефтепродуктами водную поверхность предлагаемый в качестве носителя бактериальных клеток сорбент активно адсорбирует на себе нефтяную пленку. Благодаря наличию во внутренней полости частиц сорбента азота и двуокиси углерода комплекс сорбент-нефть остается (не менее 30 сут) на поверхности воды, где содержание нефтепродуктов максимально, а микробные клетки Pseudomonas fluorescens В-6844, иммобилизованные на сорбенте, активно размножаются, используя углеводороды в качестве единственного источника углерода и энергии, вследствие чего повышается эффективность очистки водоема от нефтяного загрязнения. В то же время способность сорбента удерживать нефтепродукты на поверхности воды препятствует оседанию нефтяной пленки на дно водоема, благодаря чему не оказывается токсическое действие нефтепродуктов на рост и развитие бентосных организмов.

Пример 1. Для получения экобиопрепарата клетки Pseudomonas fluorescens B-6844 выращивают в ферментере при температуре (28±1)°С, рН (6,9±0,1) в течение (15±3) часов в аэробных условиях на минеральной среде следующего состава: K₂HPO₄ - 2,5 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; FeSO₄·7H₂O - 0,1 г; MgSO₄·7H₂O - 0,3 г; вода очищенная - до 1,0 дм³; глюкоза - 1% и нефть или дизельное топливо - 1%. После этого проводят иммобилизацию бактериальных клеток на сорбенте-носителе путем смешивания его с культуральной жидкостью, содержащей микроорганизмы с титром не менее 5-7·10⁹ кл.·см^-3. Поверхностное культивирование бактериальных клеток на сорбенте-носителе проводят при (28±1)°С в течение двух суток. Титр экобиопрепарата составляет не менее 10¹⁰ жизнеспособных клеток в 1 г,

где сорбент-носитель представляет собой полые сферические частицы (микросферы) правильной формы диаметром 35 мкм, с толщиной стенки 3 мкм следующего состава:

SiO₂ - 56,0%; Al₂O₃ - 34,1%; Fe₂O₃ - 1,8%; CaO - 4,0%; MgO - 1,1%; Na₂O - 0,9%; K₂O - 2,1%.  

Пример 2. Культуральную жидкость Pseudomonas fluorescens B-6844 получали согласно описанию на той же питательной среде, что и в примере 1. Иммобилизацию бактериальных клеток на сорбенте-носителе проводили путем смешивания его с культуральной жидкостью, содержащей микроорганизмы с титром не менее 5-7·10⁹ кл.·см^-3. Поверхностное культивирование бактериальных клеток на сорбенте-носителе проводили при (28±1)°С в течение двух суток. Титр экобиопрепарата составляет не менее 10¹⁰ жизнеспособных клеток в 1 г,

где сорбент-носитель представляет собой полые сферические частицы (микросферы) правильной формы диаметром 350 мкм, с толщиной стенки 10 мкм следующего состава:

SiO₂ - 58,6%; Al₂O₃ - 30,3%; Fe₂O₃ - 1,9%; CaO - 3,5%; MgO - 1,5%; Na₂O - 1,4%; K₂O - 2,8%.  

Пример 3. Резервуары объемом 1000 см³ заполняли озерной водой и вносили различное количество нефти (Нефтеюганского месторождения). На образовавшуюся нефтяную пленку наносили экобиопрепарат, представляющий собой культуру клеток Pseudomonas fluorescens ВКПМ 6844, иммобилизованных на полых сферических частицах (микросферах) правильной формы диаметром от 30 до 350 мкм с толщиной стенки от 2 до 10 мкм, внутренняя полость которых заполнена в основном азотом и двуокисью углерода, следующего состава (мас.%):

SiO₂ - 50÷60; Al₂O₃ - 25÷35; Fe₂O₃ - 1,8÷2,0; CaO - 1÷5; MgO - 0,5÷1,5; Na₂O - 0,3÷1,5; K₂O - 0,2÷2,9,  

из расчета 0,5 г препарата на 1 мл загрязнения. Резервуары устанавливали на открытой экспериментальной площадке в осенне-летний период. Температура окружающего воздуха в процессе проведения испытаний находилась в интервале от 10 до 28°С. На различные сроки наблюдения определяли остаточное содержание нефти в пробах методом ИК-спектрометрии.

Вид нефтяной пленки в резервуарах сверху позволял зафиксировать многочисленные нарушения ее целостности, представленные в виде светлых пятен. На протяжении всего времени инкубирования проб процесс биодеградации нефти проходил на поверхности воды.

Степень деградации нефтепродуктов рассчитывали как отношение разницы исходного и остаточного содержания нефтепродуктов в воде к их исходному содержанию, выраженное в процентах. Результаты испытаний представлены в таблице 2.

Результаты испытаний позволяют сделать вывод, что разработанный экобиопрепарат в интервале температур от 10 до 28°С обладает высокой деструктивной способностью в отношении нефтепродуктов, в том числе и при повышенной их концентрации в среде. Даже при исходном содержании нефтепродуктов 101,3 г·м^-2 степень их деградации экобиопрепаратом была значительной.

В результате проведенных опытов можно констатировать, что в сравнении с известными экобиопрепаратами разработанный экобиопрепарат обладает высокой нефтеокисляющей активностью, проявляющейся в короткие сроки. Использование разработанного экобиопрепарата для очистки нефтезагрязненных водных поверхностей позволяет повысить экологическую чистоту биоремедиационных технологий.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. ТУ 2164-001-26301532-2002 Нефтесорбенты неорганические - реагенты «Миксойл». Введены в действие 01.07.2002 г.

