ЛИНИЯ КЛЕТОК МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА PG, СЕКРЕТИРУЮЩИХ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНЫЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР Российский патент 2010 года по МПК C12N5/09 C07K14/00 

Область техники настоящего изобретения

Изобретение относится к области биологии и медицины, в частности к получению генномодифицированных клеточных линий, используемых для иммунотерапии и иммунопрофилактики у пациентов со злокачественными новообразованиями.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Активация иммунной системы может останавливать пролиферацию микрометастатичестких очагов опухолевых клеток, персистирующих в организме больных злокачественными новообразованиями после циторедуктивных вмешательств [1]. Более того, при помощи иммунотерапии можно добиться уменьшения и даже исчезновения относительно крупных метастазов и первичных опухолевых узлов в тех случаях, когда иные способы терапии невозможны. В литературе описан случай регресса опухоли размером в 690 кубических сантиметров в результате адоптивного переноса противоопухолевых Т-лимфоцитов [2]. Также отмечены случаи достижения полной ремиссии онкологических заболеваний после противоопухолевой вакцинации цельноклеточными генно-инженерными вакцинами [3].

Известно два разных пути создания протективного иммунитета - активный и пассивный. Активной иммунизацией, или вакцинацией, называют стимуляцию формирования собственных антигенспецифических антител или Т-клеток при помощи введения целевого антигена в комбинации со средствами, индуцирующими иммунный ответ. Напротив, пассивная иммунизация подразумевает перенос сформированных в другом организме эффекторов иммунного ответа - иммуноглобулинов или лимфоцитов. Как и активная иммунотерапия, адоптивный перенос способен оказывать выраженное противоопухолевое действие [2].

Среди наиболее эффективных форм активации собственного противоопухолевого иммунитета пациента выделяют цельноклеточные противоопухолевые вакцины, секретирующие иммуномодулирующие цитокины. Для получения таких вакцин опухолевые клетки трансфицируют генными конструкциями, кодирующими соответствующие цитокины, инактивируют гамма-облучением и вводят в организм больных. Секреция опухолевыми клетками таких цитокинов, как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерлейкин-2 (IL-2), IL-12 способствует формированию сильного специфичного противоопухолевого иммунного ответа. Последние достижения в области активной специфической иммунотерапии связаны с применением вакцин на основе клеток, секретирующих химерные молекулы, состоящие из активных центров нескольких цитокинов (например, GIFT, соединяющий активность GM-CSF и IL-2) [4].

Вакцинация аутологичными опухолевыми клетками пациентов сопряжена со многими техническими сложностями, такими как доступность опухоли для хирургического удаления, возможность установления краткосрочных культур опухолевых клеток, количество получаемых клеток, эффективность доставки терапевтического гена и уровень его экспрессии. В связи с этим, D. Pardoll предложил использовать для вакцинации аллогенные стабильно трансфицированные клетки с высоким уровнем экспрессии GM-CSF [1]. Идея была подкреплена установленным фактом кросс-презентации опухолевых антигенов дендритными клетками пациента, а также тем, что многие из иммунологически значимых опухолевых антигенов оказались общими как для опухолей одинакового гистологического происхождения, так и для новообразований различного генеза.

Несмотря на то, что подход заостряет вопрос адекватности антигенов вакцины и собственно опухоли, проведенные клинические испытания показали, что эффективность аллогенной вакцинации не уступает результатам, полученным при помощи аутологичных клеток [5]. Более того, эффект аллогенной стимуляции и возможность вводить действительно большие количества клеток пациентам с незначительным объемом опухолевого поражения, позволили получить наиболее значительные результаты за всю историю активной специфической иммунотерапии опухолей [3].

Через некоторое время после введения вакцины, представляющей собой инактивированные генно-модифицированные опухолевые клетки, секретирующие GM-CSF, в области инъекции создается градиент концентрации этого цитокина. GM-CSF вызывает положительный хемотаксис и активацию моноцитов и гранулоцитов крови, а также тканевых макрофагов. Иммуногистохимическое исследование области введения вакцины через 24-48 часов после инъекции выявляет инфильтрацию гранулоцитами и клетками моноцитарного/макрофагального ряда [6]. Под действием GM-CSF повышается продукция IL-1 и фактора некроза опухолей (TNF) макрофагами и развивается местная воспалительная реакция, в процессе которой макрофаги, гранулоциты и дополнительно привлекаемые в область инъекции NK. и NKT-клетки постепенно уничтожают введенные клетки вакцины.

Ключевым фактором, обуславливающим иммуногенность GM-CSF-секретирующих вакцин, является способность этого цитокина индуцировать дифференцировку ранних предшественников в направлении наиболее эффективных профессиональных антигенпрезентирующих клеток - дендритных клеток [7]. Показано, что этот процесс происходит в области инъекции секретирующих GM-CSF опухолевых клеток, если введенные клетки продуцируют достаточное количество цитокина - не менее 36 нг на 10⁶ клеток за 24 часа [3]. Существенно то, что максимальная концентрация GM-CSF создается в непосредственной близости от инъецируемых генно-модифицированных клеток. В результате в зрелые дендритные клетки (DC) дифференцируются их предшественники, локализующиеся около клеток вакцины, и, следовательно, фагоцитирующие продукты распада опухолевых клеток. Исследование последовательных биоптатов места инъекции вакцины показывает, что уже к 3-4 суткам среди инфильтрирующих область клеток наблюдается значительное количество DC, экспрессирующих молекулы костимуляции, а к 5 суткам эти клетки обнаруживают в регионарных лимфатических узлах [9].

