Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к средам для культивирования эмбрионов коз in vitro, и может быть использовано в биотехнологии репродукции других млекопитающих, например коров, лошадей, овец и так далее.
Уровень техники
Известен способ культивирования зиготы и/или эмбриона для добавления в среду для культивирования зигот и/или эмбрионов, включающий помещение зиготы или эмбриона в культуральную среду и культивирование, при этом в культуральную среду добавляют эффективное количество, по меньшей мере, одного антисмыслового олигонуклеотида длиной 17-30 нк, каждый из которых комплементарен мРНК, по меньшей мере, одного из следующих генов: генов индукторов аптоза, таких, как HRK, FAS, FASL, ВАХ, Caspasa-3, генов ростовых факторов, таких как IGF1, генов рецепторов ростовых факторов, таких, как IGF1R, генов, регулирующих темпы дробления эмбрионов, таких, как HLA-E, HLA-F, HLA-G, генов клеточного стресса, таких, как HSF-1, HSF-2.
В способе зигота или эмбрион предварительно подвергнуты криоконсервации.
В способе зигота или эмбрион после культивирования подвергнуты криоконсервации.
В способе культуральная среда содержит, по меньшей мере, одну из следующих солей: хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, гидрокарбонат натрия, пируват натрия, лактат натрия.
В способе, по меньшей мере, один из антисмысловых олигонуклеотидов, добавляемых в культуральную среду, модифицирован.
В способе длина антисмыслового олигонуклеотида составляет 18-21 нк.
В способе антисмысловые олигонуклеотиды или антисмысловой олигонуклеотид добавляют в культуральную среду перед помещением зиготы или эмбриона в нее.
В способе антисмысловые олигонуклеотиды или антисмысловой олигонуклеотид добавляют в культуральную среду после помещения зиготы или эмбриона в нее.
В способе различные антисмысловые олигонуклеотиды последовательно добавляют в культуральную среду после помещения зиготы или эмбриона в нее.
В способе культивирование проводят в период после оплодотворения in vitro до истечения шести дней.
Композиция для добавления в среду культивирования зигот и/или эмбрионов, включающая один или более антисмысловой олигонуклеотид длиной 17-30 нк, каждый из которых комплементарен мРНК, по меньшей мере, одного из следующих генов: генов индукторов аптоза, таких как HRK, FAS, FASL, ВАХ, Caspasa-3, генов ростовых факторов, таких как IGF1, генов рецепторов ростовых факторов, таких как IGF1R, генов, регулирующих темпы дробления эмбрионов, таких как HLA-E, HLA-F, HLA-G, генов клеточного стресса, таких как HSF-1, HSF-2.
В композиции, по меньшей мере, один из антисмысловых олигонуклеотидов модифицирован.
В композиции антисмысловой олигонуклеотид выбран из группы, включающей дуплекс-ДНК, синтетические олигонуклеотиды, антисмысловые РНК.
В композиции длина антисмыслового олигонуклеотида составляет 18-21 нк (см. пат. RU №2281778, кл. А61К 35/54, C12N 5/08, А61Р 43/00, опубл. 20.08.06 г.).
Культивирование доимплантационных зародышей млекопитающих вне организма является необходимым звеном при проведении экспериментально-эмбриологических исследований, а также эмбриотехнологических работ по клонированию и получению трансгенных животных. Существенный процент детей рожден благодаря программе ЭКО, которая включает в себя культивирование и оплодотворение яйцеклеток in vitro. Технологии манипуляции с эмбрионами в ветеринарии значительно отстают от медицинских. Максимальный процент приживляемости при трансплантации эмбрионов у коров составляет 50%. Для других животных, для которых разработан этот способ, приживляемость еще ниже. Однако, даже в медицине, при использовании последних технологий процент успешных беременностей при ЭКО составляет всего 15-25% за цикл. Низкая приживляемость обусловлена эмбриональными потерями из-за нарушения развития эмбрионов или неспособности к имплантации. Потребности культивируемых эмбрионов и оптимальные условия для их развития in vitro окончательно не определены.
