ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА В ФОРМАТЕ ИММУНОЧИПА И СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА Российский патент 2010 года по МПК C07K14/20 G01N33/543 G01N33/571 

Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики, биотехнологии и медицины и касается диагностической тест-системы в формате иммуночипа (биологического чипа) и способа диагностики сифилиса с использованием данного иммуночипа, позволяющего одновременно и дифференциально выявлять реагиновые и трепонемоспецифические антитела (антитела к Treponema pallidum) разных классов.

За последнее десятилетие в Российской Федерации отмечается увеличение удельного веса раннего скрытого сифилиса, представляющего эпидемиологическую опасность, и поздних форм, приводящих к тяжелым поражениям нервной системы и внутренних органов [Сборник основных показателей оказания дерматовенерологической помощи населению (статистические материалы), 1997 год; Ресурсы и деятельность кожно-венерологических учреждений. Заболеваемость за 2003-2004, 2004-2005, 2005-2006 годы (статистические материалы)].

В связи с особенностями клинического течения сифилиса необходима комплексность лабораторных исследований с использованием нетрепонемных и трепонемных тестов. Серологическая диагностика сифилитической инфекции в Российской Федерации регламентирована приказом Минздрава РФ №87 от 26.03.2001 г. «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса», по которому для диагностики сифилиса необходимо проведение анализа как с помощью нетрепонемных тестов, так и дополнительное проведение анализа с помощью трепонемных тестов.

Нетрепонемные тесты, определяющие реагиновые антитела - гетерофильные антитела, образующиеся при поражении тканей вследствие инвазии возбудителя сифилиса Treponema pallidum, или к липидам клеточной стенки Treponema pallidum - служат для постановки предварительного серологического диагноза. Основными тестами данной группы являются РМП - реакция микропреципитации, РСКк - реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном (смесь кардиолипина, холестерина, лецитина) или реакция Вассермана, VDRL - тест Исследовательской лаборатории венерических заболеваний, RPR - быстрый плазмореагиновый тест и другие. Перечисленные нетрепонемные тесты основаны на определении в исследуемом материале антител к кардиолипину. Преимуществами нетрепонемных тестов являются простота их выполнения и низкая стоимость. Полуколичественный анализ с определением титра реагиновых антител позволяет использовать их при дифференциации рецидива от реинфекции и при оценке эффективности лечения. Однако реагиновые антитела не всегда специфичны только в отношении возбудителя сифилиса и могут временно выявляться в сыворотке крови людей с системными заболеваниями паренхиматозных органов, после иммунизации, во время беременности, у пожилых людей и у онкобольных [Е.Соколовский с соавт. Руководство по лабораторной диагностике сифилиса в странах восточной Европы // Вестник дерматологии и венерологии, 2008. - № 5. - С.87-96]. Оценка результатов проведения анализа с использованием нетрепонемных тестов, как правило, проводится визуально.

Трепонемные тесты, определяющие специфические антитела к Treponema pallidum, являются более специфичными. Наиболее распространенными трепонемными тестами являются ИФА - иммуноферментный анализ, РПГА - реакция пассивной гемагглютинации, РИБТ - реакция иммобилизации бледных трепонем, РИФ - реакция иммунофлуоресценции, ИБ - иммунный блоттинг.

Иммуноферментный анализ (ИФА) позволяет определять в одной лунке иммунологического планшета специфические антитела или только к одному антигену, или к смеси антигенов Treponema pallidum. Для дифференциального выявления спектра антител к возбудителю сифилиса необходимо разнести диагностически значимые антигены Treponema pallidum по отдельным лункам. Для достижения раздельной детекции антител по классам (IgG - иммуноглобулины класса G, IgM - иммуноглобулины класса М) используют антивидовые конъюгаты к IgG и IgM человека, вносимые в разные лунки иммунопланшета. Зачастую для этой цели используют две тест-системы, предназначеные для детекции по отдельности антител класса G и антител класса М, что значительно увеличивает время проведения анализа, его стоимость, требует увеличения объемов анализируемого биологического материала.

Иммунный блоттинг (ИБ), несмотря на раздельную иммобилизацию антигенов и, следовательно, раздельное выявление антител к сифилису, также не позволяет на одном иммуносорбенте - стрипе (мембране) - дифференциально определять принадлежность детектируемых трепонемоспецифических антител одновременно нескольких классов. Для анализа одного клинического образца на наличие антител классов G и М возникает необходимость в использовании 2 стрипов для раздельного внесения двух антивидовых конъюгатов. Один стрип используют для детекции с конъюгатом анти-IgG человека, а другой - с конъюгатом анти-IgM человека. К недостаткам этого теста следует отнести субъективность интерпретации результатов при визуальной его оценке, высокую стоимость наборов.

Тест реакции иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) мало пригоден для диагностики ранней стадии инфекции. Реакция иммобилизации бледных трепонем становится позитивной не ранее 3-6 недель от момента заражения. Этот тест сложный, трудоемкий и дорогостоящий, требующий высокой квалификации персонала и наличия вивария для подержания лабораторного штамма бледных трепонем.

Тест реакции иммунофлуоресценции (РИФ) прост в постановке, чувствителен на всех стадиях инфекции. Однако для постановки этого теста также требуется живая бледная трепонема. Кроме того, этот тест может давать ложноположительные результаты, длителен в исполнении, трудоемок, дорог и требует высокой квалификации персонала.

Тест пассивной гемагглютинации (РГПА) имеет низкую чувствительность при первичном сифилисе.

Известно диагностическое устройство для определения сифилиса, выполненное в виде пластикового планшета для иммунноферментного анализа с лунками, на внутренней стороне которых находится вещество, реагирующее с антителами к сифилису [патент России на полезную модель № 7874, МПК А61K 39/12]. В состав вещества входит несколько различных пептидных фрагментов белковых антигенов Treponema pallidum. Однако данное устройство не позволяет выявлять реагиновые антитела, а также определять одновременно антитела различных классов.

