СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА ПУТЕМ ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕАГИНОВЫХ И ТРЕПОНЕМОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К T.PALLIDUM НА МИКРОСКОПНЫХ АЛЬДЕГИДНЫХ СЛАЙДАХ Российский патент 2010 года по МПК A61B10/00 G01N33/533 

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к области медицины, к диагностике инфекций, передаваемых половым путем, а именно, сифилиса.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Сифилис представляет собой инфекционное заболевание, вызываемое бледной трепонемой (Т.pallidum), передаваемое преимущественно половым путем, характеризующееся поражением кожи, слизистых оболочек, нервной системы, внутренних органов и опорно-двигательного аппарата, нередко приводящее к инвалидизации и даже смерти человека (в случае развития поздних форм сифилитической инфекции - кардиосифилиса, нейросифилиса; при передаче сифилиса от матери плоду и развитии врожденного сифилиса). Сифилитическая инфекция включена в перечень социально значимых заболеваний и заболеваний, представляющих опасность для окружающих [1].

Высокий уровень заболеваемости сифилисом в Российской Федерации [2] обусловливает актуальность разработки новых способов диагностики этой инфекции.

Известно, что в диагностике сифилитической инфекции в настоящее время ведущую роль играют серологические методы исследования, принцип которых состоит в определении в сыворотке крови (плазме, ликворе) пациентов иммунных антител, ассоциированных с сифилитической инфекцией. Диагностика сифилиса является комплексной, что обусловлено вариабельностью иммунного ответа макроорганизма на разных стадиях сифилитической инфекции и выражается изменением содержания антител по отношению к отдельным антигенным структурам (детерминантам) возбудителя сифилиса, которые можно выявлять, используя разные методы исследования.

В зависимости от вида выявляемых антител и используемого антигена серологические реакции для диагностики сифилиса принято подразделять на нетрепонемные (НТТ) и трепонемные (ТТ). Нетрепонемные тесты (реакция микропреципитации - РМП, тест быстрых плазменных реагинов - RPR) определяют реагиновые антитела к кардиолипиновому антигену и используются, в основном, для скрининга на наличие сифилитической инфекции и при оценке эффективности специфического лечения. Трепонемные тесты (реакция пассивной гемагглютинации - РПГА, реакция иммунофлюоресценции - РИФ, реакция иммобилизации бледных трепонем - РИБТ, иммуноферментный анализ - ИФА) выявляют трепонемоспецифические антитела и являются подтверждающими [3].

НТТ являются нестандартизованными методами диагностики сифилиса, большую роль в интерпретации их результатов играет субъективный компонент. Кроме того, при выполнении наиболее часто используемой РМП каждая лаборатория приготавливает кардиолипиновый антиген самостоятельно; при этом качество антигена может зависеть от правильности приготовления, условий и длительности его хранения. Диагностикумы для постановки РМП отличаются как по качеству, так и в количественном отношении, что, несомненно, оказывает влияние на результат реакции [3].

Также НТТ наиболее часто дают «ложноположительные» [4-9] и «ложноотрицательные» [10-13] результаты обследования на сифилис.

Кардиолипиновый антиген, применяемый в нетрепонемных тестах, представляет собой смесь высокоочищенных липидных субстанций животного происхождения; его состав и соотношение входящих в него компонентов достаточно хорошо известны (кардиолипин 0,03%, лецитин 0,27%, холестерин 0,9%) [14].

Постановка трепонемного теста обязательна при получении положительных результатов НТТ [3]. В то же время все ТТ в ряде случаев могут давать «ложноположительные» и «ложноотрицательные» результаты и проявлять неодинаковую чувствительность при разных стадиях инфекции [4, 15-21]. Кроме того, РИФ и РИБТ, являющиеся в настоящее время для диагностики сифилиса реакциями-арбитрами, трудно стандартизуемы, значительное влияние на результаты исследования этими методами оказывает субъективный фактор, для их постановки требуется содержание вивария и перевивка живой культуры патогенных микроорганизмов (T.pallidum), что является трудоемким и эпидемиологически опасным. РПГА является стандартизованной реакцией: все компоненты выпускаются в виде набора реагентов промышленного производства, однако результаты теста читаются визуально, что может вызвать ошибки при интерпретации результатов реакции.