Дальнейшие этапы иммунного ответа заключаются в презентации антигенных пептидов из опухолевых антигенов в контексте молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса наивным CD4⁺ Т-хелперам (Th₀), что стимулирует их дифференцировку в зрелые Т-хелперы 1 и 2 типов. В результате кросс-презентации опухолевых антигенов дендритными клетками происходит праймирование наивных CD8⁺ Т-лимфоцитов, что стимулирует их дифференцировку в функционально активные цитотоксические Т-лимфоциты. CD4⁺ Т-хелперы первого типа способствуют формированию клонов CD8⁺ CTL. Кроме этого, было обнаружено, что метастазы вакцинируемых GM-CSF-секретирующими вакцинами пациентов оказываются обильно инфильтрированы лимфоцитами, большая часть (до 96%) которых является CD4⁺ Th₁-клетками, эффекторами реакции гиперчувствительности замедленного (туберкулинового) типа [3, 10, 11].

Другая субпопуляция Т-лимфоцитов - CD8⁺ CTL - осуществляют уничтожение опухолевых клеток и клеток эндотелия опухолевой стромы в случае распознавания кросс-презентируемых ими опухолевых антигенов. Для реализации противоопухолевого эффекта необходима секреция интерферона-гамма [12]. Под действием интерферона-гамма усиливается экспрессия МНС I на клетках опухоли и опухолевой стромы, что повышает эффективность распознавания и мощность активирующего сигнала и, тем самым, позволяет Т-клетке осуществлять индукцию апоптоза в клетке-мишени: выделяемый цитотоксическими клетками (CTL) перфорин формирует поры в клеточной мембране мишени, через которые в опухолевую клетку проникает гранзим В, который запускает каскад программированной клеточной гибели. Весьма вероятно, кроме данного механизма используются и другие способы уничтожения опухолевых клеток как Т-лимфоцитами, так и другими клетками. В частности, способность уничтожать клетки различных опухолей проявляют NIC и NKT-клетки, а также активированные различными факторами (в том числе, и GM-CSF) гранулоциты и макрофаги.

В ряде клинических испытаний было показано, что применение GM-CSF-секретирующих вакцин влияет на уровень этого цитокина в сыворотке крови пациентов, что стимулирует пролиферацию ранних миелоидных предшественников и, в том числе, предшественников дендритных клеток, что может быть существенно для противоопухолевого эффекта иммунизации [5].

Цельноклеточные противоопухолевые вакцины на основе GM-CSF могут представлять собой транзиторно трансфицированные аутологичные клетки пациента, получаемые после хирургического удаления опухоли, либо же аллогенные опухолевые клетки культивируемых in vitro клеточных культур, секретирующих GM-CSF в результате транзиторной или стабильной трансфекции. Между этими двумя подходами существуют значительные различия как в иммунологических эффектах, так и в технологии приготовления вакцины.

Аутологичной вакцинации всегда предшествует хирургическое вмешательство, необходимое для того, чтобы получить опухолевую ткань. Из удаленных опухолевых узлов получают моноклеточную суспензию, которую культивируют in vitro в виде краткосрочной культуры клеток. Далее клетки трансфицируют генной конструкцией, кодирующей GM-CSF, инактивируют путем ионизирующего облучения и в таком виде вводят пациентам; часть клеток консервируют замораживанием для последующих вакцинаций. Продолжительность процесса приготовления вакцины составляет от 20 суток до трех месяцев [8].

Существенным недостатком аутологичной вакцинации является необходимость проделывать все перечисленные манипуляции индивидуально для каждого пациента. Это приводит к тому, что метод крайне сложно стандартизовать и резко повышается стоимость вакцинации. Очевидно также, что аутологичную вакцинотерапию можно проводить только тем пациентам, опухоль которых доступна для хирургической резекции.

Ограничением подхода является и количество получаемых от пациента клеток. Как правило, значительное количество клеток удается получить от пациентов с крупными и многочисленными опухолевыми узлами. Такие пациенты часто находятся в тяжелом состоянии, имеют явно выраженную вторичную иммуносупрессию и как следствие слабо отвечают на иммунотерапию. Напротив, пациенты с невысокой степенью прогрессии и распространения опухолевого процесса, обладающие высоким шансом на результативную вакцинацию, в большинстве случаев имеют опухоли меньшего размера, из которых не удается получить достаточного числа клеток.

Проведенные клинические испытания аутологичных GM-CSF-секретирующих вакцин показали, что эффективность вакцинотерапии зависит не только от количества вводимых клеток, но и от количества секретируемого ими цитокина [5]. Продуктивность клеток вакцины принято оценивать по количеству GM-CSF, секретируемого за сутки одним миллионом клеток, культивируемых in vitro. Соответственно, в условиях транзиторной трансфекции эта продуктивность зависит как от доли трансфицированных клеток, так и от количества цитокина, вырабатываемого каждой такой клеткой. Несмотря на то, что применяемые в настоящее время векторы на основе аденоассоциированных вирусов позволяют добиваться высокой продуктивности, сохраняется известная зависимость результата вакцинотерапии как от эффективности трансфекции, так и от способности клеток индивидуума продуцировать достаточное количество цитокина [5, 9, 13].

Значимым фактором, отрицательно сказывающимся на эффективности аутологичной вакцинотерапии, является период времени, необходимый для приготовления вакцины. Известно, что непосредственно после удаления основной опухоли в организме больного происходят изменения, приводящие к стимуляции роста удаленных метастазов [14]. В этот же период исчезает или ослабляется ряд факторов, обуславливавших подавление противоопухолевого иммунного ответа, и формируются условия для развития эффективного противоопухолевого иммунитета. В случае, когда иммунизацию проводят в первые дни после удаления опухоли, ее эффективность становится существенно выше. Наоборот, вакцинотерапия, начатая через 15 или более суток после хирургической санации, оказывается менее эффективной за счет того, что остающиеся в организме опухолевые клетки получают необходимое время, чтобы адаптироваться, сформировать строму и эффективно противостоять иммунному ответу [5].