Известен протеиновый чип для тестирования инфекций в сыворотке крови, в том числе антител к одному из антигенов сифилиса [заявка КНР № 1373365, МПК G01N 33/68; G01N 33/569; G01N 33/576]. Однако этот чип не позволяет определять реагиновые антитела, а также определять спектр антител к Treponema pallidum и идентифицировать одновременно антитела разных классов.

Известна тест-система в виде биологического чипа, основанная на реакциях взаимодействия антитела с антигеном, и ее применение [Патент России № 2316000, МПК G01N 33/53; G01N 33/543; G01N 33/56]. Однако эта тест-система также не позволяет одновременно выявлять реагиновые антитела и спектр трепонемоспецифических антител. Кроме того, биочип этой тест-системы включает только один антиген сифилиса.

Таким образом, ни один из известных на сегодняшний день диагностических тестов не позволяет одновременно и дифференциально детектировать реагиновые антитела и спектр трепонемоспецифических антител (специфических антител к Treponema pallidum), т.е. сочетать в одном два разных теста: трепонемного и нетрепонемного. Кроме того, ни один из известных диагностических тестов не дает возможности одновременно и дифференциально определять антитела разных классов, значимых при диагностике сифилиса - IgG и IgM человека в сыворотке/плазме крови человека или спинномозговой жидкости.

Наиболее близким к настоящему изобретению является набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema pallidum, содержащий реагенты, необходимые для выявления комплекса антиген-антитело, и адсорбированные на твердой фазе рекомбинантные полипептидные антигены Treponema pallidum 15 кДа, 17 кДа, ТрmА и 47 кДа, причем указанные антигены адсорбированы на твердой фазе в общей смеси, или по отдельности, или в общей смеси и при этом один антиген адсорбирован отдельно и, кроме того, каждый из других попарно абсорбирован вместе с ним [Патент России № 2103362, МПК С12N 15/31, С07К 14/20]. Данное изобретение выбрано в качестве прототипа диагностической тест-системы в формате иммуночипа.

Технической задачей настоящего изобретения является разработка диагностической тест-системы в формате иммуночипа и способа одновременного и дифференциального выявления реагиновых антител и спектра антител к диагностически значимым иммуногенным белкам Treponema pallidum классов G (IgG) и М (IgM) для высокоточной и высокоспецифической диагностики сифилиса уже на ранних стадиях заболевания.

Техническая задача достигается за счет того, что диагностическая тест-система в формате иммуночипа для серологической дифференциальной диагностики сифилиса состоит из иммуносорбента с иммобилизованными на нем раздельно антигенами Treponema pallidum Тр15, Тр17, ТmрА, Тр47, конъюгата и реактивов, необходимых для выявления комплекса антиген-антитело. На иммуносорбенте дополнительно иммобилизован кардиолипин, при этом антигены Treponema pallidum и кардиолипин иммобилизованы, по меньшей мере, в двух повторах, а конъюгат состоит из смеси антивидовых антител к IgG человека и антител к IgM человека, модифицированных двумя различными по спектральным характеристикам флуорофорами.

На иммуносорбенте дополнительно раздельно иммобилизован, по крайней мере, один антиген и/или пептид Treponema pallidum, выбранный, например, из Тр39, Тр41, Тр42, Тр44.5, Тр92, Тр0453, по меньшей мере, в двух повторах.

Кардиолипин представляет собой окисленное производное кардиолипина, соединенное с белком.

На иммуносорбенте дополнительно иммобилизованы вспомогательные контроли, по меньшей мере, в двух повторах.

Вспомогательные контроли представляют собой антитела к иммуноглобулину IgG человека и/или антитела к иммуноглобулину IgM человека и/или иммуноглобулин IgG человека и/или иммуноглобулин IgM человека и/или внутренний отрицательный контроль и/или маркеры границ эрреев.

Иммуносорбент представляет собой слайд в виде стеклянной или пластиковой основы с модифицированной поверхностью или покрытый нитроцеллюлозой.

Иммуносорбент, выполненный в виде слайда, разделен на эрреи, каждый из которых предназначен для анализа одного образца.

Иммуносорбент может представлять собой полистироловый планшет, каждая лунка которого предназначена для анализа одного образца.

В качестве реагентов, необходимых для выявления комплекса антиген-антитело, диагностическая тест-система содержит раствор для разведения контрольных и исследуемых образцов, раствор для разведения конъюгата, раствор для промывки иммуносорбента, положительный контрольный образец (К+), отрицательный контрольный образец (К-).

Способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса с помощью диагностической тест-системы в формате иммуночипа по п.1, включающий внесение на иммуносорбент раствора для разведения контрольных и исследуемых образцов, внесение контрольных и исследуемых образцов, после чего проводят инкубирование при температуре 20-42°С в течение 15-60 мин для образования комплекса антиген-антитело, иммуносорбент промывают, далее на иммуносорбент вносят раствор конъюгата и проводят инкубирование при температуре 20-42°С в течение 15-60 мин, иммуносорбент промывают, высушивают, после чего проводят детекцию образовавшихся комплексов антиген-антитело и выявляют реагиновые и трепонемоспецифические антитела классов G (IgG) и/или М (IgM), исходя из оценки интенсивности сигналов флуоресценции при активации соответствующих каналов многоканального флуоресцентного сканера.

На иммуносорбент дополнительно раздельно иммобилизуют по крайней мере один антиген и/или пептид Treponema pallidum, выбранный из Тр39, Тр41, Тр42, Тр44.5, Тр92, Тр0453 по меньшей мере в двух повторах. Кардиолипин представляет собой окисленное производное кардиолипина, соединенное с белком.