Наиболее оптимальной технологией диагностики сифилиса в настоящее время считается ИФА, осуществляемый набором реагентов промышленного производства с автоматизацией ряда процессов: промывочные процедуры, регистрация и оценка полученных результатов.

Все вышеперечисленные технологии основаны на выявлении в образце биологического материала пациента суммарного пула антитрепонемных антител к антигенам Т.pallidum с различной молекулярной массой, варьирующей в пределах от 15 до 97 кДа, отличающихся своей иммуногенностью, то есть способностью выявлять иммунный ответ на внедрение в организм бледной трепонемы на разных стадиях сифилитической инфекции.

В последние годы появились методики иммуноблоттинга, основанные на принципе ИФА и направленные на обнаружение антител к каждому антигену бледной трепонемы дифференцированно, что существенно повышает чувствительность и специфичность метода [22-24]. При этом возможно оценить вклад каждого антигена в формирование суммарного иммунного ответа, оценить эффективность специфического лечения различных форм сифилиса [25]. Метод иммуноблоттинга практически не дает ложноположительных и перекрестных реакций с другими трепонемами [22, 26-33].

Многие тест-системы, основанные на принципе иммуноферментного анализа, отличаются недостаточно высокой чувствительностью и специфичностью и могут определять антитела к возбудителю сифилиса только на какой-то определенной стадии инфекции. При первичном сифилисе наиболее ранний ответ на внедрение в организм человека Т. pallidum определяется к TpN47 и несколько позже - к TpN15 и TpN17 [34]. Zugehor М. с соавт. (1989) обнаружили выраженную реактогенность полипептида 39 кДа с сыворотками больных первичным и вторичным сифилисом [35]. George R с соавт. (1998) рекомендовал применение метода иммуноблоттинга с использованием антигенов 47, 17 и 15,5 кДа для диагностики первичного и вторичного сифилиса. Они отметили меньшую чувствительность метода у больных при скрытом сифилисе [36]. По данным отечественных и зарубежных авторов, наиболее значимыми в диагностике сифилиса являются антитела к TpN15, TpN17, TpN44,5 (TmpA) и TpN47 [21, 36-40].

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что к настоящему времени наиболее известными иммуногенными рекомбинантными антигенами Т.pallidum, которые могут регистрировать иммунный ответ на разных стадиях сифилитической инфекции, являются антигены с молекулярной массой 15, 17, 39, TmpA (41 кДа, 42 кДа, 44,5 кДа) и 47 кДа.

Метод иммуноблоттинга может быть удобным инструментом для ранней диагностики сифилиса, дифференциальной диагностики различных стадий заболевания, а также служить основой для разработки новых тестов на сифилис путем выбора приоритетов применения тех или иных антигенов Т.pallidum на разных этапах сифилитической инфекции.

Классический алгоритм обследования пациента на сифилис с использованием серологических тестов состоит из постановки нетрепонемного теста и - при его положительном результате - одного или двух трепонемных тестов. Однако НТТ и ТТ производятся в разном формате и выполняются в течение разного времени после получения и подготовки к исследованию сыворотки крови: РМП - в течение 10-15 минут; РПГА - от 40 минут до 2-х часов; ИФА 3-4 часов, РИФ, РИБТ и иммуноблоттинг - не менее 18 часов [41, 42]. Постановка нетрепонемных и трепонемных тестов нередко производится в разные дни и даже в разных лабораториях. Кроме того, ввиду влияния субъективного компонента при определении результатов как НТТ, так и ТТ, нередко дерматовенеролог сталкивается с ситуацией, когда интерпретация результатов серологических реакций затруднена, что требует повторного или дополнительного обследования. В результате период от первичного обращения пациента до установления окончательного диагноза может составлять до 2-х недель и более, что в отношении эпидемиологически опасного, социально значимого заболевания является крайне нежелательным.

