СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПЕРВИЧНОЙ АДЕНТИИ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для прогнозирования развития первичной адентии.

Первичная адентия - одна из наиболее распространенных аномалий отдельных зубов, характеризующаяся значительными морфологическими и функциональными нарушениями.

Вместе с тем своевременное замещение дефектов зубного ряда при истинной адентии значительно повысит качество жизни пациентов. Вышеизложенное определяет необходимость разработки способов прогнозирования первичной адентии.

Согласно литературным данным к причинам развития первичной адентии относятся: наследственность, расстройства функции желез внутренней секреции, нарушения минерального обмена во внутриутробном периоде вследствие заболеваний матери (Аболмасов Н.Г., Аболмасов Н.Н. Ортодонтия. - 2008. - М., Медпресс-информ., С.355-362).

Известен способ диагностики первичной адентии с помощью рентгенологического метода, особенно важны методики панорамной рентгенографии и томографии (Рабухина Н.А., Аржанцев А.П. Рентгендиагностика в стоматологии. - М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 1999. - С.170-172).

В доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружено сведений об известности способа прогнозирования первичной адентии.

Техническим результатом изобретения является получение критериев прогнозирования первичной адентии на основе выявления молекулярно-генетических маркеров.

Предлагаемый способ прогнозирования первичной адентии осуществляется следующим образом. ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.41% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 6 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используют метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press.; - 1984. - V.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивают и переливают в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трисHCl (pH 7,6).

2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, pH 8.0, суспендируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°C.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трисHCl до pH 7.8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной H₂O; раствор хранят при -20°C.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации полиморфных локусов генов GSTM1 и MTHFR.

Состав реакционной смеси для ПЦР следующий: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещают в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6.7 mM MgCl₂, 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 0.01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 2 минуты при 94°C, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°C - 45 секунд, 55°C - 45 секунд, 72°C - 45 секунд. Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров для гена GSTM1 взяты из работы Baranova Н., et al., 1997 (Baranova Н., Perriot J., Albuisson E., Ivaschenko Т., Baranov V., Hemery В., Mouraire P., Riol N., Malet P. Peculiarities of the GSTM1 0/0 genotype in French heavy smokers with various types of chronic bronchitis // Hum. Genet. - 1997. - V.99(6). - P.822-826).

Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров для амплификации полиморфного локуса 677С>Т (Ala222Val) гена MTHFR взяты из работы Goyette P. et al, 1998 (Goyette P., Milos R., Pai A., Frosst P., Tran P., Chen Z., Chan M, Rozen R. Gene structure og human and mouse methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)// Mamm. Genome. 1998. - V.9. - P.652-656).

Для анализа полиморфных вариантов гена MTHFR проводят рестрикцию, для этого после 30-го цикла амплификации ПЦР-продукты подвергают ферментативному гидролизу с помощью фермента HindI при 37°C в течение 10-15 часов.

После завершения амплификации и рестрикции проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют 1X боратный буфер (0,089 М трис HCl pH 7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с pH 8,0).

Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.

Идентификацию генотипов гена GSTM1 проводят следующим образом: наличие ПЦР-продукта размером 271 пн интерпретируют как нормальный вариант (генотип GSTM1*N), отсутствие ПЦР-продукта интерпретируют как наличие делеции в гомозиготном состоянии (генотип GSTMl*del).

Идентифицированные генотипы полиморфного локуса 677C>T (Ala222Val) гена MTHFR типируют по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции, так что HindI-генотипы CC - это гомозиготы по отсутствию вариабельного сайта (выявляется фрагмент размером 300 пн), генотип GC - гетерозиготы по отсутствию и наличию сайта рестрикции (выявляются фрагменты размером 300, 240 и 60 пн) и TT - гомозиготы по наличию сайта рестрикции (выявляются фрагменты размером 240 и 60 пн).