2. Каменщиков Ф.А., Богомольный Е.И. Нефтяные сорбенты. - Москва-Ижевск: Институт компьютерных исследований, 2003.

3. Свидетельство на полезную модель №19867 Россия. Е21В 43/26. Микросферы / Россия.

4. Свидетельство на полезную модель №19269 Россия. В03D 1/00. Установка для получения микросфер из летучей золы / Россия.

5. Пат. №2031860 Россия. C02F 3/34, Е02В 15/04. Способ очистки воды от нефтяного загрязнения / Россия.

6. Пат. 1076446 C02F 3/34, C12N 15/00. Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов / Россия.

7. Капотина Л.Н., Морщакова Г.Н. Биологическая деструкция нефти и нефтепродуктов, загрязняющих почву и воду // Биотехнология. - 1998. - №1. - С.85-92.

8. Пат. №2174496 Россия. C02F 3/34, С12Р 39/00. Биопрепарат «Авалон» для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, способ его получения / Россия.

МАТЕРИАЛЫ, ПОЯСНЯЮЩИЕ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таблица 1 Состав экобиопрепаратов, условия и эффективность их применения [5-8] Название экобиопрепарата Базовые штаммы микроорганизмов, добавки Максимальный уровень загрязнения, г·м^-2 Оптимальная температура применения, °С Степень деградации нефтепродуктов в процентах от исходного количества «Эконадин» Pseudomonas fluorescens 2a, торф 4,5 5-32 95-98* «Путидойл» Pseudomonas putida-36 100 30 65-75* «Биодеструктор» Различные микроорганизмы, адсорбенты, поверхностно-активные вещества 10 18-25 75-95* «Авалон» Serracia marcescens PL-1, Pseudomonas fluorescens biovar II 10-1, Acidovorax delafieldii 3-1, вспененные стеклообразные метафосфаты переменного состава 25 20 78-95* Примечание: * через 6 суток после применения
** через 2 месяца после применения

Таблица 2 Степень деградации иммобилизованным экобиопрепаратом нефтепродуктов с различным их исходным содержанием на поверхности воды Исходное содержание нефтепродуктов, г·м^-2 Степень деградации нефтепродуктов в пробах воды на … сутки, в процентах от исходного количества 7 14 28 15,6 62,1±2,3 78,9±1,7 90,6±1,1 25,1 57,6±3,2 69,5±4,1 85,6±4,3 48,2 41,8±6,5 52,6±4,4 76,5±6,7 101,3 29,6±3,2 42,9±2,8 63,5±2,3

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для очистки водоемов, загрязненных нефтью и продуктами ее переработки. Биопрепарат представляет собой культуру клеток биодеструктора, искусственно иммобилизованную на сорбенте-носителе. Причем в качестве сорбента-носителя он содержит полые сферические частицы правильной формы диаметром от 30 до 350 мкм, с толщиной стенки от 2 до 10 мкм, внутренняя полость которых заполнена в основном азотом и двуокисью углерода, имеющие следующий состав (мас.%): SiO₂ - 50÷60; Al₂O₃ - 25÷35; Fe₂O₃ - 1,8÷2,0; CaO - 1÷5; MgO - 0,5÷1,5; Na₂O - 0,3÷1,5; K₂O - 0,2÷2,9. А в качестве биодеструктора нефтепродуктов - штамм Pseudomonas fluorescens ВКПМ 6844. Способ получения данного биопрепарата включает глубинное культивирование штамма Pseudomonas fluorescens ВКПМ 6844 на жидкой питательной среде, подготовку вышеуказанного стерильного сорбента-носителя и поверхностное культивирование биодеструкторов на данном сорбенте-носителе. Экобиопрепарат для очистки воды от нефтепродуктов позволяет локализовать разлив за счет активного связывания нефтепродуктов сорбентом-носителем, активно утилизировать их при помощи микроорганизма-деструктора, находясь на поверхности воды, что позволяет повысить экологическую чистоту последствий очистки. 2 н.п. ф-лы, 2 табл.

1. Экобиопрепарат для очистки воды от нефтепродуктов, представляющий собой культуру клеток биодеструктора, искусственно иммобилизованную на сорбенте-носителе, отличающийся тем, что в качестве сорбента-носителя он содержит полые сферические частицы правильной формы диаметром от 30 до 350 мкм, с толщиной стенки от 2 до 10 мкм, внутренняя полость которых заполнена в основном азотом и двуокисью углерода, имеющие следующий состав, мас.%:
SiO₂ 50÷60 MgO 0,5÷1,5 Al₂O₃ 25÷35 Na₂O 0,3÷1,5 Fe₂O₃ 1,8÷2,0 K₂O 0,2÷2,9 CaO 1÷5

2. Способ получения экобиопрепарата по п.1 для очистки поверхности водоемов от нефтепродуктов, включающий глубинное культивирование биодеструктора на жидкой питательной среде, подготовку стерильного сорбента-носителя и поверхностное культивирование биодеструкторов на сорбенте-носителе, отличающийся тем, что в качестве сорбента-носителя используют полые сферические частицы правильной формы диаметром от 30 до 350 мкм, с толщиной стенки от 2 до 10 мкм, внутренняя полость которых заполнена в основном азотом и двуокисью углерода, имеющие следующий состав, мас.%:
SiO₂ 50÷60 MgO 0,5÷1,5 Al₂O₃ 25÷35 Na₂O 0,3÷1,5 Fe₂O₃ 1,8÷2,0 K₂O 0,2÷2,9 CaO 1÷5