В то же время, вакцинотерапия аутологичными опухолевыми клетками обладает существенным преимуществом вследствие максимального иммунологического соответствия антигенного состава вакцины и исходной опухоли. Одной из наиболее важных составляющих эффекторной части иммунного ответа на опухоль является цитотоксическая активность CD8⁺ Т-лимфоцитов, специфичных к определенным опухолевым антигенам. Необходимым условием осуществления цитотоксической активности является экспрессия в клетках опухоли специфического антигена, а также его презентация в контексте молекул МНС I класса. В то же время, для формирования клонов CTL с противоопухолевой активностью требуется введение того же антигена в составе вакцинопрепарата. Установлено, что опухолевые клетки содержат, как правило, не один антиген, а некоторый их набор из нескольких десятков известных антигенов, уникальный для каждой опухоли [15]. В условиях экспериментальных исследований показано, что чем ближе антигенный состав вакцины и опухоли, тем большего эффекта можно добиваться при помощи цельноклеточной вакцинотерапии. Важно также и то, что влияние на формирование и эффективность иммунного ответа оказывает не только наличие или отсутствие определенного антигена в клетках вакцины, но и соотношение количества отдельных антигенов. Несмотря на то, что антигенный состав хирургически удаленной опухоли и ее оставшихся в организме метастазов может различаться, вакцины, созданные на основе аутологичных клеток, максимально приближены по антигенному составу к опухолевым клеткам пациента [16].

В отличие от аутологичных вакцин аллогенные вакцины представляют собой модифицированные клетки, ранее полученные от других пациентов и некоторое время культивируемые in vitro. Как правило, это стабильные, однородные, хорошо пролиферирующие клеточные линии с высоким содержанием иммуногенных опухолеассоциированных антигенов, общих для многих видов опухолей [17]. Выбранные для приготовления вакцины линии трансфицируют генными конструкциями, кодирующими GM-CSF, и далее проводят селекцию и клонирование, в результате которого получают стабильный клон - вариант исходной клеточной линии, все клетки которого секретируют определенное количество цитокина. При помощи дальнейших модификаций (повторной трансфекции, субклонирования, амплификации) возможно получение стабильного варианта клеточной линии с очень высокой продуктивностью. Полученные таким образом клоны создают основу аллогенной вакцины: клетки одного такого клона, нескольких вариантов модификации одной исходной линии или даже комбинация клонов нескольких разных линий выращивают в необходимом количестве, инактивируют гамма-облучением и вводят пациентам.

У аллогенных вакцин отсутствуют практически все технологические недостатки аутологичной вакцинации. Всем пациентам, включенным в программу биотерапии, вводят один и тот же препарат, заранее охарактеризованный по уровню продуктивности, экспрессии опухолеассоциированных антигенов, иммунофенотипу и т.д. Аллогенные вакцины не зависят от результатов хирургического лечения и могут быть применены у пациентов без оперативного вмешательства. Важно также и то, что начать вакцинотерапию возможно уже в первые дни после операции, или даже перед ней. При применении аллогенной вакцинации отсутствует техническое ограничение количества вводимых клеток, что позволяет применять большие количества клеток (до 500 миллионов клеток на одну вакцинацию), продуцирующих значительные количества GM-CSF, и тем самым добиваться максимально возможных результатов. Важным фактором является и то, что аллогенные вакцины существенно дешевле аутологичных и что их получение после разработки исходных клонов представляет собой гораздо менее трудоемкий процесс.

Вместе с тем, введение пациентам чужеродных для них аллогенных клеток требует тщательного подбора той или иной композиции вакцины для каждого конкретного пациента. Неактуальный для аутологичной вакцинации вопрос совместимости антигенного состава вакцины и опухоли становится принципиальным. В модельных системах было показано, что достаточно иммунизировать экспериментальных животных против одного из экспрессирующихся в опухоли антигенов, чтобы вызвать отторжение всей опухоли [18]. Вместе с тем, трансформированные вирусными онкогенами мышиные линии клеток, равно как и В-клеточные лимфомы, представляют собой редчайшие случаи благоприятного совпадения наиболее критичных для иммунотерапии свойств опухолевых антигенов, таких как абсолютная специфичность для опухоли и необходимость антигена для выживания опухолевой клетки [19]. В подавляющем большинстве иных опухолей могут формироваться варианты опухолевых клеток, ускользающие от атаки Т-лимфоцитов и антител [20]. Теряющие антиген или необходимый для его презентации вариант МНС опухолевые субклоны становятся невосприимчивыми к иммунному ответу, продолжают расти и прогрессировать в организме и, в конечном итоге, приводят к его гибели.

Формирование вариантов опухолевых клеток, теряющих экспрессию опухолевого антигена, происходит в результате случайных генетических событий, приводящих к повреждению или выключению соответствующего гена. Поскольку такие события являются случайными, вероятность одновременной утраты двух или более антигенов в одной клетке существенно ниже вероятности потерять один антиген. Соответственно, одновременная иммунизация несколькими антигенами, экспрессирующимися в опухоли может быть более эффективной, нежели иммунизация против одного. Такие предпосылки подтверждаются результатами клинических испытаний [21]. Ввиду этого, весьма вероятно, что при аллогенной вакцинации позитивные результаты можно ожидать только тогда, когда спектр опухолевых антигенов, экспрессирующихся клетками вакцины, широко пересекается со спектром опухолевых антигенов конкретной опухоли пациента. Поскольку антигенный состав вакцины известен заранее, целесообразно перед началом иммунотерапии провести определение антигенного профиля опухоли пациента. Кроме того, необходимо определить, какие из вариантов молекул МНС несет пациент, поскольку презентация ряда опухолеассоциированных антигенов (и, следовательно, возможность осуществления адаптивного иммунного ответа на них) уникальна для ограниченного числа вариантов молекул гистосовместимости.