Таким образом, отсутствие ДНК-фрагмента гена GSTM1 размером 271 пар нуклеотидов (пн) интерпретируют как наличие делеции в гомозиготном состоянии, наличие ДНК-фрагментов размером 240 пн и 60 пн гена MTHFR интерпретируют как мутантный аллель Т. При выявлении у пациента делеции гена GSTM1 в сочетании с гомозиготным по мутации генотипом TT гена MTHFR прогнозируют риск развития первичной адентии.

В качестве контроля обследовали группу практически здоровых индивидов, проживающих на территории Республики Башкортостан (110 человек), у которых отсутствовали указания на наличие адентии.

Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфизма гена GSTM1 и полиморфного локуса 677C>T (Ala222Val) гена MTHFR у больных адентией (60 человек) и в контрольной группе представлены в таблице.

Как видно из приведенных данных, при сопоставлении группы больных адентией с контрольной группой по распределению частот комбинаций генотипов по гена GSTM1 и MTHFR достоверных отличий не выявлено (χ2=1,398; p=0,238). Однако анализ ассоциации комбинаций генотипов позволил установить, что сочетание гомозиготных по мутации генотипов GSTMl*del и MTHFR*TT было выявлено только у больных с адентией с частотой 3,33% (2 случая из 60 больных), тогда как в контрольной группе данное сочетание не обнаружено ни в одном случае.

Пример 1. Пациент К.И. 1989 года рождения, город Уфа, Республика Башкортостан. Диагноз первичная адентия зубов 1.2. и 2.2 установлен в октябре 2008 года, подтвержден ортопантомограммой. В настоящее время проходит курс ортодонтического лечения для дальнейшего рационального протезирования. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующем выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена GSTM1 в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250-300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании полиморфного локуса гена GSTM1 у больного К. выявлена делеция в гомозиготном состоянии (генотип GSTMl*del).

При тестировании полиморфизма гена MTHFR на образцах ДНК больного К. проводили амплификацию (условия см. выше) со прецифическими олигонуклеотидными праймерами. После окончания амплификации проводили рестрикционный анализ. Для этого ПЦР-продукты подвергали ферментативному гидролизу с помощью фермента Hindi при 37°C в течение 10-15 часов. Результаты амплификации анализировали путем электрофореза в полиакриламидном геле (условия описаны выше). При исследовании полиморфного локуса гена MTHFR у больного К. выявлена мутация в гомозиготном состоянии (генотип TT). Обнаружение делеции гена GSTM1 в сочетании с мутацией гена MTHFR в гомозиготном состоянии позволило прогнозировать предрасположенность к адентии. (Рентгенподтверждение диагноза с помощью ортопантомограммы. На ортопантомограмме отсутствуют зачатки зубов 1.2. и 2.2.)

Пример 2. Пациент И.С., 1992 года рождения, г.Уфа, Республика Башкортостан. Диагноз ложная адентия зуба 1.3. установлен в сентябре 2008 года, подтвержден ортопантомограммой. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующем выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена GSTM1 в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250-300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлен генотип GSTM1*N, что не позволило нам прогнозировать предрасположенность к адентии. (Рентгенподтверждение диагноза с помощью ортопантомограммы. На ортопантомограмме имеется зачаток ретенированного зуба 1.3.)

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии. Для прогнозирования первичной адентии выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови. Методом полимеразной цепной реакции проводят генотипирование полиморфизмов гена глутатион S-трансферазы Ml (GSTM1) и локуса 677С>Т (Ala222Val) гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR). При выявлении делеции гена GSTM1 в сочетании с гомозиготным по мутации генотипом MTHFR*TT прогнозируют риск развития первичной адентии. Способ позволяет осуществить точный прогноз заболевания на основе выявления молекулярно-генетических маркеров. 1 табл.

Способ прогнозирования первичной адентии, характеризующийся тем, что выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, методом полимеразной цепной реакции проводят генотипирование полиморфизмов гена глутатион S-трансферазы M1 (GSTM1) и локуса 677С>Т (Ala222Val) гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) и при выявлении делеции гена GSTM1 в сочетании с гомозиготным по мутации генотипом MTHFR*TT прогнозируют риск развития первичной адентии.