БИОПРЕПАРАТ "АВАЛОН" ДЛЯ ОЧИСТКИ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2002 года по МПК C02F3/34 C12P39/00 B09C1/10 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/425 C12N1/20 C12R1/38 

Предлагаемое изобретение, названное авторами "АВАЛОН", относится к средствам борьбы с загрязнениями объектов окружающей среды.

Известны разнообразные биопрепараты на основе нефтеокисляющих микроорганизмов и их ассоциаций, предназначенные для очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов (патенты РФ 2053205, 1996, 2138451, 1999 г.).

Наиболее близким к предлагаемому биопрепарату "АВАЛОН" по совокупности существенных признаков является материал для биологической очистки вод, загрязненных фенолом и фенольными соединениями "ИПК-Ф" по патенту РФ 2107665, взятый нами за прототип. Прототип содержит пористый носитель и искусственно иммобилизованные в поры носителя биодеструкторы.

Недостатком данного материала является применение пассивного носителя бактерий, не обеспечивающего микроорганизмы источниками минерального питания, что снижает нефтеокисляющую активность штаммов-деструкторов и сокращает длительность хранения биопрепарата без потери качества.

Целью данного изобретения является разработка такого препарата, в котором обеспечивались бы оптимальные условия для иммобилизации и жизнедеятельности клеток микроорганизмов на пористой структуре в течение длительного времени, а также увеличивалась их нефтеокисляющая активность.

Данная цель достигается тем, что в качестве носителя используют вспененные переохлажденные закаленные расплавы метафосфатов переменного состава, включающие калий, магний, кальций, натрий, бор, кремний, и микроэлементы, влияющие на скорость растворения вспененного твердого носителя в водных растворах. В качестве биодеструкторов используют штаммы микроорганизмов, подобранные к типу загрязнений. Структура вспененного стеклообразного метафосфатного носителя обеспечивает оптимальные условия для иммобилизации и жизнедеятельности клеток микроорганизмов на пористой структуре. При этом значительно улучшаются условия их аэрации, увеличивается площадь питания клеток. Вспененные стеклообразные метафосфаты, являясь носителем для нефтеокисляющих бактерий, одновременно обеспечивают их минеральное питание. Благодаря указанным новым свойствам происходит значительное увеличение биологической активности препарата в отношении углеводородов.

Предлагаемый биопрепарат "АВАЛОН" для очистки объектов окружающей среды от техногенных загрязнений, как и прототип, содержит пористый носитель и биодеструкторы, искусственно иммобилизованные в поры носителя.

Биопрепарат отличается тем, что в качестве пористого носителя он содержит вспененные стеклообразные метафосфаты переменного состава, обеспечивающие оптимальные условия для иммобилизации и жизнедеятельности клеток микроорганизмов на пористой структуре со следующей структурной формулой:
A_m•B_n•[PО₄]_p•Z•X•H₂О
где m, n, p - простые целые числа в пределах: m=2-4; n=2-6; p=6-12,
А - одновалентные катионы первой группы,
В - двухвалентные катионы второй группы периодической системы,
Z - легирующие микроэлементы [Zn, Mn, Fe, Сu, Со, Ni, Мo, V, Se, Ag в концентрации 0,01÷0,3% каждого] и
X - добавки [SiО₃, В₂О₃, Аl₂О₃, V₂O₅, SO₃, SeO₃], влияющие на кинетику растворения при следующем соотношении компонентов, % массовые: КРО₃ - 10,0÷35,0%; NаРО₃ - 4÷8%; Mg(PО₃)₂ - 4,0÷18,0%; Са(РО₃)₂ - 20,0÷60,0%;
Z(РО₃)₂ - 1÷3%;
X - SiО₂ - 1,0÷15,0%; В₂О₃ - 1,0÷5,0%; Аl₂О₃ - 0,1÷5,0%; V₂O₅ - 0,1÷0,3%; SО₃ - 0,2÷2,0%; SeО₃ - 0,1÷0,3%,
а в качестве биодеструкторов содержит следующие штаммы микроорганизмов: Serratia marcescens PL-1, Pseudomonas fluorescens biovar II 10-1, Acidovorax delafieldii 3-1.