Возможный сценарий, когда опухоль содержит антигенные белки, продукты которых не могут быть представлены в МНС пациента, до настоящего момента не имеет определенного решения. Часть исследователей полагает, что целесообразно, тем не менее, проводить иммунизацию такими антигенами в расчете на то, что могут существовать не охарактеризованные варианты антигена, способные презентироваться в его МНС, либо же на то, что, даже будучи не презентированным в контексте молекул гистосовместимости, антиген может являться мишенью иммунного ответа [22]. Одновременно, некоторые авторы полагают, что введение этих антигенов в состав вакцины отрицательно скажется на конечном результате вследствие того, что в критически важный момент вакцинации иммунная система окажется излишне «загружена» ответом в отношении неактуальных мишеней. Эта точка зрения подтверждается примерами из инфекционной иммунологии: при большинстве вирусных инфекций потенциально может формироваться иммунный ответ на сотни различных эпитопов вирусных антигенов, однако практически иммунный ответ осуществляется всего на несколько так называемых иммунодоминантных эпитопов [23, 24]. Ответ на иммунодоминантные эпитопы может оказаться неэффективным и даже вредным, поскольку доминирование не позволяет сформировать иммунный ответ на другие антигены, более эффективные для защиты от патогена, зато менее удобные для иммунного распознавания [25].

Определение иммунофенотипа пациентов по локусам лейкоцитарных антигенов гистосовместимости человека-А (HLA-A) и HLA-B необходимо также и для того, чтобы оценить степень совместимости МНС пациента и клеток вакцины. Как и в случае антигенного состава, в настоящий момент нет единого мнения относительно того, какие именно варианты молекул гистосовместимости у клеток вакцины оптимальны для введения тем или иным пациентам. В целом, возможно три варианта аллогенных вакцин: 1) максимально возможное (или полное) соответствие вводимых клеток HLA-фенотипу пациента, 2) отсутствие соответствия (незначительное совпадение) МНС пациента и клеток вакцины или 3) использование в качестве аллогенной вакцины опухолевых клеток, не экспрессирующих на поверхности антигены гистосовместимости.

При использовании в качестве вакцины опухолевых клеток с высокой степенью совместимости аллогенная вакцинация приближается по иммунологическим эффектам к вакцинации собственными клетками опухоли пациента: при первых введениях вакцины увеличивается время пребывания клеток в организме вакцинируемого пациента, поскольку не происходит трансплантационного отторжения, развивающегося в отношении клеток «чужого» HLA-фенотипа [26]. Однако такой эффект сохраняется только в течение нескольких первых введений вакцины, а при продолжении иммунизации вводимые клетки, напротив, быстро уничтожаются, поскольку экспрессируют антигены в контексте «своих» МНС, которые могут быть узнаны сформировавшимися после первых вакцинаций цитотоксическими Т-лимфоцитами. Другим аспектом такой вакцинации является тот факт, что многие варианты молекул гистосовместимости I класса служат лигандами ингибиторных рецепторов цитотоксических лимфоцитов [20]. Присутствие этих лигандов на клетках опухоли, а также вакцины, ингибирует цитотоксическую активность CTL, γδТ-лимфоцитов, NK и NKT-клеток, что может отрицательно сказываться на формировании и осуществлении иммунного ответа [27]. Присутствие на лимфоцитах пациента соответствующих рецепторов служит существенным аргументом в пользу применения у такого пациента аллогенных вакцин, не несущих соответствующие HLA.

Применение вакцин, несущих молекулы HLA отличного от собственного гаплотипа, может приводить к тому, что на введение клеток развиваются реакции трансплантационного отторжения, опосредуемые CD8⁺ Т-лимфоцитами, NK- и NKT-клетками. При развитии аллоиммунитета активируются цитотоксические клетки, способные распознавать отсутствие собственных молекул гистосовместимости (NK-клетки), либо же распознающие структуру чужеродных молекул МНС как грубые искажения собственных (Т-лимфоциты и NKT-клетки). Результатом активации эффекторов противотрансплантационного иммунитета является ускоренное отторжение клеток вакцины при повторном введении, приводящее к тому, что на 3-4 иммунизации аллогенные клетки полностью элиминируются в течение первых нескольких суток [28]. В то же время, аллогенная стимуляция может оказывать позитивное действие на противоопухолевый иммунный ответ за счет стимуляции довольно редкого пула цитотоксических лимфоцитов с потенциально аутоспецифической активностью. Такие лимфоциты несут нетипичный для большинства Т-лимфоцитов Т-клеточный рецептор с отличиями в определяющей комплементарность области (CDR) 2 и 1, который позволяет распознавать как аллогенные МНС, так и видоизмененные молекулы гистосовместимости опухолевых клеток [29].

Еще одной существенной особенностью аллоиммунизации является свойство аллогенных клеток вызывать поликлональную активацию Т-лимфоцитов, в том числе, ингибированных механизмами периферической толерантности. Вероятно, в результате не физиологически высокой частоты встреч Т-лимфоцитов с аллогенными молекулами гистосовместимости происходит не зависящая от костимуляции активация некоторой части Т-клеток без учета специфичности их Т-клеточного рецептора (TCR). Среди отвечающих на аллоантигены лимфоцитов могут оказаться и CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки, специфичные к опухолевым антигенам. Благодаря такой стимуляции опухолеспецифические лимфоциты приобретают активированный фенотип и могут в определенных условиях совершать несколько делений, увеличивая тем самым общее количество исходно редких клонов. Таким образом, аллогенная поликлональная стимуляция может подготавливать противоопухолевые Т-лимфоциты к специфическому ответу на опухолевые антигены, что практически невозможно при использовании сугубо моноклональной, специфической стимуляции.