Контрольные образцы представляют собой положительный контрольный образец (К+) и отрицательный контрольный образец (К-).

На иммуносорбенте дополнительно иммобилизуют вспомогательные контроли по меньшей мере в двух повторах.

Вспомогательные контроли представляют собой антитела к иммуноглобулину IgG человека и/или антитела к иммуноглобулину IgM человека и/или иммуноглобулин IgG человека и/или иммуноглобулин IgM человека и/или внутренний отрицательный контроль и/или маркеры границ эрреев.

Иммуносорбент представляет собой слайд в виде стеклянной или пластиковой основы с модифицированной поверхностью или покрытый нитроцеллюлозой.

Иммуносорбент, выполненный в виде слайда, разделен на эрреи, каждый из которых предназначен для анализа одного образца.

Иммуносорбент может представлять собой полистироловый планшет, каждая лунка которого предназначена для анализа одного образца.

Выявление реагиновых антител проводят в местах локализации кардиолипина на иммуносорбенте.

Выявление трепонемоспецифических антител проводят в местах локализации антигенов Treponema pallidum на иммуносорбенте.

Диагностическая тест-система содержит иммуносорбент с иммобизованными на нем раздельно диагностически значимыми антигенами и/или пептидами Treponema pallidum и кардиолипином, конъюгат и реагенты, необходимые для выявления комплекса антиген-антитело. На иммуносорбенте могут быть дополнительно иммобилизованы внутренние контроли.

Реагентами для выявления комплекса антиген-антитело являются:

- раствор для разведения исследуемых и контрольных образцов (например, 1% раствор казеина и 2% бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере),

- раствор для разведения конъюгата (например, 1% раствор казеина в фосфатно-солевом буфере с 0,1% содержанием твина-20),

- раствор для промывки иммуносорбента (например, фосфатно-солевой буфер с содержанием 0,1% твина-20),

- положительный контрольный образец (К+) - инактивированный прогреванием пул сывороток или плазмы крови от больных сифилисом, содержащий реагиновые и трепонемоспецифические антитела классов G и М,

- отрицательный контрольный образец (К-) - инактивированный прогреванием пул сывороток или плазмы крови от практически здоровых доноров, не содержащий реагиновые и трепонемоспецифические антитела классов G и М.

Наиболее экономически оправдано проведение одновременного анализа группы исследуемых образцов с использованием иммуносорбента, на котором размещено от 12 до 16 эрреев (идентичных зон) с иммобилизованными значимыми антигенами Treponema pallidum, кардиолипином и вспомогательными контролями. Каждый эррей служит для постановки одного исследуемого или контрольного образца. При проведении анализа на один эррей вносят положительный контрольный образец тест-системы (К+) для исследования валидности тест-системы. Еще один эррей занимают отрицательным контрольным образцом тест-системы (К-) для последующей интерпретации данных иммуноанализа. На оставшиеся незанятые эрреи вносят исследуемые образцы.

Чаще всего твердой фазой для иммуночипов служат микроскопные слайды шириной 25+1 мм, длиной 75+1 мм и толщиной 1 мм с модифицированной поверхностью (могут содержать эпокси-, альдегидные, аминогруппы, полимеры, гидрогели и т.п.), или покрытые нитроцеллюлозой. Для исключения слияния образцов эррей разделяют специальными устройствами - рамками-герметиками. Существуют коммерчески доступные рамки и держатели слайдов, например, фирмы «Whatman», США, разделяющие эррей при проведении анализа.

Технология печати позволяет нанести биологические вещества также на дно лунки полистиролового планшета для ИФА, что делает возможным использование планшета в качестве иммуносорбента, причем одна лунка планшета соответствует одному эррею и предназначена для анализа одного образца.

С помощью современных установок печати - плоттеров - диагностически значимые антигены Treponema pallidum, кардиолипин, вспомогательные контроли иммобилизуют (сорбируют) на поверхность твердой фазы в виде индивидуальных точек или спотов размером от 100 до 500 микрон. Для исключения ошибок при печати (пропуск печати) или в процессе проведения анализа на иммуночипе каждый антиген, кардиолипин и вспомогательные контроли иммобилизуют раздельно по меньшей мере в двух повторах. При анализе результатов тестирования образцов в расчет принимают среднее по спотам значение сигнала флуоресценции. Качество печати дополнительно контролируется с помощью введения в раствор сорбируемых на твердой фазе антигенов, кардиолипина и вспомогательных контролей любого неспецифического для диагностики сифилиса белка, например, БСА (бычий сывороточный альбумин), который модифицирован флуорофором, отличающимся по спектральным характеристикам от тех, что используются в конъюгате диагностической тест-системы. Например, введение БСА, модифицированного флуорофором FITC, позволяет на соответствующем канале (в частности, FITC при возбуждении длин волн - 488 нм, испускании 512 нм) при сканировании на многоканальном сканере для биочипов регистрировать флуоресцирующие споты, согласно их локализации на эррее. Это очень удобно при наложении «сетки» в процессе обработки результатов анализа с помощью специализированных программ, прилагаемых к сканеру, с целью корректного считывания интенсивности сигналов флуоресценции внутри каждого спота и фона по эррею за пределами спотов.

Вспомогательными контролями являются:

- внутренний отрицательный контроль (сорбционный буфер) служит для контроля качества печати;

- иммуноглобулин IgG человека и/или иммуноглобулин IgM человека служат для контроля внесения раствора конъюгата в эррей;

- антитела к иммуноглобулину IgG человека и/или антитела к иммуноглобулину IgM человека служат для контроля внесения образца в эррей;

- маркеры границ эрреев, которые иммобилизуют по границам каждого эррея, позволяют после проведения анализа визуально наблюдать расположение эрреев и контролировать наложение «сетки» при использовании оператором программы обсчета результатов.