Признано, что нарушение процесса имплантации, даже если беременность возникла, имеет множество последствий, таких как преэклампсия, внутриматочное ограничение роста, досрочные роды и плацентарный аборт. Очевидно, что имеющиеся методы для культивирования ооцитов и эмбрионов in vitro могут оказывать неблагоприятное воздействие на развитие эмбриона, в том числе и затрагивая его способность к имплантации.
Поэтому актуальными остаются поиск и создание определенных сред для культивирования доимплантационных эмбрионов млекопитающих. Что касается коз, то при всей актуальности темы, среды для культивирования эмбрионов этих животных не разработано.
Известны среды, в которых изучалась возможность использования сложной среды Хэма F-10, содержащей аминокислоты, витамины и другие компоненты. Это связано с ее широким применением для оплодотворения in vitro ооцитов человека и культивирования эмбрионов человека и сельскохозяйственных животных (Loutradis D.K., Kiessling A.A., Kallianidis К., Siskos К., Creatsas G., Michalas S., Aravantinos D. A preliminary trial of human zygote culture in Ham's F-10 without hypoxanthine. J Assist Reprod Genet 1993; 10: 4: 271-275). В частности, показано, что в этой среде эмбрионы мышей и человека способны как развиваться до стадии бластоцисты, так и вылупляться из зоны пеллюцида (Shirley В., Wortham E.J., Witmyer J. et al. Effects of human serum and plasma on development of mouse embryos in culture media. Fertil Steril 1985; 43: 1: 129-134; Kruger T.F, Stander F.S.H, Smith K., Lombard C.J. The development of one- and two-cell mouse embryos in the absense of human serum. S Afr Med J 1986; 70: 9: 542-543; Dandekar P.V., Glass R.H. Development of two-cell mouse embryos in protein-free and protein-supplemented media. J in vitro Fertil Embryo Trans 1990; 7: 2: 107-113; Кривохарченко А.С., Вильянович Л.И., Татаринова Л.В., Рябых В.П. Развитие мышиных эмбрионов in vitro в среде без белка в зависимости от количества зародышей в микрообъеме среды. Онтогенез 1993; 24: 6: 53-60).
Вместе с тем коммерческая среда Хэма F-10 наряду с другими компонентами содержит гипоксантин, который в живых организмах является промежуточным продуктом катаболизма пуриновых оснований. Имеются сообщения о том, что гипоксантин может оказывать отрицательное воздействие на развитие двуклеточных эмбрионов мышей in vitro, блокируя их развитие на первых делениях дробления. Снижается оплодотворяемость яйцеклеток и увеличивается частота цитоплазматической фрагментации эмбрионов (Loutradis D.K., John D., Kiessling A.A. Hypoxanthine causes a 2-cell block in random-bred mouse embryos. Biol Reprod 1987; 37: 311-316; Downs S.M., Dow M.P.D. Hypoxanthine-maintained two-cell block in mouse embryos: dependence on glucose and effect of hypoxanthine phosphoribosyltransferase inhibitors. Biol Reprod 1991; 44: 6: 1025-1039; Dienhart M.K., Downs S.M. Cyclic AMP rerversal of hypoxantine-arrested preimplantation mouse embryos is EDTA-dependent. Zygote 1996; 4: 2: 129-137; Dienhart M.K., O'Brien M.J., Downs S.M. Uptake and salvage of hypoxantine mediates developmental arrest in preimplantation mouse embryos. Biol Reprod 1997; 56: 1: 1-13). При этом исключение гипоксантина из среды Хэма F-10 улучшает результаты культивирования зигот человека в этой среде (Loutradis D.K., Kiessling A.A., Kallianidis К., Siskos К., Creatsas G., Michalas S., Aravantinos D. A preliminary trial of human zygote culture in Ham's F-10 without hypoxanthine. J Assist Reprod Genet 1993; 10:4:271-275).
В более простой по составу, чем среда Хэма F-10, и не содержащей гипоксантин среде альфа-МЕМ эмбрионы мышей лучше развивались in vitro (Roudebush W.E., Often N.L., Butler W.J. Alpha-minimum essential medium (MEM) enhances in vitro hatched blastocyst and cell number per embryo over Ham's F-10. J Assist Reprod Genet 1994; 11:4: 203-207).