Химическая формула носителя с указанием мас.% приведена ниже:
КPO₃ - 10÷35%
NaPO₃ - 4÷8%
Mg(PO₃)₂ - 4÷18%
Ca(PO₃)₂ - 20÷60%
Zn(PO₃)₂ - 0,1÷0,8%
Mn(PO₃)₂ - 0,1÷0,8%
Fe(PO₃)₂ - 0,1÷0,8%
Cu(PO₃)₂ - 0,1÷0,8%
Co(PO₃)₂ - 0,1÷0,8%
Ni(PO₃)₂ - 0,1÷0,8%
Na₂B₄O₇ - 0,5÷5,0%
K₂MoO₄ - 0,1÷0,3%
K₂SeO₄ - 0,1÷0,5%
Na₂SO₄ - 0,1÷1,0%
AgJ - 0,01÷0,1%
CaV₂O₆ - 0,1÷0,5%
Na₂SiO₃ - 1,0÷15,0%
Al₂O₃ - 0,1÷5,0%
Наиболее близким к предлагаемому способу получения биопрепарата "АВАЛОН" по совокупности существенных признаков является способ по патенту РФ 2116145, в котором осуществляют глубинное культивирование штаммов-деструкторов на жидкой питательной среде, готовят стерильный носитель и осуществляют поверхностное культивирование микроорганизмов на носителе.

Известный способ не позволяет получить биопрепарат с высокой деструктивной активностью и высоким титром жизнеспособны х клеток.

В предлагаемом способе получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, включающем глубинное культивирование биодеструкторов на жидкой питательной среде, подготовку стерильного носителя и поверхностное культивирование биодеструкторов на носителе, предлагается в качестве носителя использовать вспененные стеклообразные метафосфаты переменного состава, обеспечивающие оптимальные условия для иммобилизации и жизнедеятельности клеток микроорганизмов на пористой структуре в процессе их поверхностного культивирования со следующей структурной формулой:
A_m•B_n•[PО₄]_p•Z•X•H₂О
где m, n, p - простые целые числа при произвольном значении p находятся в пределах соотношения: (m+n)/p=0,5÷1,0,
А - одновалентные катионы первой группы,
В - двухвалентные катионы второй группы периодической системы,
Z - легирующие микроэлементы [Zn, Mn, Fe, Сu, Со, Ni, Мo, V, Se, Ag в концентрации 0,01÷0,3% каждого] и
X - добавки [SiO₃, В₂О₃, Аl₂O₃, V₂O₅, SO₃, SeO₃], влияющие на кинетику растворения при следующем соотношении компонентов, % массовые: КРО₃ - 10,0÷35,0%; NaPО₃ - 4÷8%; Мg(РО₃)₂ - 4,0÷18,0%; Са(РО₃)₂ - 20,0÷60,0%;
Z(РО₃)₂ - 1÷3%;
X - SiO₂ - 1,0÷15,0%; В₂О₃ - 1,0÷5,0%; Аl₂О₃ - 0,1÷5,0%; V₂O₅ - 0,1÷0,3%; SО₃ - 0,2÷2,0%; SеО₃ - 0,1÷0,3%,
а в качестве биодеструкторов содержит следующие штаммы микроорганизмов: Serratia marcescens PL-1, Pseudomonas fluorescens biovar II 10-1, Acidovorax delafieldii 3-1.

Для промышленной реализации предлагаемого изобретения используются типовое биотехнологическое оборудование и материалы.

Рассмотрим применение предлагаемых решений на следующих примерах.

Пример 1.

В первом конкретном примере биопрепарат содержит бактериальные штаммы Serratia marcescens PL-1, Pseudomonas fluorescens biovar II 10-1. Чистые культуры микроорганизмов выделены из почв, загрязненных нефтепродуктами, на селективных питательных средах, содержащих в качестве единственного источника углеродного питания углеводороды нефтепродуктов. Штаммы зарегистрированы в коллекции микрооганизмов Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений КМЗР ВИЗР. Штаммы хранятся отдельно на агаризованной питательной среде (МПА или СПА) при температуре 0+5^oС или в лиофилизированном состоянии в ампулах.