В качестве маркеров границ эрреев чаще всего иммобилизуют любой неспецифический для диагностики сифилиса белок, например БСА, модифицированный одним из флуорофоров.

Изобретение иллюстрируется чертежами.

Фиг.1 - вариант исполнения иммуносорбента диагностической тест-системы для серологической дифференциальной диагностики сифилиса в виде слайда, содержащий 12 эрреев.

Фиг.2 - увеличенный в масштабе эррей.

Фиг.3 - пример исполнения эррея.

Фиг.4 - пример флуоресцентного изображения профилей эрреев на разных каналах для пациента с положительным серологическим диагнозом «сифилис».

Фиг.5 - пример флуоресцентного изображения профилей эрреев на разных каналах для пациента с отрицательным серологическим диагнозом «сифилис».

Иммуносорбент представляет собой слайд 1 (Фиг.1) в виде стеклянной или пластиковой основы с модифицированной поверхностью, который разделен на эррей 2, расположенные на одинаковом расстоянии друг от друга. Границы 3 эрреев 2 для предотвращения слияния образцов обеспечивают наложением специальной рамки (рамка на чертеже не показана). Эрреи 2 (Фиг.2) содержат споты 4 в виде индивидуальных точек.

На иммуносорбент раздельно иммобилизуют диагностически значимые антигены и/или пептиды Treponema pallidum. Наиболее часто при сифилисе выявляются антитела на Тр17. Использование этого белка обеспечивает максимальную чувствительность анализа. Белок Тр15 является чувствительным маркером IgM-ответа на врожденную инфекцию. Обнаружение антител одновременно на Тр17 и Тр15 позволяет хорошо дифференцировать сифилис при подозрениях на болезнь Лайма (клещевой боррелиоз). Отмечено, что в ходе лечения в первую очередь происходит снижение титра антител к ТmрА. Антигены Тр47, Тр15, Тр17, ТmрА - общепризнанный и минимальный набор диагностически значимых белков Treponema pallidum для серодиагностики сифилиса. Определение более широкого спектра трепонемоспецифичных антител позволяет не только выявлять раннюю стадию инфекции, но и подтверждать серологический диагноз. Анализ первичной структуры генома Treponema pallidum позволил выявить дополнительные антигены для диагностики сифилиса. В частности, белок Тр0453 может быть использован в качестве высокоспецифичного маркера Treponema pallidum для определения ранней стадии инфицированности сифилисом. Диагностически значимыми белками являются и другие антигены, например Тр39, Тр92, Тр41, Тр42, Тр44.5. Дополнительное введение в состав иммуносорбента данных белков к набору из четырех наиболее используемых белков Тр47, Тр15, Тр17, ТmрА способствуют повышению чувствительности диагностического теста.

Помимо антигенов и/или пептидов Treponema pallidum, иммуносорбент диагностической тест-системы в формате иммуночипа включает кардиолипин для выявления реагиновых антител.

С целью необратимой сорбции препарата на поверхности твердой фазы и увеличения срока годности иммуносорбента без снижения антигенных свойств кардиолипина, предварительно проводят химическую модификацию препарата для получения окисленного производного кардиолипина, соединенного с любым, не являющимся значимым для диагностики сифилиса белком (например, БСА).

С целью определения антител различных классов на одном иммуносорбенте использован конъюгат, представляющий собой смесь антивидовых антител к IgG человека и к IgM человека, которые модифицированы соответственно различными по спектральным характеристикам флуорофорами. Антитела к IgG человека модифицированы, например, флуорофором Су5, а антитела к IgM человека модифицированы, например, флуорофором Су3. В процессе сканирования при активации соответствующих каналов флуоресцентного сканера становится возможным дифференцирование антител разных классов. Для этого в программе сканера указывается вид используемых в конъюгате флуорофоров, и сканер автоматически активирует соответствующие каналы.

Дифференциальное определение антител по классам является важным в диагностике сифилиса. Первыми после заражения вырабатываются антитела класса М (IgM), выявляемые в определяемых количествах на второй неделе и достигающие максимальной концентрации в крови на 6-9 неделе. Рецидив заболевания или повторное заражение приводят к новому нарастанию концентрации IgM, причем в случае рецидива антитела этого класса часто вырабатываются даже в более высоких концентрациях, чем при первичном инфицировании. После проведения эффективного лечения концентрация IgM быстро падает, и обычно через 3-9 месяцев они перестают определяться в сыворотке крови. Антитела класса G (IgG) в определяемых количествах появляются в крови через 3-4 недели от момента инфицирования. Концентрация их нарастает, на 6-ой неделе начинает преобладать над концентрацией IgM, и, достигая максимума, сохраняется на определенном уровне в течение длительного времени. После проведения эффективного лечения концентрация иммуноглобулинов постепенно снижается, но происходит это гораздо медленнее, чем в случае с IgM.

Раздельное выявление спектра антител к Treponema pallidum важно для подтверждения постановки серологического диагноза сифилиса. Доказано, что выявление антител к двум и более антигенам свидетельствует о положительном серологическом диагнозе «сифилис». В тоже время детекция антител только к одному из значимых антигенов возбудителя сифилиса не позволяет расценить результат серологического анализа как положительный. В данном случае он трактуется как неопределенный, требующий дальнейшего наблюдения за динамикой выработки антител. Динамика наработки антител к различным диагностически значимым белкам позволяет клиницистам прогнозировать течение болезни.

Способ серологической диагностики сифилиса с помощью диагностической тест-системы в виде иммуночипа осуществляется следующим образом.