Этой ситуации можно было бы избежать при разработке стандартизованного способа диагностики сифилиса, позволяющего осуществлять одновременное определение реагиновых и трепонемных антител в рамках единого формата исследования, в течение одного промежутка времени.

В последние годы появились публикации о применении для диагностики различных заболеваний, в том числе инфекционных, белковых микрочипов или иммуночипов [43-51]. Использование белковых микрочипов значительно сокращает время и финансовые расходы, затрачиваемые на исследования. Метод позволяет проводить исследование биологического материала, полученного от нескольких пациентов одновременно. Иммуночип представляет собой пластинку-носитель (стекло, полиакриламидный гель, нейлоновая мембрана), на которой в определенном порядке расположены ячейки с фиксированными образцами антигенов.

Применительно к сифилитической инфекции в качестве антигенов могут быть использованы рекомбинантные белки бледной трепонемы. Имеются единичные публикации о разработке экспериментальной тест-системы в формате иммуночипа для серологической диагностики сифилиса, не уступающей по чувствительности и специфичности ИФА, РПГА и иммуноблоттингу, а также для решения вопроса о необходимости дополнительного лечения [52, 53]. Для иммобилизации на слайдах были получены 4 рекомбинантных белка T.pallidum (Tp 47, Тр 17, Тр 15, TmpA). Каждому антигену соответствовал индивидуальный спот (пятно). Принцип работы тест-системы построен на непрямом методе выявления специфических антител к возбудителю с помощью флуоресцентной детекции. На одном эррее (аналог лунки плашета, стрипа) возможно одновременно детектировать антитела как IgG, так и IgM, используя смесь антивидовых конъюгатов человека, модифицированных флуорофорами TRITC и FITC соответственно. Для анализа специфичности тест-системы использовали сыворотки от больных Лайм-боррелиозом и лептоспирозом. Разработанная тест-система показала 100% чувствительность и 100% специфичность. Такой иммуночип может повысить эффективность обследования пациентов за счет одновременного проведения скрининга на сифилис и выявления спектра антител к Т.pallidum благодаря раздельной иммобилизации антигенов на слайде [52].

На настоящий момент в Российской Федерации не существует методов диагностики сифилитической инфекции, которые сочетали бы возможности нетрепонемных и трепонемных тестов и позволяли выявлять антитела дифференцированно к наиболее иммуногенным антигенам Т.pallidum, продуцируемым на разных стадиях заболевания, одновременно выявлять реагиновые антитела, проводить объективный автоматизированный учет результатов, сократить время обследования пациента и сроки установления окончательного диагноза.

Раскрытие настоящего изобретения

Сущностью настоящего изобретения является способ, с помощью которого в едином формате исследования за одно и то же время в короткие сроки возможно выявлять сифилис на любой стадии и при любой форме течения инфекции, который позволяет проводить объективный автоматизированный учет результатов исследования, исключающий влияние субъективного фактора.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу диагностики сифилиса путем одновременного определения в сыворотке крови пациента реагиновых и трепонемоспецифических антител к кардиолипиновому антигену и комплексу рекомбинантных антигенов Т.pallidum, иммобилизованных на иммуносорбенте, предусматривающему следующие стадии:

а) получение испытуемых образцов сыворотки крови;

б) инкубация иммуносорбента с добавленными к нему образцами испытуемых сывороток крови, полученных на стадии а), и конъюгата, содержащего меченое флуорофором антитело к IgG человека и меченое другим флуорофором антитело к IgM человека,

в) анализ полученных флуоресцентных сигналов на предмет наличия или отсутствия реагиновых и трепонемоспецифических антител к Т.pallidum в образце, причем наличие реагиновых и трепонемоспецифических антител в образце свидетельствует о наличии сифилиса, а отсутствие реагиновых и трепонемоспецифических антител в образце свидетельствует об отсутствии сифилиса у пациента.