Одним из интересных аспектов аллогенной вакцинотерапии является возможность применять опухолевые клетки, экспрессирующие молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса. В здоровом организме экспрессия HLA-DR, DQ и DP ограничена популяцией профессиональных антигенпрезентирующих клеток (АРС) (В-лимфоциты, макрофаги и DC) и активированных Т-лимфоцитов, эндотелиальных и эпителиальных клеток, фибробластов и др. В части опухолевых линий, полученных от пациентов с метастатической меланомой, также выявляется экспрессия HLA-DR, биологический смысл которой не вполне ясен. Показано, что сигналы, генерируемые при связывании HLA-DR с TCR, активируют антиапоптотические каскады, что может способствовать выживанию опухолевой клетки. Кроме того, присутствие МНС II класса на опухолевой клетке может иметь значение для формирования толерантности организма к опухолевым антигенам, поскольку презентация их эпитопов (в контексте МНС II класса) происходит не на АРС, а на опухолевых клетках, на которых отсутствуют молекулы, обеспечивающие костимулирующие сигналы. Согласно современным представлениям, примирование такими опухолевыми клетками наивных Т-лимфоцитов в отсутствие сигнала 2 (костимуляции) и необходимой цитокиновой поддержки может приводить к апоптозу Т-лимфоцита и тем самым элиминировать Т-клетки, специфичные к опухолевым антигенам.

Применение в составе аллогенной вакцины опухолевых клеток, экспрессирующих варианты МНС II класса, совпадающие с гаплотипом пациента, и не экспрессирующих молекул семейства В7, может приводить к формированию толерантности по отношению к опухолевым антигенам в ответ на введение вакцины [30]. Кроме того, существенно повышается риск развития аутоиммунных осложнений и других иммунопатий, поскольку создаются условия для стимуляции специфической субпопуляции CD8⁺ клеток, способных распознавать МНС II класса [31].

Еще одним вариантом вакцины на основе аллогенных вакцинных клеток является применение опухолевых линий, утративших поверхностную экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости в результате различных нарушений. Многие из таких линий при введении в организм экспериментальных животных сравнительно быстро уничтожаются NK-клетками, которые способны к осуществлению цитотоксичности в отсутствие сдерживающих сигналов со стороны молекул МНС I на клетке-мишени [32]. По разным подсчетам срок пребывания жизнеспособных клеток вакцины, не экспрессирующих молекул HLA в организме пациента, составляет от 3 до 6 суток, что, в общем, достаточно для осуществления необходимой иммуностимуляции. Кроме того, срок пребывания таких вакцинных клеток в организме пациента практически не изменяется при многократных вакцинациях. Не ясно, существуют ли какие-либо иммунологические особенности действия аллогенных вакцин на основе клеток, не экспрессирующих антигены гистосовместимости. С одной стороны, клетки, не подвергающиеся TCR-MHC-зависимой цитотоксичности, представляют собой более стабильные источники паракринного GM-CSF, что позволяет предполагать большую эффективность вакцины при многократных иммунизациях. Кроме того, отсутствие молекул HLA снимает ингибирующее воздействие опухолевых клеток на цитотоксичность NK-клеток и создает условия для вовлечения этих лимфоцитов в индуктивную фазу иммунного ответа. С другой стороны, сам факт получения подобных клеточных линий из метастазов агрессивных опухолей свидетельствует в пользу того, что у МНС-негативных линий формируются определенные механизмы избегания цитотоксического действия как NK-клеток, так и Т-лимфоцитов. Многие аспекты применения вакцин на основе таких клеток требуют дальнейшего изучения, особенно с учетом того, что факторы, обуславливающие устойчивость МНС-негативных опухолевых клеток к действию NK-клеток, могут оказывать негативное действие на формирование иммунного ответа.

Раскрытие настоящего изобретения

Сущностью настоящего изобретения является создание новой уникальной клеточной линии меланомы человека PG, обладающей способностью секретировать иммуноактивирующий цитокин - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор. Уникальность данной клеточной линии обуславливается использованием в качестве материала для генной модификации уникальной клеточной линии меланомы человека Mel P (патент РФ №2387575). Способность клеток линии PG секретировать рекомбинантный GM-CSF достигается при помощи генной модификации клеток меланомы Mel P генной конструкцией, содержащей комплементарную ДНК GM-CSF человека (SEQ ID NO:1), встроенную в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках млекопитающих.

Технический результат заключается в получении линии клеток меланомы человека PG, стабильно трансфицированных геном GM-CSF и секретирующих данный цитокин во внеклеточное пространство при культивировании in vitro, а также при использовании инактивированных клеток для введения пациентам. Секретируемый клетками PG GM-CSF обуславливает активацию иммунного ответа в отношении опухолевых антигенов, экспрессируемых клетками PG, при введении инактивированных клеток пациентам.

Целью настоящего изобретения является расширение коллекции уникальных клеточных линий, которые можно использовать для иммунотерапии злокачественных новообразований. Эта задача является актуальной для современной практики лечения злокачественных новообразований, поскольку спектр антигенов индивидуальных опухолей является уникальным в то время, как максимальная эффективность иммунотерапии достигается при помощи подбора для пациента вакцины с наиболее полным соответствием набора опухолевых антигенов в клетках вакцины и опухоли.

Технический результат, достигаемый при использовании изобретения, заключается в возможности применения инактивированных клеток линии меланомы человека PG для введения пациентам, страдающим онкологическими заболеваниями, с целью стимуляции противоопухолевого иммунитета, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований, а также проводить иммунопрофилактику злокачественных новообразований.

Дополнительный технический результат, достигаемый при использовании клеток PG заключается в том, что клетки PG, культивируемые in vitro, могут являться источником биологически активного GM-CSF, который может быть использован для культивирования клеток, которым требуется присутствие GM-CSF в культуральной среде. Рекомбинантный GM-CSF человека, продуцируемый клетками PG, может быть использован как в качестве изолированного, высокоочищенного белка, так и в составе культуральной среды или ее дериватов.