Штамм Serratia marcescens PL-1 подвижные с перитрихиальным расположением жгутиков прямые палочки размером 0,8 x 1,0-1,6. На стандартных питательных средах (МПА, СПА, Becton Dickinson) образует круглые колонии 3 мм в диаметре и более, выпуклые, гладкие, края ровные, красного цвета, непрозрачные. Окраска по Граму методом Gregersen (1978) - грамотрицательная. Факультативный анаэроб. Хемоорганотроф. Ферментативный тип метаболизма в тесте O\Ф. Образует кислоту из лизина и орнитина. Не ферментирует арабинозу, ксилозу. Реакция Фогес-Проскауэра положительная. Тест метиловый красный отрицательный. Утилизирует цитрат на среде Симмонса. Гидролизует желатин. Обладает лизин и орнитин декарбоксилазой. Не имеет аргинин дегидролазы. Не образует сероводород, не разрушает мочевину. Редуцирует нитраты до образования NO₂ ^--.

Штамм Pseudomonas fluorescens biovar II 10-1 - подвижные с полярным жгутикованием, слегка изогнутые палочки размером 0,8-0,9 x 1,1-3,0. На стандартных питательных средах (МПА, СПА, Becton Dickinson) образует круглые колонии 2 мм в диаметре и более, выпуклые, гладкие, края ровные, бесцветные, непрозрачные. Окраска по Граму методом Gregersen (1978) - грамотрицательная. Аэроб. Способен расти в анаэробных условиях в присутствии нитратов в питательной среде. Хемоорганотроф. Окислительный тип метаболизма в тесте O\F. Оксидаза и каталаза положительный. Образует флуресцирующий пигмент. Растет при +4^oС, не растет при +41^oС. Образует леван из сахарозы. Обладает аргинин дегидролазой, желатиназой - разжижает желатин, способен к денитрификации. Крахмал не гидролизует. Утилизирует глюкозу, трегалозу, инозит, аргинин.

Для получения посевного материала штаммы выращивали раздельно, в ферментере вели совместное культивирование микроорганизмов.

Для выращивания микроорганизмов использовали питательную среду следующего состава (г/л):
К₂НРО₄ - 1,0
NаNО₃ - 3,0
KCl - 0,5
MgSО₄ - 0,3
FеСl₃•6Н₂О - 0,05
NH₄NО₃ - 2,0
Вода - До 1 л
Кукурузная мука - 5,0
Сахароза - 20,0
Процесс культивирования проводили в ферментере при Т=20^oС, рН 6,5-7,0 в течение 24-36 часов в аэробных условиях. В качестве индуктора использовали 0,02% сырую нефть. После этого проводят иммобилизацию микроорганизмов на пористом носителе путем смешивания его с культуральной жидкостью, содержащей микроорганизмы с титром 2-5,10⁹ кл/мл.

Поверхностное культивирование на пористом носителе проводили при 20^oС в течение 72 часов. Титр биопрепарата 10¹² жизнеспособных клеток в 1 г.

Пример 2
Во втором примере биопрепарат содержит штаммы Acidovorax delafieldii 3-1 и Serratia marcescens PL-1.

Штамм Acidovorax delafieldii 3-1 - подвижные с полярным жгутикованием палочки размером 0,6 x 0,8-2,5, расположенные одиночно и попарно. На стандартных питательных средах (МПА, СПА, Becton Dickinson) образует круглые колонии 2 мм в диаметре и более, выпуклые, гладкие, края ровные, бесцветные, блестящие, непрозрачные.

Окраска по Граму методом Gregersen (1978) - грамотрицательная. Аэроб. Хемоорганотроф. В факторах роста не нуждается. Оксидаза и каталаза положительный. Растет при +4^oС, не растет при +41^oС. Не способен к денитрификацнн. Не образует леван из сахарозы. Желатин не разжижает. Крахмал не гидролизует. Использует в качестве единственного источника углерода глюкозу, глутамат, ксилозу, рибозу, малонат, не использует трегалозу, инозит, рамнозу и сахарозу.