В соответствии с одним из вариантов выполнения настоящего изобретения испытуемые образцы сыворотки крови получают стандартным способом для проведения серологических исследований.

В соответствии с одним из предпочтительных вариантов выполнения настоящего изобретения иммуносорбент представляет собой микроскопные альдегидные слайды в формате иммуночипа с иммобилизоваными на них антигенами Т.pallidum с молекулярной массой 15, 17, 39, 41, 42, 44,5, 47 кДа и кардиолипином, а также тремя внутренними контролями валидности системы. Иммуносорбент инкубируют с добавленными к нему испытуемыми образцами сыворотки крови, положительным и отрицательным контролями, а затем - с добавленным к образцам и контролям рабочим раствором конъюгата, содержащего антитела к IgG человека, меченные флуорофором Су5, и антитела к IgM человека, меченные флуорофором Су3 соответственно. Слайды промывают раствором для отмывания (на этапе подготовки иммуносорбента, после инкубации с иммуносорбентом образцов сывороток крови и конъюгата), высушивают и сканируют на многоканальном сканере биочипов, при этом отмечается флуоресценция образцов, содержащих антитела к Т.pallidum.

Обработку результатов производят автоматически с использованием программы, осуществляющей перевод флуоресцентных сигналов в цифровые показатели коэффициента позитивности. В заключение выдают качественный результат исследования: положительный - в случае наличия реагиновых и трепонемоспецифических антител к Т.pallidum в образце, отрицательный - в случае отсутствия реагиновых и трепонемоспецифических антител к Т.pallidum в образце.

Варианты осуществления настоящего изобретения

Пример №1. У пациента А. с диагнозом «Сифилис вторичный кожи и слизистых оболочек» (диагноз подтвержден результатами клинического и лабораторного исследования - положительными результатами темнопольной микроскопии при исследовании сифилитических высыпаний на коже и положительными результатами серологических реакций сыворотки крови - РМП, РПГА, ИФА) была стандартным способом получена сыворотка крови; подготовлен иммуносорбент, представляющий собой микроскопные альдегидные слайды с иммобилизоваными антигенами Т.pallidum с молекулярной массой 15, 17, 39, 41, 42, 44,5, 47 кДа и кардиолипином, а также тремя внутренними контролями валидности системы; проведено отмывание иммуносорбента рабочим раствором для отмывания путем добавления в каждую лунку иммуносорбента по 100 мкл раствора для отмывания, с последующей инкубацией на термошейкере с вращающейся платформой (500 об/мин) при 37°С в течение 2-3 мин; проведено удаление излишков раствора для отмывания путем аккуратного отсасывания содержимого из лунок с помощью вошера для биочипов или вакуумного медицинского отсасывателя; высушивание иммуносорбента при комнатной температуре; в две лунки иммуносорбента (реакция ставилась в двух повторениях) внесено по 90 мкл раствора для разведения, а также по 10 мкл испытуемой сыворотки крови, не подвергнутой инактивации путем инкубации в условиях повышенной температуры (+56°С); в одну из лунок иммуносорбента внесено 10 мкл положительного контроля (K+), представляющего собой сыворотку крови больного сифилисом, содержащую антитела к возбудителю); в другую лунку иммуносорбента внесено 10 мкл отрицательного контроля (K-), представляющего собой сыворотку крови, не содержащую антител к возбудителю сифилиса; иммуносорбент с закрытой крышкой инкубировался 30 мин на термошейкере с вращающейся платформой (500 об/мин) при 37°С; производилось отмывание иммуносорбента путем добавления 100 мкл рабочего раствора для отмывания и инкубации на термошейкере с вращающейся платформой (500 об /мин) при 37°С в течение 2-3 мин; далее в лунки было внесено по 60 мкл заранее приготовленного рабочего раствора конъюгата, содержащего антитела к IgG человека, меченные флуорофором Су5 и антитела к IgM человека, меченные флуорофором Су3 соответственно; производилось инкубирование иммуносорбента с конъюгатом 30 мин на термошейкере с вращающейся платформой (500 об/мин) при 37°С; проведено удаление излишков раствора для отмывания путем аккуратного отсасывания содержимого из лунок с помощью вошера для биочипов или вакуумного медицинского отсасывателя; проведено отмывание иммуносорбента рабочим раствором для отмывания путем добавления в каждую лунку иммуносорбента по 100 мкл раствора для отмывания, с последующей инкубацией на термошейкере с вращающейся платформой (500 об /мин) при 37°С в течение 2-3 мин; проведено ополаскивание иммуносорбента дистиллированной водой и высушивание слайдов с помощью центрифугирования в течение 1 мин на 1000 об/мин. После этого было проведено сканирование иммуносорбента на многоканальном сканере для биочипов путем активации каналов Су5 и Су3; сканированные флуоресцентные изображения сохранены в формате tif и открыты в специальной программе с программным обеспечением для интерпретации изображения; с использованием программы, был осуществлен перевод флуоресцентных сигналов образцов пациента А. в цифровые показатели коэффициента позитивности; пациенту выдан положительный результат исследования на наличие трепонемоспецифических IgG и IgM к возбудителю сифилиса, а также антител к кардиолипину, что свидетельствовало о наличии антител к T.pallidum в образце.