Были также достигнуты хорошие результаты при культивировании эмбрионов человека в среде альфа-МЕМ с различными белковыми добавками (Noda Y., Shiotani M., Goto Y., Nakagama Т., Umaoka Y., Mori T. Culture of human embryos in alpha modification of Eagl's medium under low oxygen tension and low illumination. Fertil Steril 1994; 62: 5: 1022-1027; Desai N. Kinzer D., Loeb A., Goldfarb J. Use of synthetic serum substitute and alpha-minimum essential medium for the extended culture of human embryos to the blastocyst stage. Hum Reprod 1997; 12: 2: 328-335).
При культивировании кроличьих зигот в смеси сред DMEM-RPMI 1640 (1:1) без белка они развивались достоверно лучше, чем в безбелковой среде 199, которая содержит намного больше компонентов, чем указанная смесь.
Таким образом, очевидно, что многокомпонентность среды не обеспечивает лучшего развития эмбрионов, смесь должна содержать компоненты, идентичные естественной среде обитания эмбриона.
В состав питательных сред для культивирования доимплантационных эмбрионов млекопитающих входят, как правило, сыворотка теленка (FCS) или сывороточный альбумин. Добавление белка к среде 199 улучшало результаты, и авторы предположили, что белок, возможно, связывает некоторые «лишние» компоненты, устраняя, таким образом, их отрицательный эффект (Carney E.W., Foote R.H. Improved development of rabbit one-cell embryos to the hatching blastocyst stage by culture in a defined, protein-free culture medium. J Reprod Fertil 1991; 91: 1: 113-123).
К числу таких «лишних» для доимплантационных эмбрионов млекопитающих компонентов помимо гипоксантина относится, возможно, и никотинамид, входящий в состав многих сложных коммерческих культуральных сред. На это указывает работа, в которой было показано отрицательное влияние никотинамида на культивируемые in vitro мышиные эмбрионы (Tsai F.C., Gardner D.K. Nicotinamide, a component of complex cultire media, inhibits mouse embryo development in vitro and reduces subsequent developmental potential after transfer. Fertil Steril 1994; 61: 2: 376-382).
Однако до сих пор не все компоненты этих добавок точно идентифицированы, а, для известных не всегда выяснено их действие на эмбрионы.
В последние годы внимание исследователей привлекают инсулиноподобные факторы роста (IGF, insulin-like growth factor) 1- и 2-одноцепочечные полипептиды, содержащие 70 и 67 аминокислотных остатков каждый с молекулярной массой 7000-8000 Да. Инсулиноподобными факторы названы в связи с их способностью стимулировать поглощение глюкозы мышечной и жировой тканью аналогично инсулину. По структуре IGF-1 и 2 гомологичны инсулину, их синтез идет преимущественно (но не только) в печени, стимулируется соматотропным гормоном и приемом пищи и являются гормональными посредниками действия на ткани соматотропного гормона. Система инсулиноподобных факторов роста, их связывающих белков и рецепторов участвует в процессах, связанных с ростом и развитием организма, поддержанием нормального функционирования многих клеток организма. В крови IGF циркулируют в связанном с белками виде. Время нахождения в крови больше, чем соматотропного гормона. Циркулирующий IGF-1 повышает чувствительность к инсулину. Исследователи из Станфордского Университета (США) показали, что ростовой фактор IGF-1 способствует заживлению поврежденной мышцы путем захватывания стволовых клеток из кровотока.
(Alessandra Sacco, Regis Doyonnas, Mark A. LaBarge, Mark M. Hammer, Peggy Kraft, and Helen M. Blau, 2IGF-I increases bone marrow contribution to adult skeletal muscle and enhances the fusion of myelomonocytic precursors. JCB. 2005. Volume 171, 483-492).