На иммуносорбент с предварительно иммобилизованными раздельно значимыми антигенами Treponema pallidum Тр15, Тр17, ТmрА, Тр47, а также кардиолипином, вносят раствор для разведения контрольных и исследуемых образцов, после этого вносят контрольные и исследуемые образцы (предпочтительное конечное разведение вносимых образцов к раствору для разведения 1:10). После этого проводят инкубирование полученной смеси при температуре 20-42°С в течение 15-60 мин (предпочтительно с использованием термошейкера с вращением платформы 500 оборотов в мин) для образования комплекса антиген-антитело. Далее иммуносорбент, с целью удаления непрореагировавших компонентов, промывают не менее одного-двух раз раствором для промывки иммуносорбента, например 1-кратным фосфатно-солевым буфером (рН - 7.2) с добавлением 0.1% твина-20.

На иммуносорбент вносят раствор конъюгата из смеси анти-IgG и анти-IgM человека, модифицированны[ различными по спектральным характеристикам флуорофорами, предварительно подготовленный из конъюгата и раствора для разведения конъюгата. Проводят инкубирование при температуре 20-42°С в течение 15-60 мин. Для обеспечения наилучшего результата инкубирование проводят с использованием термошейкера с вращением платформы 500 оборотов в мин. После этого иммуносорбент промывают рабочим раствором для промывки иммуносорбента и высушивают для последующей детекции результатов анализа.

На иммуносорбент дополнительно могут быть раздельно иммобилизованы, по крайней мере, один антиген и/или пептид Treponema pallidum, выбранный, например, из группы Тр39, Тр41, Тр42, Тр44.5, Тр92, Тр0453, и вспомогательные контроли (антитела к иммуноглобулину IgG человека и/или антитела к иммуноглобулину IgM человека и/или иммуноглобулин IgG человека и/или иммуноглобулин IgM человека и/или внутренний отрицательный контроль и/или маркеры границ эрреев). Все антигены и/или пептиды Treponema pallidum, кардиолипин и вспомогательные контроли иммобилизуются, по меньшей мере, в двух повторах. В частном варианте используют окисленное производное кардиолипина, соединенного с любым, не являющимся значимым для диагностики сифилиса белком (например, БСА).

Детекцию образовавшегося комплекса антиген-антитело проводят с помощью многоканального флуоресцентного сканера при активации соответствующих каналов. Обработку результатов сканирования проводят согласно инструкции к используемому программному обеспечению, прилагаемого к сканеру. Выявление реагиновых антител проводят, исходя из оценки интенсивности сигналов флуоресценции в местах локализации кардиолипина на иммуносорбенте. Выявление трепонемоспецифических антител проводят исходя из оценки сигналов интенсивности сигналов флуоресценции в местах локализации антигенов Treponema pallidum на иммуносорбенте.

Для каждого иммобилизованного антигена и кардиолипина рассчитывают коэффициенты флуоресценции, представляющие собой отношение среднего значения флуоресценции соответствующих спотов (за вычетом фона) к фону эррея. Фоном эррея считают среднее значение флуоресценции эррея за пределами спотов. Далее рассчитывают значение критического уровня коэффициента флуоресценции (cut off) для каждого из антигенов Treponema pallidum и кардиолипина. Значение критического уровня коэффициента флуоресценции для каждого антигена и кардиолипина вычисляют путем умножения коэффициента флуоресценции в эррее с внесенным отрицательным контрольным образцом (К-) на значение альфа (устанавливается предприятием-изготовителем биочипа для каждой серии чипов путем статистического анализа). Рассчитывают коэффициенты позитивности для каждого исследуемого образца для всех иммобилизованных антигенов и кардиолипина. Коэффициент позитивности представляет собой отношение коэффициентов флуоресценции к критическому уровню коэффициента флуоресценции (cut off). По значению коэффициентов позитивности делаются выводы о наличии или отсутствии антител к иммобилизованным антигенам и кардиолипину.

Результаты проведения анализа на чипе считают валидными (достоверными), если соблюдаются следующие условия:

- на одном специфическом канале, например Су5 (определение антител класса G) в пределах каждого эррея должны флуоресцировать споты, соответствующие иммобилизованному иммуноглобулину IgG человека. Сигнал флуоресценции данных спотов должен быть не менее чем в три раза выше уровня флуоресценции фона на эррее,

- на втором специфическом канале, например Су3 (определение антител класса М) в пределах каждого эррея должны флуоресцировать споты, соответствующие иммобилизованному иммуноглобулину IgM человека. Сигнал флуоресценции данных спотов должен быть не менее чем в три раза выше уровня флуоресценции фона на эррее,

- уровень флуоресценции спотов, соответствующие локализации внутреннего отрицательного контроля (сорбционный буфер) не должен превышать уровень флуоресценции фона эррея более чем в два раза,

- уровень флуоресценции всех спотов, соответствующие локализации антигенов Treponema pallidum и кардиолипина, на специфических каналах Су5 и Су3 в эррее с внесенным отрицательным контрольным образцом (К-) тест-системы не должен превышать уровень флуоресценции фона на эррее более чем в два раза.

Далее проводят дифференциальную диагностику сифилиса.

Образец считают отрицательным на наличие специфических и реагиновых антител класса G (IgG) к возбудителю сифилиса, если на канале Су5 для всех антигенов и кардиолипина выявлены значения коэффициентов позитивности меньше 1.

Образец считают положительным на наличие специфических антител класса G (IgG) к возбудителю сифилиса, если на канале Су5 к двум и более антигенам Treponema pallidum определены коэффициенты позитивности, равные или более 1.

Образец считают положительным на наличие реагиновых антител класса G (IgG), если на канале Су5 в местах локализации кардиолипина выявлены коэффициенты позитивности, равные или более 1.