Таким образом, использование настоящего способа позволило у пациента А. подтвердить сифилис.

Пример №2. У пациента В., при обследовании которого диагноз «Сифилис вторичный кожи и слизистых оболочек» не был подтвержден (отрицательный результат темнопольной микроскопии при исследовании высыпаний на коже и отрицательный результат серологических реакций сыворотки крови - РМП, РПГА, ИФА), была стандартным способом получена сыворотка крови; подготовлен иммуносорбент, представляющий собой микроскопные альдегидные слайды с иммобилизоваными антигенами Т.pallidum с молекулярной массой 15, 17, 39, 41, 42, 44,5, 47 кДа и кардиолипином, а также тремя внутренними контролями валидности системы; проведено отмывание иммуносорбента рабочим раствором для отмывания путем добавления в каждую лунку иммуносорбента по 100 мкл раствора для отмывания, с последующей инкубацией на термошейкере с вращающейся платформой (500 об/мин) при 37°С в течение 2-3 мин; проведено удаление излишков раствора для отмывания путем аккуратного отсасывания содержимого из лунок с помощью вошера для биочипов или вакуумного медицинского отсасывателя; высушивание иммуносорбента при комнатной температуре; в две лунки иммуносорбента (реакция ставилась в двух повторениях) внесено по 90 мкл раствора для разведения, а также по 10 мкл испытуемой сыворотки крови, не подвергнутой инактивации путем инкубации в условиях повышенной температуры (+56°С); в одну из лунок иммуносорбента внесено 10 мкл положительного контроля (K+), представляющего собой сыворотку крови больного сифилисом, содержащую антитела к возбудителю); в другую лунку иммуносорбента внесено 10 мкл отрицательного контроля (K-), представляющего собой сыворотку крови, не содержащую антител к возбудителю сифилиса; иммуносорбент с закрытой крышкой инкубировался 30 мин на термошейкере с вращающейся платформой (500 об/мин) при 37°С; производилось отмывание иммуносорбента путем добавления 100 мкл рабочего раствора для отмывания и инкубации на термошейкере с вращающейся платформой (500 об/мин) при 37°С в течение 2-3 мин; далее в лунки было внесено по 60 мкл заранее приготовленного рабочего раствора конъюгата, содержащего антитела к IgG человека, меченные флуорофором Су5, и антитела к IgM человека, меченные флуорофором Су3 соответственно; производилось инкубирование иммуносорбента с конъюгатом 30 мин на термошейкере с вращающейся платформой (500 об/мин) при 37°С; проведено удаление излишков раствора для отмывания путем аккуратного отсасывания содержимого из лунок с помощью вошера для биочипов или вакуумного медицинского отсасывателя; проведено отмывание иммуносорбента рабочим раствором для отмывания путем добавления в каждую лунку иммуносорбента по 100 мкл раствора для отмывания, с последующей инкубацией на термошейкере с вращающейся платформой (500 об/мин) при 37°С в течение 2-3 мин; проведено ополаскивание иммуносорбента дистиллированной водой и высушивание слайдов с помощью центрифугирования в течение 1 мин на 1000 об/мин. После этого было проведено сканирование иммуносорбента на многоканальном сканере для биочипов путем активации каналов Су5 и Су3; сканированные флуоресцентные изображения сохранены в формате tif и открыты в специальной программе с программным обеспечением для интерпретации изображения; с использованием программы, был осуществлен перевод флуоресцентных сигналов образцов пациента В. в цифровые показатели коэффициента позитивности; пациенту выдан отрицательный результат исследования на наличие трепонемоспецифических IgG и IgM к возбудителю сифилиса, а также антител к кардиолипину, что свидетельствовало об отсутствии антител к T.pallidum в образце.