У новорожденных в плазме определяются следы IGF, в период детства его уровень градуально растет, достигая максимума в возрасте пубертатного периода. Известны также факты повышения IGF во время беременности. Имеются сообщения, что IGF-2 вырабатывается плацентарными клетками цитотрофобласта и способствует миграции этих клеток в децидуальную оболочку матки (Tietz Clinical guide to laboratory tests. 4-th ed. Ed. Wu A.N.B.-USA, W.B Sounders Company, 2006, 1798 p.; Dufour D. Clinical use of laboratory data: a practical guide. - Williams & Wilkins. - 1998 - 606 p.; LeRoith D. and Roberts Ch.T., The insulin-like growth factor system and cancer Cancer Letters. Vol.195, Issue 2. 2003, Pages 127-137; M.T.МакДермотт. Секреты эндокринологии. M.-СПб., Изд. Бином - Невский Диалект.
Известна среда, в которой для улучшения качества эмбриона и процесса имплантации в среду вводят IGF-2 вместе с протромбином, которые действуют как антагонисты в качестве регуляторов способности цитотрофобласта подвергнуться миграционному или немиграционному поведению. Состав среды (один из вариантов) приведен:
0.0003 to 750 ng/ml IGF-II
0.01 to 50 [mu]g/ml plasminogen
0.01 to 50 [mu]g/ml urokinase plasminogen activator
Synthetic Serum Replacement (SSR<(R)>) (USA=Art Supplement)
Human serum albumin (HSA)
Glucose
Sodium pyruvate
Lactate
Potassium sulphate
Magnesium sulphate
Sodium chloride
Sodium hydrogen phosphate
Non-essential Amino Acids
L-glutamine
Taurine
Sodium bicarbonate
HEPES
Streptomycin 50 mg/litre
Penicillin 50,000 IU/litre
Phenol Red
(См. Compositions and methods for culturing embryos and oocytes, patent number: WO 2007012117, publication date: 2007-02-01, inventor: Roberts Claire Trelford (AU), applicant: Adelaide Res & Innovation pty (AU); Roberts Claire Trelford (AU), classification: international: C12N 5/02; A61K 38/30; C12N 5/08; C12N 5/02; A61K 38/30; C12N 5/08; european: C12N 5/06 B2E; C12N 5/06 B4F, application number: WO 2006AU01042 20060727, priority number(s): AU 20050903997 20050727).
Этот способ дает хорошие результаты по имплантации эмбриона и развитию беременности, но у него существуют недостатки.
1. Прежде всего, в том, что добавляются сильнодействующие синтетические препараты. Известно, что превышение физиологического уровня IGF вызывает пролиферацию раковых клеток, а также преждевременное старение (Anisimov, 1987; Mayerhofer et al., 1990, Rollo et al., 1996, Steger et al., 1993; Wolf et ah, 1993; Ward et al., 1994; Dilman, 1994; Miller et al., 1995; Meliska et al., 1997; Snibson et al., 1999; Brown-Borg, Rakozy, 2000). Исследования же авторов патента ограничены лишь беременностью, таким образом, неизвестны последствия применения такой среды.
2. В этой среде, которая дается как универсальная для всех видов животных и человека, не учитываются видовые особенности, которые, как известно, часто являются фактором, препятствующим применению среды, препарата или метода.
3. Состав среды достаточно сложен и многокомпонентен.
4. Способ культивирования сложен и требует ежедневных сложных манипуляций с эмбрионами.
5. Способ требует использования дорогостоящих препаратов.
Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятая авторами за прототип является безбелковая культуральная среда DMEM (Dulbecco's modified Eagl's medium), состав которой следующий:
L-аргинин-HCl - 84,0 мг/л
L-цистин - 48,0 мг/л
L-глутамин - 584,0 мг/л
L-глицин - 30,0 мг/л
L-гистидин - HCl·H2O - 42,0 мг/л
L-изолейцин - 105,0 мг/л
L-лейцин - 105,0 мг/л
L-лизин-HCl - 146,0
L-метионин - 30,0 мг/л
L-фенилаланин - 66,0 мг/л
L-серин - 42,0 мг/л
L-треонин - 95,0 мг/л
L-триптофон - 16,0 мг/л
L-тирозин - 72,0 мг/л
L-валин - 94,0 мг/л
D-Ca-патентонад - 4,0 мг/л
Холинхлорид - 4,0 мг/л
Фолиевая кислота - 4,0 мг/л
Инозитол - 7,2 мг/л
Никотинамин - 4,0 мг/л
Пиридоксаль - HCl - 4,0 мг/л
Рибофлавин - 0,4 мг/л
Тиамин - HCl - 4,0 мг/л
(См. Р.Адамс. Методы культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир. - 1983. - 262 с.)