Глубинное культивирование микроорганизмов проводили на той же питательной среде, что и в первом примере.

Поверхностное культивирование на пористом носителе проводили при 20^oС в течение 96 часов. Титр биопрепарата - 9,10¹¹ жизнеспособных клеток в 1 г.

Пример 3
В третьем примере полученные согласно описанию образцы биопрепарата АВАЛОН использовали для очистки грунта, загрязненного мазутом или сырой нефтью. В сосуды, содержащие 1 кг грунта, вносили по 5 г сорбента на основе вспененных метафосфатов, тщательно перемешивали грунт, а затем вносили в сосуды биопрепарат АВАЛОН в количестве 1 г, периодически взрыхляя и поливая почву. В контрольные сосуды сорбент и биопрепарат не вносили. Содержание нефтепродуктов определяли ИК-спектрофотометрически на приборе АН-2 (см. табл. 1),
где состав сорбента AVA-7:
КРО₃ - 31,0%
NаРО₃ - 4,0%
Mg(PО₃)₂ - 8,0%
Са(РО₃)₂ - 48,0%
SiО₂ - 4,4%
В₂О₃ - 3,0%
SО₃ - 0,2%
V₂О₅ - 0,2%
ZO - Zn, Mn, Fe, Cu, Mo, Co, - 0,2% каждого Σ = 1,2% мас. по синтезу
Размер пор сорбента не лимитируется, а плотность выбирается меньше 1 г/см³, чтобы обеспечить его удержание на поверхности воды.

Через 28 суток биологическая активность составила 75-90% в различных вариантах опыта. В контроле содержание нефтепродуктов снизилось незначительно.

Пример 4
В пластмассовые кюветы размером 21 x 34 см, заполненные водой (V=3 л), внесли 2 мл смеси нефти и мазута в соотношении 2 : 1. На поверхность воды последовательно нанесли сорбент на основе вспененных метафосфатов в количестве 3 г, а затем биопрепарат АВАЛОН в количестве 1 г. В контрольные сосуды внесли смесь нефти и мазута без сорбента и биопрепарата.

Через 3-4 дня после нанесения АВАЛОНА на водную поверхность, загрязненную мазутом, вокруг частиц биопрепарата образовалась бактериальная пленка, что свидетельствует о том, что он является для микроорганизмов источником питания. Через 1 месяц на поверхности воды полностью отсутствовала радужная пленка. Через 2 месяца после начала эксперимента водную фазу отделили от осадка фильтрованием через бумажный фильтр, затем определили концентрацию нефтепродуктов в осадке и в воде методом ИК-спектрофотометрии на приборе АН-2. Результаты исследования приведены в таблице 2,
где состав сорбента AVA-8:
КРО₃ - 33,0%
NаРО₃ - 1,0%
Mg(PО₃)₂ - 12,3%
Са(РО₃)₂ - 44,0%
SiО₂ - 5,2%
В₂О₃ - 2,0%
SО₃ - 0,2%
SeО₃ - 0,2%
ZO - Zn, Mn, Fe, Cu, Mo, Co, Ni, каждого Σ = 1,2% мас. по синтезу
Анализ результатов показал, что во всех вариантах опыта активно прошел процесс биодеструкции нефтепродуктов (79,6-94,9%).

В результате проведенных опытов можно констатировать:
- увеличение продолжительности пребывания нефтеокисляющих микроорганизмов в окружающей среде в 3-4 раза, что обеспечивает активный процесс биодеструкции без дополнительного внесения биопрепарата;
- обеспечение минеральным питанием аборигенной микрофлоры, что повышает эффективность очистки объектов окружающей среды от техногенных загрязнений и восстановление нарушенных вследствие этих техногенных загрязнений биоценотических связей.