Поставленная задача решается тем, что получена новая клеточная линия меланомы человека PG, секретирующая рекомбинантный GM-CSF в количестве не менее 150 нг/10⁶ клеток за 24 часа. Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными, морфологическими и иммунологическими свойствами и обладает способностью секретировать рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор человека в результате генной модификации. Все клетки линии PG характеризуются стабильной секрецией GM-CSF, сохраняющейся после инактивации клеток ионизирующим облучением в дозе 100 Грей, надежно предотвращающей пролиферацию инактивируемых клеток. Линия клеток PG депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под номером РККК (П) 702Д.

Осуществление настоящего изобретения

Процедура получения генно-модифицированных клеток меланомы человека PG, секретирующих GM-CSF

Получение клонов

Для трансфекции использовали очищенную плазмидную ДНК генной конструкции, кодирующей последовательность кДНК GM-CSF человека, встроенную в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках млекопитающих, с геном устойчивости к селективному антибиотику генетицину (G418) (SEQ ID NO:1).

Клетки линии Mel P высевали на чашки диаметром 35 мм и культивировали в течение 24 часов до достижения плотности 16000 клеток/см².

После 24 часов культивирования (после прикрепления и адаптации) к клеткам добавляли растворенный в связывающем буфере трансфекционный комплекс, состоящий из липида и ДНК, связанной с энхансером. Для линии Mel P использовали липид и энхансер из набора Unifectin-M (Maxifectin), количество ДНК, использованной на 1,5×10⁶ клеток, составляло 5,6 мкг. Приготовление и внесение трансфекционного комплекса в чашки с клетками осуществляли в соответствии с инструкцией производителя набора для трансфекции (Unifectin Group, Россия).

Через 24 часа после инкубации с трансфекционной смесью среду в чашках заменяли на новую, а клетки после непродолжительной адаптации пересевали на чашки диаметром 100 мм.

Через 24 часа после инкубации клеток в культуральную среду добавляли селективный антибиотик G418 (Sigma, США) в концентрации LD₁₀₀ (800 мкг/мл).

Через 1 неделю после инкубации с антибиотиком (при необходимости среду заменяли с добавлением новой порции антибиотика) резистентные к препарату клетки формировали клоны по 75-150 клеток в каждом.

Клоны клеток переносили в 96-луночный планшет при помощи микродозатора, для этого после удаления среды и промывания поверхности чашки PBS на клон под микроскопом наносили 10-15 мкл раствора трипсина. Через 30 секунд открепившиеся клетки захватывали микродозатором и переносили в заранее подготовленные лунки 96-луночного планшета с 200 мкл полной среды RPMI-1640.

Через 3-6 суток удачно отобранные клоны формировали монослой, и их переносили в 24-луночный планшет. После формирования монослоя в нем клетки переносили в 6-луночный планшет.

Из 6-луночного планшета отбирали супернатант для анализа концентрации GM-CSF методом иммуноферментного анализа, а клетки пересевали на 4-луночный планшет, в котором клоны замораживали при -135°C.

Определение концентрации GM-CSF методом иммуноферментного анализа (ИФА)

После формирования клетками трансфицированных клонов плотности монослоя на 6-луночном планшете (1,2×10⁶ клеток в лунке) культуральную среду полностью удаляли из лунки, поверхность монослоя промывали однократно 2 мл стерильного PBS и в лунку добавляли по 2 мл полной среды RPMI-1640.

Через 24 часа образцы супернатанта из каждой лунки собирали в криопробирки и замораживали при -20°C до накопления оптимального для постановки анализа числа образцов.

После накопления 40 или более различных образцов при помощи коммерческого набора для ИФА GM-CSF человека производства Diaclone (США) проводили анализ супернатантов методом ИФА в следующей последовательности.

Образцы супернатанта размораживали при комнатной температуре, перемешивали на вортексе в течение 10 секунд и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 30 секунд. В каждую лунку планшета для постановки реакции добавляли по 50 мкл аналитического буфера. В заранее размеченные лунки добавляли по 50 мкл стандарта GM-CSF в лунки для калибровки, по 50 мкл аналитического буфера в контрольные лунки и по 50 мкл образцов в оставшиеся лунки. Заполненный планшет инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре на ротаторе со скоростью 111 об/мин. Через 2 часа из лунок удаляли жидкость, каждую лунку четырехкратно промывали 400 мкл отмывочного буфера. Далее в лунки добавляли по 100 мкл вторичных антител (конъюгата антител против hGM-CSF и биотина) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре на ротаторе при 111 об/мин. Через 1 час из лунок удаляли жидкость, каждую лунку четырехкратно промывали 400 мкл отмывочного буфера.

Далее в лунки добавляли по 100 мкл конъюгированного со стрептавидином фермента (HRP-стрептавидин) и инкубировали 30 минут при комнатной температуре на ротаторе при 111 об/мин.

Через 30 минут из лунок удаляли жидкость, четырехкратно промывали каждую лунку 400 мкл отмывочного буфера.

Далее в лунки добавляли по 100 мкл цветообразующего субстрата (стабилизированного хромогена ТМВ) и инкубировали 30 минут при комнатной температуре в темноте на ротаторе при 111 об/мин.

Через 30 минут в лунки добавляли по 100 мкл стоп-раствора и определяли оптическую плотность на ридере LabSystem (длина волны 450 нм).

На основании полученных результатов, строили калибровочную кривую и определяли концентрацию GM-CSF в образцах.

В результате методом трансфекции и последующей селекции была получена линия PG, продуцирующая не менее 150 нг GM-CSF (секретируется 1 млн клеток за 24 часа).