Недостатком данной среды является отсутствие естественных компонентов, содержащихся в сыворотке крови и других биологических средах, которые обеспечивают пролиферацию эмбриональных клеток, их способность к прикреплению и распластыванию:
1 - гормональных факторов, стимулирующих рост клеток и их функции;
2 - факторов прикрепления и распластывания клеток;
3 - транспортных белков, переносящих гормоны, минеральные вещества, липиды и ферменты.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к увеличению сроков хранения эмбриона в незамороженном состоянии, улучшению ее качества и повышению уровня приживляемости пересаженных ранних эмбрионов при их трансплантации от коз доноров к реципиентам.
Технический результат достигается с помощью среды для культивирования доимплантационных эмбрионов коз in vitro, включающей среду DMEM, при этом она дополнительно содержит инактивированную сыворотку крови 6-7-месячных козочек, в крови которых содержание IGF1 и IGF2 соответственно составляет 54, 73 и 231,50 нмоль/л, глюкозу, стрептомицин и пенициллин при следующем соотношении компонентов в мас.%:
Сущность получения среды для культивирования доимплантационных эмбрионов коз in vitro заключается в следующем. В качестве базовой используют коммерческую культуральную среду DMEM (Dulbecco's modified Eagl's medium). Состав DMEM следующий:
L-аргинин-HCl - 84,0 мг/л
L-цистин - 48,0 мг/л
L-глутамин - 584,0 мг/л
L-глицин - 30,0 мг/л
L-гистидин - HCl·H2O - 42,0 мг/л
L-изолейцин - 105,0 мг/л
L-лейцин - 105,0 мг/л
L-лизин-HCl - 146,0
L-метионин - 30,0 мг/л
L-фенилаланин - 66,0 мг/л
L-серин - 42,0 мг/л
L-треонин - 95,0 мг/л
L-триптофон - 16,0 мг/л
L-тирозин - 72,0 мг/л
L-валин - 94,0 мг/л
D-Ca-патентонад - 4,0 мг/л
Холинхлорид - 4,0 мг/л
Фолиевая кислота - 4,0 мг/л
Инозитол - 7,2 мг/л
Никотинамин - 4,0 мг/л
Пиридоксаль - HCl - 4,0 мг/л
Рибофлавин - 0,4 мг/л
Тиамин - HCl - 4,0 мг/л
В DMEM вносят 15-20% инактивированной сыворотки крови 6-7-месячных козочек (в крови которых содержание IGF1 и IGF2 соответственно составляет 54, 73 и 231,50 нмоль/л), 0,40-0,45% глюкозы, 0,004-0,005% стрептомицина и 0,003-0,0035% пенициллина. Сыворотку инактивируют обычным способом путем нагревания при 56°С в течение 30 мин.
Добавление инактивированной сыворотки крови 6-7-месячных козочек дает следующее. В этом возрасте (стадии полового созревания) у животных максимально повышается уровень инсулиноподобных факторов роста (IGF1, 2) (см. табл.) в комплексе с белками, которые стимулируют в эмбрионе способность к имплантации. Кроме того, в сыворотке крови содержатся необходимые белковые вещества и ферменты, что позволяет не использовать в составе сыворотку крови плода теленка (FCS) или сывороточный альбумин. Глюкоза в среде также позволяет максимально приблизиться к in vivo, когда ранний преимплантационный эмбрион окружен богатой средой, содержащей глюкозу. Антибиотики являются стабилизаторами и гарантируют безопасность среды. При приготовлении среды для эмбрионов других видов животных рекомендуется брать сыворотку того вида животного, для которого среда предназначена.