Образец считают неопределенным на наличие специфических антител класса G к возбудителю сифилиса, если на канале Су5 коэффициенты позитивности со значениями, равными или более 1, определены только к одному антигену.

Образец считают положительным на наличие специфических антител класса М (IgM) к возбудителю сифилиса, если на канале Су3 к двум антигенам или более выявлены коэффициенты позитивности, равные или более 1.

Образец считают отрицательным на наличие реагиновых антител класса М (IgM), если на канале Су3 в местах локализации кардиолипина выявлены значения коэффициентов позитивности менее 1.

Образец считают неопределенным на наличие специфических антител класса М (IgM) к возбудителю сифилиса, если на канале Су3 к одному антигену выявлены коэффициенты позитивности, большие или равные 1.

Образец считают отрицательным на наличие специфических и реагиновых антител классов М (IgM) к возбудителю сифилиса, если на канале Су3 для всех антигенов и кардиолипина выявлены коэффициенты позитивности менее 1.

Способ серологической диагностики сифилиса с помощью тест-системы в формате иммуночипа характеризуется примерами.

Пример 1.

Дифференциальная серологическая диагностика сифилиса при анализе сыворотки крови пациента П.

Пример выполнения серологической дифференциальной диагностики сифилиса приведен для одного пациента.

Проводят постановку анализа с использованием диагностической тест-системы в формате иммуночипа.

Диагностическая тест-система в формате иммуночипа включает иммуносорбент, конъюгат и реактивы. Иммуносорбент представяляет собой стеклянный слайд производства фирмы «CEL Associates, Inc», США, с модифицированной альдегидными группами поверхностью, на котором раздельно иммобилизованы в виде спотов антигены Treponema pallidum Тр15, Тр17, ТmрА, Тр47, Тр41, Тр42, Тр44.5, кардиолипин, вспомогательные контроли (смесь антител к иммуноглобулинам IgG и IgM человека, смесь иммуноглобулинов IgG и IgM человека, внутренний отрицательный контроль, маркеры границ эрреев). Схема расположения иммобилизованных спотов на эррее приведена на Фиг.3.

Коньюгат представляет собой смесь двух антивидовых антител к иммуноглобулинам IgG и IgM человека.

Реагентами являются:

- раствор для разведения контрольных и исследуемых образцов (1% раствор казеина и 2% бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере),

- раствор для разведения конъюгата (1% раствор казеина в фосфатно-солевом буфере с 0,1% содержанием твина-20),

- раствор для промывки иммуносорбента (фосфатно-солевой буфер с содержанием 0,1% твина-20),

- положительный контрольный образец (К+) - инактивированный прогреванием пул сывороток или плазмы крови от больных сифилисом, содержащий реагиновые и трепонемоспецифические антитела классов G и М,

- отрицательный контрольный образец (К-) - инактивированный прогреванием пул сывороток или плазмы крови от практически здоровых доноров, не содержащий реагиновые и трепонемоспецифические антитела классов G и М.

Вставляют в рамку-держатель для слайдов фирмы Whatman слайд. Сверху на слайд (на стороне маркировки) надевают рамку-трафарет фирмы «Whatman», США, для предотвращения контаминации (слияния) образцов. Промывают иммуносорбент один раз рабочим раствором для отмывки, внося в каждый эррей (лунку) по 100 мкл раствора. Инкубируют на термошейкере с вращением платформы 500 об/мин при 37°С в течение 2-3 мин. После инкубации содержимое из лунок рамок-трафарета аккуратно убрают, не повреждая центральное поле лунки, соответствующее расположению эррея на слайде. Не снимая трафарет, высушивают поверхность иммуносорбента. Далее в эррей иммуносорбента вносят 90 мкл раствора для разведения образцов. В один из эрреев иммуносорбента вносят 10 мкл К+, в другой вносят 10 мкл К-, в незанятый эррей вносят 10 мкл исследуемой сыворотки крови пациента. Иммуносорбент закрывают крышкой и инкубируют 30 мин на термошейкере с вращением платформы 500 об/мин при 37°С. Промывают иммуносорбент рабочим раствором для промывки, внося в каждый эррей по 100 мкл раствора. Инкубируют на термошейкере с вращением платформы 500 об/мин при 37°С в течение 2-3 мин. После этого вносят по 100 мкл рабочего раствора для отмывки в каждый эррей иммуносорбента и инкубируют на термошейкере с вращением платформы 500 об/мин при 37°С в течение 2-3 мин. Затем в каждый эррей иммуносорбента внесят по 60 мкл рабочего раствора конъюгата, закрывают иммуносорбент крышкой и инкубируют 30 мин на термошейкере с вращением платформы 500 об/мин при 37°С. Промывают иммуносорбент один раз рабочим раствором для отмывки, внося в каждый эррей по 100 мкл раствора. Инкубируют на термошейкере с вращением платформы 500 об/мин при 37°С в течение 2-3 мин. Снимают с иммуносорбента рамку-трафарет, иммуносорбент ополаскивают дистиллированной водой. Высушивают слайд. После проведения анализа слайд сканируют на многоканальном сканере для биочипов, активируя каналы Су5 и Су3.

Проводят учет результатов согласно инструкции по применению к диагностической тест-системы в формате иммуночипа. Для каждого антигена и кардиолипина рассчитывают коэффициент флуоресценции. Значение критического уровня коэффициента флуоресценции для каждого антигена и кардиолипина вычисляют путем умножения коэффициента флуоресценции в эррее с внесенным отрицательным контрольным образцом (К-) на значение альфа, равное 2. Рассчитывают коэффициенты озитивности (КП) для всех иммобилизованных антигенов и кардиолипина.

На Фиг.4А показан флуоресцентный профиль эррея, демонстрирующий наличие специфических антител класса G (IgG) к антигенам Тр15, Тр17, ТmрА, Тр41, Тр42, Тр44.5, Тр47 на канале Су5.