Основные характеристики клеток линии PG

Родословная клеточной линии:

Линия клеток получена из образца опухолевой ткани пациентки Т.А.А., 50 лет, с диагнозом метастатическая меланома кожи, и/б 98/13557. Материал получен путем удаления двух подкожных метастатических узлов. Стабильная трансфекция выполнена в Институте биологии гена РАН в 2006 году.

Число пассажей:

К моменту составления паспорта клеточная линия прошла 30 пассажей.

Стандартные условия культивирования:

Питательная среда RPMI (90%), эмбриональная телячья сыворотка 10%, содержащая антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно)

Метод снятия: 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор версена в соотношении 1:1.

Культуральные свойства:

Для выращивания культуры можно использовать культуральные флаконы. Во флаконы с площадью роста 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Пассаж 1 раз в 3-4 суток. Культивирование при 37°C и 5% CO₂. Клетки имеют адгезионный, монослойный характер роста.

Кариологическая характеристика штамма:

Количество хромосом в клетке от 55 до 84. Модальное число хромосом 79. Постоянные маркеры - m1, m2, m3, m4, m5, m6.

Цитограмма культуры клеток:

PG характеризуется наличием полиморфных меланомных клеток преимущественно веретенообразной и вытянутой удлиненной формы с четкими границами базофильной цитоплазмы и гипер- и нормохромными ядрами с одиночными нуклеолами. Отмечаются почкование и фрагментация в отдельных крупных ядрах. Имеются гигантские многоядерные клетки с 3-5 ядрами и многочисленные фигуры клеточного деления.

Маркерные признаки:

Поверхностная экспрессия антигенов: CD63+; НМВ45+; MelanA(-); Tyrosinase(-); HMW+; HLA-A,B,C(+); HLA-DR(-). Секретируют GM-CSF человека в количестве не менее 150 нг/10⁶ клеток за 24 часа.

Контаминация:

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Условия криоконсервации:

Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания: питательная среда RPMI 70%, эмбриональная телячья сыворотка 20%, ДМСО 10%. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°C в минуту до -25°C, затем быстрое замораживание до -70°C. Хранение в жидком азоте при температуре -196°C. Размораживание быстрое, при 37°C. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон с площадью роста 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.

Список цитированных источников

1. Pardoll D.M. Spinning Molecular immunology into successful immunotherapy. // Nature Reviews Immunology 2002 Vol.2, P.227-238.

2. Gattinoni L, Powell DJ Jr, Rosenberg SA, Restifo NP. Adoptive immunotherapy for cancer: building on success. // Nat Rev Immunol. 2006 Vol.6, P.383-93.

3. Jaffee EM, Hruban RH, Biedrzycki B, Laheru D, Schepers K, Sauter PR, Goemann M, Coleman J, Grochow L, Donehower RC, Lillemoe KD, O'Reilly S, Abrams RA, Pardoll DM, Cameron JL, Yeo CJ. Novel allogeneic granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-secreting tumour vaccine for pancreatic cancer: a phase I trial of safety and immune activation. // Journal of Clinical Oncology 2001 Vol.19, P.145.

4. Stagg J, Wu JH, Bouganim N, Galipeau J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-2 fusion cDNA for cancer gene immunotherapy. // Cancer Res. 2004 Vol.64, P.8795-9.

5. Borrello I, Pardoll D. GM-CSF-based cellular vaccines: a review of the clinical experience. // Cytokine Growth Factor Rev. 2002 Vol.13, P.185-193.

6. Dranoff G. Cytokines in cancer pathogenesis and cancer therapy. // Nat Rev Cancer. 2004 Vol.4, P.11-22.

7. Markowicz S, Engleman EG. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor promotes differentiation and survival of human peripheral blood dendritic cells in vitro. // Journal of Clinical Investigation 1990 Vol.85, P.955-61.

8. Jaffee EM, Pardoll DM. Considerations for the clinical development of cytokine gene-transduced tumor cell vaccines. // Methods. 1997 Vol.12, P.143-53.

9. Dranoff G. GM-CSF-secreting melanoma vaccines. // Oncogene. 2003 Vol.22, P.3188-92.

10. Simons JW, Jaffee EM, Weber CE, Levitsky HI, Nelson WG, Carducci MA, Lazenby AJ, Cohen LK, Finn CC, Clift SM, Hauda KM, Beck LA, Leiferman KM, Owens AH Jr, Piantadosi S, Dranoff G, Mulligan RC, Pardoll DM, Marshall FF. Bioactivity of autologous irradiated renal cell carcinoma vaccines generated by ex vivo granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene transfer. // Cancer Res. 1997 Vol.57, P.1537-1546.

11. Simons JW, Mikhak B, Chang JF, DeMarzo AM, Carducci MA, Lim M, Weber CE, Baccala AA, Goemann MA, Clift SM, Ando DG, Levitsky HI, Cohen LK, Sanda MG, Mulligan RC, Partin AW, Carter HB, Piantadosi S, Marshall FF, Nelson WG. Induction of immunity to prostate cancer antigens: results of a clinical trial of vaccination with irradiated autologous prostate tumor cells engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor using ex vivo gene transfer. // Cancer Res. 1999 Vol.59, P.5160-8.

12. Ibe S, Qin Z, Schuler T, Preiss S, Blankenstein T. Tumor rejection by disturbing tumor stroma cell interactions // J. Exp. Med. 2001 Vol.194, P.1549-1559.

13. Hege KM, Jooss K, Pardoll D. GM-CSF gene-modified cancer cell immunotherapies: of mice and men. // Int Rev Immunol. 2006 Vol.25, P.321-52.

14. Carlsson J, Nordgren H, Sjostrom J, Wester K, Villman K, Bengtsson NO, Ostenstad B, Lundqvist H, Blomqvist C. HER2 expression in breast cancer primary tumours and corresponding metastases. Original data and literature review. Br J Cancer. 2004 Vol.90, P.2344-8.