Применение среды дает высокий процент развитых эмбрионов с высокой способностью к имплантированию.
Способность сформировавшихся in vitro бластоцист вылупляться из зоны пеллюцида, а также способность вылупившихся бластоцист прикрепляться к субстрату, формировать выраженную внутреннюю клеточную массу и давать разрастание клеток трофэктодермы являются критерием, позволяющим судить о полноценности этих бластоцист, а следовательно, и о качестве культуральных сред (Chida S., Mettler L. Screening test for mouse blastocysts as an index of the vitality of embryos. J in vitro Fertil Embryo Trans 1989; 6: 5: 310-312).
Получение эмбрионов. Эмбрионы, предназначенные для экспериментов, получают следующим образом. Используют коз зааненской породы. Множественную овуляцию у коз индуцируют введением на 14 день полового цикла 24 мг фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) с последующей инъекцией 125 мкг «Эстрофана». Синхронизацию овуляторного процесса в яичниках обеспечивают внутривенным введением 800 ед. хорионического гонадотропина. Охоту выявляют с помощью козлов-пробников. Коз искусственно осеменяют свежеполученной спермой козлов той же породы. Вымывание эмбрионов производят применением лапаротомии на 3 день после осеменения (день осеменения принимают за нулевой день). В качестве промывной жидкости используют фосфатный буферный раствор.
Оценка зародышей производится при просмотре их под микроскопом. Нормальные, пригодные для пересадки эмбрионы характеризуются компактной сферической формой, четкими границами бластомеров с хорошо различимыми клеточными мембранами.
Осуществление изобретения
Примеры конкретного получения среды для культивирования ооцитов и доимплантационнных эмбрионов коз in vitro.
Пример 1. Эмбрионы помещают в пластиковые чашки Петри со средами культивирования. Затем по 5-6 эмбрионов помещают в стеклянные капилляры. Объем культуральной среды в капилляре должен составлять около 20 мкл. Капилляры заполняют таким образом, чтобы на концах оставались пузырьки воздуха. Затем капилляры помещают в стеклянные флаконы под слой парафинового масла. Флаконы заполняют трехкомпонентной газовой смесью (5% СО2, 5% О2 и 90% N2), плотно закрывают, опускают в сосуд с водой и помещают в термостат при 39°С. Через 72 ч культивирования подсчитывают число бластоцист, а через 96 ч число вылупившихся бластоцист. Вылупившимися считают эмбрионы, полностью вышедшие из зоны пеллюцида.
Среду готовят в следующем соотношении компонентов, мас.%:
Результаты: через 72 ч культивирования из 23 эмбрионов 19 эмбрионов (82,6%) достигли стадии бластоцисты, через 96 ч культивирования вылупилось из зоны пеллюцида 16 бластоцист, или 69,6% от общего числа эмбрионов. Все образовавшиеся в результате культивирования и вышедшие из зоны пеллюцида бластоцисты прикрепились к стеклянной поверхности капилляра, дали выраженное разрастание по стеклу клеток трофэктодермы.
Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но среду готовят в соотношении компонентов, мас.%:
Результаты: через 72 ч культивирования из 10 эмбрионов все эмбрионы (100%) достигли стадии бластоцисты. Через 96 ч культивирования вылупилось из зоны пеллюцида 8 бластоцист, или 80% от общего числа эмбрионов. Все образовавшиеся в результате культивирования и вышедшие из зоны пеллюцида бластоцисты прикрепились к стеклянной поверхности капилляра, дали разрастание по стеклу клеток трофэктодермы и сформировали хорошо видимые узелки из клеток внутренней клеточной массы.
Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, но среду готовят в соотношении компонентов, мас.%:
Через 72 ч культивирования из 11 эмбрионов все эмбрионы (100%) достигли стадии бластоцисты. Через 96 ч культивирования вылупилось из зоны пеллюцида 9 бластоцист, или 81,8% от общего числа эмбрионов. Все образовавшиеся в результате культивирования и вышедшие из зоны пеллюцида бластоцисты прикрепились к стеклянной поверхности капилляра, дали разрастание по стеклу клеток трофэктодермы и сформировали хорошо видимые узелки из клеток внутренней клеточной массы.