На Фиг.4Б продемонстрирован профиль того же эррея на канале Су3, свидетельствующий о наличии реагиновых антител класса М к кардиолипину.

В результате расчета были получены следующие коэффициенты позитивности (КП).

По каналу Су5 (наличие IgG):

- КП (Тр15)=17.7

- КП (Тр17)=22.8

- КП (ТmрА)=20.5

- КП (Тр41)=23.7

- КП (Тр42)=22.0

- КП (Тр44.5)=25.1

- КП (Тр47)=19.9

- КП (для кардиолипина)=0.5

По каналу Су3 (наличие IgM):

- КП (Тр15)=0.4

- КП (Тр17)=0.5

- КП (ТmрА)=0.4

- КП (Тр41)=0.5

- КП (Тр42)=0.4

- КП (Тр44.5)=0.4

- КП (Тр47)=0.6

- КП (для кардиолипина)=17.8

В результате проведения серологического анализа с помощью иммуночипа выявлены трепонемоспецифические антитела класса G (КП для антигенов Тр15, Тр17, ТmрА, Тр41, Тр42, Тр44.5, Тр47 больше 1) и реагиновые антитела класса М (КП к кардиолипину больше 1), что свидетельствует об инфицированности пациента П. сифилисом.

Пример 2.

Анализ сыворотки крови пациента М. с помощью диагностической тест-системы в формате иммуночипа.

Постановку анализа проводили аналогично схеме, описанной в примере 1.

На Фиг.5А приведен пример флуоресцентного профиля эррея на разных каналах, свидетельствующий об отрицательных результатах на наличие трепонемоспецифических и реагиновых антител класса G.

На Фиг.5В приведен пример флуоресцентного профиля эррея на разных каналах, свидетельствующий об отрицательных результатах на наличие антител класса М.

В результате расчета были получены следующие коэффициенты позитивности (КП).

По каналу Су5 (наличие IgG):

- КП (Тр15)=0.3

- КП (Тр17)=0.4

- КП (ТmрА)=0.5

- КП (Тр41)=0.5

- КП (Тр42)=0.6

- КП (Тр44.5)=0.5

- КП (Тр47)=0.7

- КП (для кардиолипина)=0.5

По каналу Су3 (наличие IgM):

- КП (Тр15)=0.3

- КП (Тр17)=0.6

- КП (ТmрА)=0.4

- КП (Тр41)=0.7

- КП (Тр42)=0.4

- КП (Тр44.5)=0.7

- КП (Тр47)=0.6

- КП (для кардиолипина)=0.2

В результате проведения серологического анализа с помощью иммуночипа не выявлены трепонемоспецифические и реагиновые антитела класса G и М (КП для антигенов Тр15, Тр17, ТmрА, Тр41, Тр42, Тр44.5, Тр47, кардиолипина меньше 1).

Предлагаемая диагностическая тест-система в виде иммуночипа позволяет повысить эффективность проведения серологического анализа сифилиса, так как система совмещает два вида тестов (нетрепонемный и трепонемный) в одном формате, определяет широкий спектр антител в сыворотке/плазме крови человека или спинномозговой жидкости и одновременно дифференцирует их по классам G и М на одном иммуносорбенте.

Предлагаемый способ серологической дифференциальной диагностики с помощью диагностической тест-системы в формате иммуночипа высокочувствителен и специфичен, прост в выполнении, исключает субъективность оценки, благодаря автоматизированной интерпретации результатов.

Проведение анализа с использованием диагностической тест-системы в формате иммуночипа экономично, так как она заменяет, как минимум, четыре-пять диагностических тест-систем других форматов. При проведении анализа с использованием предлагаемой диагностической тест-системы в формате иммуночипа требуется минимальный объем исследуемого материала.

Изобретение касается разработки диагностической тест-системы в формате иммуночипа и способа одновременного и дифференциального выявления реагиновых антител и спектра антител к диагностически значимым иммуногенным белкам Treponema pallidum классов G (IgG) и М (IgM). Диагностическая тест-система в формате иммуночипа для серологической дифференциальной диагностики сифилиса состоит из иммуносорбента с иммобилизованными на нем раздельно антигенами Treponema pallidum Тр15, Тр17, Тmра, Тр47, конъюгата и реактивов, необходимых для выявления комплекса антиген-антитело. На иммуносорбенте дополнительно иммобилизован кардиолипин, при этом антигены Treponema pallidum и кардиолипин иммобилизованы, по меньшей мере, в двух повторах, а конъюгат состоит из смеси антивидовых антител к IgG человека и антител к IgM человека, модифицированного двумя различными по спектральным характеристикам флуорофорами. На иммуносорбент может быть дополнительно иммобилизован, по крайней мере, один антиген и/или пептид Treponema pallidum, выбранный, например, из Тр39, Тр41, Тр42, Тр44.5, Тр92, Тр0453, по меньшей мере, в двух повторах. Кардиолипин может представлять собой окисленное производное кардиолипина, соединенное с белком. Способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса с использованием диагностической тест-системы в формате иммуночипа включает нанесение IgM человека, модифицированного двумя различными по спектральным характеристикам флуорофорами. На иммуносорбент может быть дополнительно иммобилизован, по крайней мере, один антиген и/или пептид Treponema pallidum, выбранный, например, из Тр39, Тр41, Тр42, Тр44.5, Тр92, Тр0453, по меньшей мере, в двух повторах. Кардиолипин может представлять собой окисленное производное кардиолипина, соединенное с белком. Способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса с использованием диагностической тест-системы в формате иммуночипа, по которому на иммуносорбент с иммобилизованными на нем раздельно антигенами Treponema pallidum и кардиолипином, вносят раствор для разведения контрольных и исследуемых образцов, вносят контрольные и исследуемые образцы, после чего проводят инкубирование полученной смеси при температуре 20-42°С в течение 15-60 мин для образования комплекса антиген-антитело, иммуносорбент промывают, далее на иммуносорбент вносят раствор конъюгата из смеси антител к IgG человека и антител к IgM человека, модифицированных различными по спектральным характеристикам флуорофорами, и проводят инкубирование при температуре 20-42°С в течение 15-60 мин, иммуносорбент промывают, высушивают, после чего проводят детекцию образовавшегося комплекса антиген-антитело. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 5 ил.