Таким образом, использование настоящего способа позволило у пациента В. исключить сифилис.

Источники информации

Изобретение относится к области медицины, в частности к инфекционным болезням. Проводят одновременное определение в сыворотке крови реагиновых и трепонемоспецифических антител к кардиолипиновому антигену и комплексу рекомбинантных белков Т.pallidum с молекулярной массой 15, 17, 39, 41, 42, 44,5, 47 кДа, иммобилизованных на микроскопных альдегидных слайдах, предусматривающее выявление антител раствором конъюгата, содержащего антитела к IgG человека, меченные флуорофором Су5, и антитела к IgM человека, меченные флуорофором Су3; сканирование слайдов на многоканальном сканере биочипов; обработку результатов в автоматическом режиме с использованием программы, осуществляющей перевод флуоресцентных сигналов в цифровые показатели коэффициента позитивности; выдачу качественных результатов исследования, причем наличие реагиновых и трепонемоспецифических антител в образце свидетельствует о наличии сифилиса, а отсутствие реагиновых и трепонемоспецифических антител в образце свидетельствует об отсутствии сифилиса у пациента. Способ позволяет выявлять антитела дифференцированно к наиболее иммуногенным антигенам Т.pallidum, продуцируемым на разных стадиях заболевания, проводить объективный автоматизированный учет результатов, сократить время обследования пациента и сроки установления диагноза. 3 з.п. ф-лы.

1. Способ диагностики сифилиса путем одновременного определения в сыворотке крови пациента реагиновых и трепонемоспецифических антител к кардиолипиновому антигену и комплексу рекомбинантных антигенов Т.pallidum, иммобилизованных на иммуносорбенте, предусматривающий следующие стадии:
а) получение испытуемых образцов сыворотки крови;
б) инкубация иммуносорбента с добавленными к нему образцами испытуемых сывороток крови, полученных на стадии а), и конъюгата, содержащего меченое флуорофором антитело к IgG человека и меченое другим флуорофором антитело к IgM человека,
в) анализ полученных флуоресцентных сигналов на предмет наличия или отсутствия реагиновых и трепонемоспецифических антител к Т.pallidum в образце, причем наличие реагиновых и трепонемоспецифических антител в образце свидетельствует о наличии сифилиса, а отсутствие реагиновых и трепонемоспецифических антител в образце свидетельствует об отсутствии сифилиса у пациента.

2. Способ по п.1, в соответствии с которым образцы сыворотки крови получают стандартным способом для проведения серологических исследований.

3. Способ по п.1, в соответствии с которым иммуносорбент представляет собой микроскопные альдегидные слайды в формате иммуночипа с иммобилизоваными на них антигенами Т.pallidum с молекулярной массой 15, 17, 39, 41, 42, 44,5, 47 кДа и кардиолипином, а также тремя внутренними контролями валидности системы.

4. Способ по п.1, в соответствии с которым антитела к IgG человека и антитела к IgM человека помечены флуорофором Су5 и флуорофором Су3 соответственно.