Пример 4. Проводят аналогично примеру 1, но среду готовят в соотношении компонентов, мас.%:
Результаты: через 72 ч культивирования из 12 эмбрионов 10 эмбрионов (83,3%) достигли стадии бластоцисты. Через 96 ч культивирования вылупилось из зоны пеллюцида 9 бластоцист, или 75% от общего числа эмбрионов. Прикрепление бластоцист к стенке капилляров отмечено не было.
Пример 5. Проводят аналогично примеру 1, но среду готовят в соотношении компонентов, мас.%:
Результаты: через 72 ч культивирования из 10 эмбрионов 6 эмбрионов (60%) достигли стадии бластоцисты. Через 96 ч культивирования вылупилось из зоны пеллюцида 4 бластоцист, или 40% от общего числа эмбрионов. Все образовавшиеся в результате культивирования и вышедшие из зоны пеллюцида бластоцисты прикрепились к стеклянной поверхности капилляра, однако разрастание по стеклу клеток трофэктодермы было слабо выражено.
Пример 6. Проводят аналогично примеру 1, но среду готовят в соотношении компонентов, мас.%:
Результаты: через 72 ч культивирования из 19 эмбрионов 15 эмбрионов (78,9%) достигли стадии бластоцисты. Через 96 ч культивирования вылупилось из зоны пеллюцида 12 бластоцист, или 63,2% от общего числа эмбрионов. Все образовавшиеся в результате культивирования и вышедшие из зоны пеллюцида бластоцисты прикрепились к стеклянной поверхности капилляра, однако разрастание по стеклу клеток трофэктодермы было слабо выражено.
Таким образом, наиболее оптимальными являются примеры 2 и 3, которые дали хороший результат, а именно в результате культивирования через 72 ч все эмбрионы (100%) достигли стадии бластоцисты. Через 96 ч культивирования вылупилось из зоны пеллюцида 80-81,8% от общего числа эмбрионов. Все образовавшиеся в результате культивирования и вышедшие из зоны пеллюцида бластоцисты прикрепились к стеклянной поверхности капилляра, дали разрастание по стеклу клеток трофэктодермы и сформировали хорошо видимые узелки из клеток внутренней клеточной массы. Таким образом, на основании результатов исследований был сделан вывод, что добавление к среде для краткосрочного хранения и культивирования эмбрионов сыворотки крови 6-7-месячных козочек, содержащей максимальное количество IGF1 и IGF2, улучшает сохранность эмбрионов и их способность к имплантации.
Исследования содержания в сыворотке крови коз даны в таблице.
Испытание среды
Цель эксперимента состоит в том, чтобы установить качество новой среды для культивирования эмбрионов коз в сравнении с уже имеющимися.
В эксперименте используют коз зааненской породы (n=10). Получение и оценка эмбрионов производится по описанной схеме.
После оценки эмбрионы случайным образом распределяют на 4 группы. Эмбрионы, предназначенные для культивирования в среде DMEM без белка, составляют 1 группу (n=10), в среде DMEM с 20% FCS ("Flow", Англия) - 2-ю группу (n=10); в среде Хэма F-10 ("Serva", Германия) - 3-ю группу; n=10), в среде DMEM ("Flow", Англия) с 20% IGS - 4-ю группу (n=12). 1-3 группы были контрольными, 4 группа - опытная. Эмбрионы перенесли в пластиковые чашки Петри со средами культивирования. Затем по 5-6 зародышей помещают в стеклянные капилляры. Объем культуральной среды в капилляре должен составлять около 20 мкл. Капилляры заполняют таким образом, чтобы на концах оставались пузырьки воздуха. Затем капилляры помещают в стеклянные флаконы под слой парафинового масла. Флаконы заполняют трехкомпонентной газовой смесью (5% CO2, 5% O2 и 90% N2), плотно закрывают, опускают в сосуд с водой и помещают в термостат при 37°С. Через 72 ч культивирования подсчитывают число бластоцист, а через 96 ч число вылупившихся бластоцист. Вылупившимися считают эмбрионы, полностью вышедшие из зоны пеллюцида.