Биопрепарат относится к средствам борьбы с загрязнениями, в частности с техногенными загрязнениями, объектов окружающей среды. Биопрепарат содержит пористый носитель и штаммы микроорганизмов-деструкторов, иммобилизованные в поры носителя и подобранные к типу загрязнений. В качестве пористого носителя используются вспененные стеклообразные метафосфаты переменного состава, а в качестве биодеструкторов используются штаммы нефтеокисляющих микроорганизмов. Способ очистки включает операцию нанесения сорбента на очищаемую поверхность, а затем проводится очистка с помощью "АВАЛОНА", содержащего вспененный метафосфатный носитель переменного состава, в котором штаммы микроорганизмов подобраны к виду загрязнений. Применение такого способа позволяет существенно упростить процесс транспортировки биопрепарата к месту очистки, а также добиться более эффективной очистки за счет большей биологической активности в отношении углеводородов нефти и нефтепродуктов. 2 с.п. ф-лы, 2 табл.

1. Биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, включающий пористый носитель и биодеструкторы, искусственно иммобилизованные в поры носителя и подобранные к типу загрязнений, отличающийся тем, что в качестве пористого носителя он содержит вспененные стеклообразные метафосфаты переменного состава, обеспечивающие оптимальные условия для иммобилизации и жизнедеятельности клеток микроорганизмов на пористой структуре со следующей структурной формулой:
A_m•B_n•[PO₄] _p•Z•X•H₂O,
где m, n, p - простые целые числа в пределах: m= 2-4; n= 2-6; p= 6-12;
А - одновалентные катионы первой группы;
В - двухвалентные катионы второй группы Периодической системы;
Z - легирующие микроэлементы [Zn, Mn, Fe, Сu, Со, Ni, Мo, V, Se, Ag в концентрации 0,01-0,3% каждого] ;
X - добавки [SiО₃, В₂О₃, Аl₂О₃, V₂O₅, SO₃, SeO₃] , влияющие на кинетику растворения при следующем соотношении компонентов, мас. %:
КРО₃ 10,0-35,0%; NаРО₃ 4-8%; Mg(PО₃)₂ 4,0-18,0%; Са(РО₃)₂ 20,0-60,0%; Z(РО₃)₂ 1-3%;
X - SiО₂ 1,0-15,0%; В₂О₃ 1,0-5,0%; Аl₂О₃ 0,1-5,0%; V₂O₅ 0,1-0,3%; SO₃ 0,2-2,0%; SeO₃ 0,1-0,3%,
а в качестве биодеструкторов содержит следующие штаммы микроорганизмов: Serratia marcescens PL-1, Pseudomonas fluorescens biovar II 10-1, Acidovorax delafieldii 3-1. 2. Способ получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, включающий глубинное культивирование биодеструкторов на жидкой питательной среде, подготовку стерильного носителя и поверхностное культивирование биодеструкторов на носителе, отличающийся тем, что в качестве носителя используют вспененные стеклообразные метафосфаты переменного состава, обеспечивающие оптимальные условия для иммобилизации и жизнедеятельности клеток микроорганизмов на пористой структуре в процессе их поверхностного культивирования со следующей структурной формулой:
A_m•B_n•[PO₄] _p•Z•X•H₂O
где m, n, p - простые целые числа в пределах: m= 2-4; n= 2-6; p= 6-12;
А - одновалентные катионы первой группы;
В - двухвалентные катионы второй группы Периодической системы;
Z - легирующие микроэлементы [Zn, Mn, Fe, Сu, Со, Ni, Мo, V, Se, Ag в концентрации 0,01-0,3% каждого] ;
X - добавки [SiО₃, В₂О₃, Аl₂О₃, V₂O₅, SO₃, SeO₃] , влияющие на кинетику растворения при следующем соотношении компонентов, мас. %:
КРО₃ 10,0-35,0%; NаРО₃ 4-8%; Mg(PО₃)₂ 4,0-18,0%; Са(РО₃)₂ 20,0-60,0%; Z(РО₃)₂1-3%;
X - SiО₂ 1,0-15,0%; В₂О₃ 1,0-5,0%; Аl₂О₃ 0,1-5,0%; V₂O₅ 0,1-0,3%; SО₃ 0,2-2,0%; SeО₃ 0,1-0,3%,
а в качестве биодеструкторов содержит следующие штаммы микроорганизмов: Serratia marcescens PL-1, Pseudomonas fluorescens biovar II 10-1, Acidovorax delafieldii 3-1.