15. Wortzel, R.D., Philipps, C., Schreiber, H. Multiple tumour-specific antigens expressed on a single tumour cell. // Nature 1983 Vol.304, P.165-167.

16. Luiten RM, Kueter EW, Mooi W, Gallee MP, Rankin EM, Gerritsen WR, Clift SM, Nooijen WJ, Weder P, van de Kasteele WF, Sein J, van den Berk PC, Nieweg OE, Berns AM, Spits H, de Gast GC. Immunogenicity, including vitiligo, and feasibility of vaccination with autologous GM-CSF-transduced tumor cells in metastatic melanoma patients. // J Clin Oncol. 2005 Vol.23, P.8978-91.

17. Chang JT, Morton SC, Rubenstein LZ, Mojica WA, Maglione M, Suttorp MJ, Roth EA, Shekelle PG. Interventions for the prevention of falls in older adults: systematic review and meta-analysis of randomised clinical trials. // BMJ. 2004 Vol.328, P.680.

18. Chen PW, Wang M, Bronte V, Zhai Y, Rosenberg SA, Restifo NP. Therapeutic antitumor response after immunization with a recombinant adenovirus encoding a model tumor-associated antigen. // J Immunol. Vol.156, P.224-231.

19. Hsu FJ, Benike C, Fagnoni F, Liles TM, Czerwinski D, Taidi B, Engleman EG, Levy R. Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells. // Nat. Med. 1996 Vol.2, P.52-58.

20. Garcia-Lora A, Algarra I, Collado A, Garrido F. Tumour immunology, vaccination and escape strategies. // European Journal of Immunogenetic 2003 Vol.30, P.177-83.

21. Markiewicz MA, Kast WM. Progress in the development of immunotherapy of cancer using ex vivo-generated dendritic cells expressing multiple tumor antigen epitopes. // Cancer Invest. 2004 Vol.22, P.417-34.

22. Slingluff CL Jr, Engelhard VH, Ferrone S. Peptide and dendritic cell vaccines. // Clin Cancer Res. 2006 Vol.12, S.2342-2345.

23. Gallimore A, Hengartner H, Zinkernagel R. Hierarchies of antigen-specific cytotoxic T-cell responses. // Immunol Rev. 1998 Vol.164, P.29-36.

24. Huang AY, Gulden PH, Woods AS, Thomas MC, Tong CD, Wang W, Engelhard VH, Pasternack G, Cotter R, Hunt D, Pardoll DM, Jaffee EM. The immunodominant major histocompatibility complex class I-restricted antigen of a murine colon tumor derives from an endogenous retroviral gene product. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 Vol 93, P.9730-9735.

25. Zinkernagel RM, Hengartner H. On immunity against infections and vaccines: credo 2004. // Scand J Immunol. 2004 Vol.60, P.9-13.

26. Berd, D., Maguire, H.C.J., McCue, P., Mastrangelo, M.J. Treatment of metastatic melanoma with an autologous tumor-cell vaccine: clinical and immunologic results in 64 patients. // Clin. Oncol. 1990 Vol.8, P.1858-1867.

27. Biassoni R, Cantoni C, Marras D, Giron-Michel J, Falco M, Moretta L, Dimasi N. Human natural killer cell receptors: insights into their molecular function and structure. // J Cell Mol Med. 2003 Vol.7, P.376-87.

28. Thomas MC, Greten TF, Pardoll DM, Jaffee EM. Enhanced tumor protection by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor expression at the site of an allogeneic vaccine. // Hum Gene Ther. 1998 Vol.9, P.835-843.

29. Hombach A, Kohler H, Rappl G, Abken H. Human CD4+ Т cells lyse target cells via granzyme/perforin upon circumvention of MHC class II restriction by an antibody-like immunoreceptor. // J Immunol. 2006 Oct Vol.177, P.5668-75.

30. Marsman M, Jordens I, Griekspoor A, Neefjes J. Chaperoning antigen presentation by MHC class II molecules and their role in oncogenesis. // Adv Cancer Res. 2005 Vol.93 P.129-58.

31. Logunova NN, Viret C, Pobezinsky LA, Miller SA, Kazansky DB, Sundberg JP, Chervonsky AV. Restricted MHC-peptide repertoire predisposes to autoimmunity. // J Exp Med. 2005 Vol.202, P.73-84.

32. Wright SC, Bonavida B. YAC-1 variant clones selected for resistance to natural killer cytotoxic factors are also resistant to natural killer cell-mediated cytotoxicity. // Proc Natl Acad Sci USA. 1983 Vol.80, P.1688-92.

33. Peter I, Mezzacasa A, LeDonne P, Dummer R, Hemmi S. Comparative analysis of immunocritical melanoma markers in the mouse melanoma cell lines В16, K1735 and S91-M3. // Melanoma Res. 2001 Vol.11, P.21-30.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, и может быть использовано для иммунотерапии и иммунопрофилактики у пациентов со злокачественными новообразованиями. Линия клеток меланомы человека PG обладает стабильными культуральными, морфологическими и иммунологическими характеристиками и обладает способностью секретировать рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор человека (GM-CSF). Клеточная линия PG депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под номером РККК (П) 702Д. Все клетки линии PG характеризуются стабильной секрецией GM-CSF, сохраняющейся после инактивации клеток ионизирующим облучением в дозе 100 Грей, надежно предотвращающей пролиферацию инактивируемых клеток. Изобретение позволяет использовать инактивированные опухолевые клетки для введения пациентам с целью стимуляции противоопухолевого иммунитета.

Линия клеток меланомы человека PG, секретирующих рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор человека, кодируемый последовательностью ДНК SEQ ID NO:1, депонированная в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под номером РККК (П) 702Д.