Результаты: в 1-й группе (среда DMEM без белка) через 72 ч культивирования 7 эмбрионов (70%) достигли стадии бластоцисты, во 2-й и 3-й группах (среда DMEM с 20% FCS и среда Хэма F-10 по 8 эмбрионов (80%) достигли стадии бластоцисты, в 4-й группе (среда DMEM с 20% сывороткой крови 6-7-месячных козочек) все 12 эмбрионов (100%) достигли стадии бластоцисты.
Через 96 ч в 1-й группе вылупилось из зоны пеллюцида 5 бластоцист, или 50% от общего числа эмбрионов, во 2-й группе - 6 бластоцист, или 60%, в 3-й группе - 5 бластоцист, или 50%, в 4-й группе - 10 бластоцист, или 83,3%.
В 4-й группе все образовавшиеся в результате культивирования и вышедшие из зоны пеллюцида бластоцисты прикрепились к стеклянной поверхности капилляра, дали разрастание по стеклу клеток трофэктодермы и сформировали хорошо видимые узелки из клеток внутренней клеточной массы. Во 2-й группе прикрепление отмечалось у 4-х бластоцист из 5-ти, однако было менее выражено. В 1-й и 3-й группах прикрепление вылупившихся бластоцист и разрастание клеток отмечено не было.
Таким образом, из эксперимента следует, что двуклеточные эмбрионы коз успешно развиваются до бластоцисты и вылупляются из зоны пеллюцида в среде DMEM с 20% IGS. При этом процент развития на 23,3-33,3% выше, чем в стандартных средах. Эмбрионы, культивируемые в среде DMEM с 20% ISG, обладают выраженной способностью прикрепляться к субстрату, формировать выраженную внутреннюю клеточную массу и давать разрастание клеток трофэктодермы.
Таким образом, заявляемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями обладает рядом преимуществ:
1. Применение среды дает высокий процент развитых эмбрионов с высокой способностью к имплантированию.
2. Действующее вещество среды - IGF - находится в естественной биологической жидкости в сбалансированном соотношении со всеми необходимыми веществами для эмбриона.
3. Учитываются видовые особенности животных, для которых среда предназначена.
4. Среда проста по составу и проста в приготовлении.
6. Среда не требует использования дорогостоящих препаратов.
Изобретение относится к области ветеринарии. Среда для культивирования доимплантационных эмбрионов включает в себя среду DMEM, инактивированную сыворотку крови 6-7-месячных козочек, в крови которых содержание IGF1 и IGF2 соответственно составляет 54,73 и 231,50 нмоль/л, глюкозу, стрептомицин и пенициллин при следующем соотношении компонентов в мас.%: инактивированная сыворотка крови 6-7-месячных козочек - 15,0-20,0; глюкоза - 0,40-0,45; стрептомицин - 0,004-0,005; пенициллин - 0,003-0,0035; среда DMEM - остальное. Использование данной среды для культивирования доимплантационных эмбрионов приводит к увеличению сроков хранения эмбриона в незамороженном состоянии, а также повышает уровень приживляемости пересаженных ранних эмбрионов при их трансплантации от коз доноров к реципиентам. 1 табл.
Среда для культивирования доимплантационных эмбрионов коз in vitro, включающая среду DMEM, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит инактивированную сыворотку крови 6-7 месячных козочек, в крови которых содержание IGF1 и IGF2 соответственно составляет 54,73 и 231,50 нмоль/л, глюкозу, стрептомицин и пенициллин при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| АДАМС Р | |||
| Методы культуры клеток для биохимиков | |||
| - М.: Мир, 1983, с.262 | |||
| WO 2007012117, 01.02.07 | |||
| Методы культивирования клеток | |||
| Сборник научных трудов | |||
| - Ленинград: Наука, 1988, с.47-57. |