1. Диагностическая тест-система в формате иммуночипа для серологической дифференциальной диагностики сифилиса, состоящая из иммуносорбента с иммобилизованными на нем раздельно антигенами Treponema pallidum Тр15, Тр17, ТmрА, Тр47, конъюгата и реагентов, необходимых для выявления комплекса антиген-антитело, отличающаяся тем, что на иммуносорбент дополнительно иммобилизован кардиолипин, при этом антигены Treponema pallidum и кардиолипин иммобилизованы по меньшей мере в двух повторах, а конъюгат состоит из смеси антивидовых антител к IgG человека и антител к IgM человека, модифицированных двумя различными по спектральным характеристикам флуорофорами.

2. Диагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что на иммуносорбенте дополнительно раздельно иммобилизован по крайней мере один антиген и/или пептид Treponema pallidum, выбранный из Тр39, Тр41, Тр42, Тр44.5, Тр92, Тр 0453 по меньшей мере в двух повторах.

3. Диагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что кардиолипин представляет собой окисленное производное кардиолипина, соединенное с белком.

4. Диагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что на иммуносорбенте дополнительно иммобилизованы вспомогательные контроли по меньшей мере в двух повторах.

5. Диагностическая тест-система по п.4, отличающаяся тем, что вспомогательные контроли представляют собой антитела к иммуноглобулину IgG человека, и/или антитела к иммуноглобулину IgM человека, и/или иммуноглобулин IgG человека, и/или иммуноглобулин IgM человека, и/или внутренний отрицательный контроль, и/или маркеры границ эрреев.

6. Диагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что иммуносорбент представляет собой слайд в виде стеклянной или пластиковой основы с модифицированной поверхностью или покрытый нитроцеллюлозой.

7. Диагностическая тест-система по п.6, отличающаяся тем, что иммуносорбент, выполненный в виде слайда, разделен на эрреи, каждый из которых предназначен для анализа одного образца.

8. Диагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что иммуносорбент представляет собой полистироловый планшет, каждая лунка которого предназначена для анализа одного образца.

9. Диагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что в качестве реагентов, необходимых для выявления комплекса антиген-антитело, диагностическая тест-система содержит раствор для разведения контрольных и исследуемых образцов, раствор для разведения конъюгата, раствор для промывки иммуносорбента, положительный контрольный образец (К+), отрицательный контрольный образец (К-).

10. Способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса с помощью диагностической тест-системы в формате иммуночипа по п.1, включающий внесение на иммуносорбент раствора для разведения контрольных и исследуемых образцов, внесение контрольных и исследуемых образцов, после чего проводят инкубирование при температуре 20-42°С в течение 15-60 мин для образования комплекса антиген-антитело, иммуносорбент промывают, далее на иммуносорбент вносят раствор конъюгата и проводят инкубирование при температуре 20-42°С в течение 15-60 мин, иммуносорбент промывают, высушивают, после чего проводят детекцию образовавшихся комплексов антиген-антитело и выявляют реагиновые и трепонемоспецифические антитела классов G (IgG) и/или M (IgM), исходя из оценки интенсивности сигналов флуоресценции при активации соответствующих каналов многоканального флуоресцентного сканера.

11. Способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса по п.10, отличающийся тем, что на иммуносорбент дополнительно раздельно иммобилизуют по крайней мере один антиген и/или пептид Treponema pallidum, выбранный из Тр39, Тр41, Тр42, Тр44.5, Тр92, Тр 0453 по меньшей мере в двух повторах.

12. Способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса по п.10, отличающийся тем, что кардиолипин представляет собой окисленное производное кардиолипина, соединенное с белком.

13. Способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса по п.10, отличающийся тем, что контрольные образцы представляют собой положительный контрольный образец (К+) и отрицательный контрольный образец (К-).

14. Способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса по п.10, отличающийся тем, что на иммуносорбенте дополнительно иммобилизуют вспомогательные контроли по меньшей мере в двух повторах.

15. Способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса по п.14, отличающийся тем, что вспомогательные контроли представляют собой антитела к иммуноглобулину IgG человека, и/или антитела к иммуноглобулину IgM человека, и/или иммуноглобулин IgG человека, и/или, иммуноглобулин IgM человека, и/или внутренний отрицательный контроль, и/или маркеры границ эрреев.

16. Способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса по п.10, отличающийся тем, что иммуносорбент представляет собой слайд в виде стеклянной или пластиковой основы с модифицированной поверхностью или покрытый нитроцеллюлозой.

17. Способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса по п.16, отличающийся тем, что иммуносорбент, выполненный в виде слайда, разделен на эрреи, каждый из которых предназначен для анализа одного образца.

18. Способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса по п.10, отличающийся тем, что иммуносорбент представляет собой полистироловый планшет, каждая лунка которого предназначена для анализа одного образца.

19. Способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса по п.10, отличающийся тем, что выявление реагиновых антител проводят в местах локализации кардиолипина на иммуносорбенте.

20. Способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса по п.10, отличающийся тем, что выявление трепонемоспецифических антител проводят в местах локализации антигенов Treponema pallidum на иммуносорбенте.