СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕГРАЦИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК В ГЕНОМ ЖИВОТНЫХ НА СТАДИИ ЭМБРИОНА Российский патент 2002 года по МПК C12N15/10 C12N15/89 

Изобретение относится к области биологии, в частности к биотехнологии получения трансгенных животных, и может быть применено для повышения эффективности технологии получения трансгенных животных.

В настоящее время получение трансгенных животных осуществляется, главным образом, путем микроинъекции генноинженерных конструкций в эмбрионы ранних стадий развития. Однако низкая вероятность интеграции чужеродной ДНК в геном эмбрионов и снижение жизнеспособности определенной части эмбрионов после введения генноинженерной конструкции создает необходимость в содержании большого числа животных-реципиентов, которым трансплантируются эти эмбрионы, что делает работы по получению трансгенных животных дорогостоящими.

В связи с этим важное значение придается поиску путей, позволяющих уменьшить поголовье животных, используемых в работах по получению первичных трансгенных животных.

Одним из путей решения проблемы может быть разработка эффективного способа определения интеграции чужеродной ДНК в геном эмбрионов животных на доимплантационных стадиях развития, то есть до их трансплантации животным-реципиентам, что даст возможность трансплантировать животным-реципиентам только эмбрионы с точно установленной интеграцией введенного чужеродного гена и существенно сократить число используемых животных-реципиентов и расходы на их приобретение и длительное содержание во время подготовки к трансплантации эмбрионов и периода беременности.

Известно два основных способа определения интеграции чужеродной ДНК на стадии эмбрионов, до трансплантации их животным-реципиентам, с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ анализа с использованием прямого метода ПЦР (прототип).

Первый способ определения интеграции генноинженерных конструкций в геном животных на стадии доимплантационных эмбрионов основан на использовании прямого метода ПЦР, сущность которого заключается в следующем. Оплодотворенные яйцеклетки (зиготы) на стадии двух пронуклеусов микроинъецируют генноинженерной конструкцией (чужеродной ДНК) в один из пронуклеусов. После этого их культивируют in vitro до стадии расширенной или вылупившейся бластоцисты. От каждой бластоцисты отсекают фрагмент трофобласта (20-25 бластомеров), из этих бластомеров выделяют ДНК, которую используют для анализа интеграции введенной генноинженерной конструкции методом ПЦР. Данный способ анализа называется прямым, так как никаких дополнительных манипуляций с ДНК, выделенной из бластомеров, не производится. В то время, пока проводится анализ интеграции методом ПЦР, биопсированные эмбрионы продолжают культивировать до момента определения интеграции в их геном генноинженерной конструкции, введенной в зиготу. Эмбрионы с установленной интеграцией трансгена трансплантируют животным-реципиентам (King D. , Wall R. I. Identifikation of specific gene sequences in preimplantation embryos by genomic amplifikation: Detektion of a transgene. (Mol. Repr. Dev. - 1988/N1, p. 57-62).

Однако как показали дальнейшие исследования, недостатком способа являлось то, что данный способ анализа методом прямого ПЦР выявлял слишком высокий процент интеграции трансгена в эмбрионы (до 70-80%), который затем не совпадал с количеством трансгенных потомков, родившихся из этих эмбрионов, то есть при этом способе определения наблюдался очень высокий ложноположительный результат. Выяснение причин этого эффекта показало, что неинтегрированная чужеродная ДНК имеет довольно длительный период "полужизни" как внутри эмбриона, так и на его поверхности, и отдельные участки ее хорошо сохраняются 6-8 дней, пока эмбрион развивается от зиготы до стадии бластоцисты. Поэтому, когда проводится анализ интеграции методом ПЦР, амплифицируется как ДНК, интегрированная в геном эмбриона, так и свободная - неинтегрированная. В результате чего и получается высокий ложноположительный результат.

Второй способ. С целью исключения ложноположительных результатов был предложен модифицированный метод ПЦР, основанный на принципе биохимического различия между интегрированной и неинтегрированной генноинженерными конструкциями. Этот способ основан на использовании рестриктной эндонуклеазы Dpn-I. Это универсальная рестриктаза расщепляет последовательность GATC только в том случае, если аденин (А) в этой последовательности находится в метилированном состоянии. Клетки эукариот не обладают способностью метилировать аденин. Однако такой способностью обладают бактериальные клетки, поэтому генноинженерные конструкции перед введением их в эмбрионы метилируют бактериальной dam-метилазой и таким образом аденин в последовательности GATC делают метилированным. Если после введения генноинженерной конструкции в эмбрион она интегрируется в хромосомную ДНК эмбриона, то после репликации трансгена в процессе деления клеток эмбриона метилированный аденин в хромосомной ДНК в последовательности GATC заменяется на неметилированный, а неинтегрированная конструкция продолжает нести в своем составе метилированный аденин. Поэтому, когда ДНК, выделенную из фрагментов трофобласта эмбрионов, обрабатывают рестриктазой Dpn-I, неинтегрированная конструкция расщепляется в последовательностях GATC, а интегрированная и реплицированная остается нетронутой, что и позволяет определять интеграцию трансгена методом ПЦР. Ферментативный метод расщепления свободной (неинтегрированной) генноинженерной конструкции позволил несколько сократить процент полученных ложноположительных результатов. Однако, разрушить остатки неинтегрированной конструкции при этом способе полностью не удается, и оставшаяся часть этой ДНК амплифицируется при проведение ПЦР и тем самым создает условия для получения ложноположительного результата. Кроме того, проведение нескольких последовательных ферментативных реакций снижало выход конечного продукта амплификации в каждой реакции и, следовательно, эффективность метода в целом. (Cousens С. , Carver A. S. , Wilmut I. et. al. Use of PCR-based metod for selection of integration transgenes in preimplantation embryos. /Mol. Reprod. - 1994, N 39, p. 384-391). Поэтому для анализа требуется отсекать от эмбриона значительное число клеток трофобласта, что ведет к снижению жизнеспособности анализируемых эмбрионов. Таким образом, оба вышеприведенных способа определения интеграции в геном эмбрионов введенных генноинженерных конструкций не позволяют избавиться от остатков неинтегрированной конструкции и избежать получения ложноположительных результатов.

Целью настоящего изобретения является разработка способа определения истинной интеграции в геном эмбрионов генноинженерных конструкций, введенных в эмбрионы, и исключения возможности получения ложноположительных результатов для повышения эффективности технологии получения трансгенных животных.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе определения интеграции чужеродной ДНК в геном животных на стадии эмбриона, включающем введение генноинженерных конструкций в эмбрионы, культивирование этих эмбрионов до стадии бластоцисты, биопсию определенной части трофобласта бластоцист и использование отсеченного фрагмента трофобласта для определения интеграции в геном животных введенной чужеродной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), перед проведением ПЦР-анализа производят микрофракционирование тотальной ДНК, выделенной из отсеченных фрагментов трофобласта эмбрионов методом электрофореза в агарозном геле, в результате которого происходит разделение тотальной ДНК на высокомолекулярную хромосомную ДНК, в которую входит интегрированная в геном генноинженерная конструкция, и низкомолекулярную фракцию, в состав которой входят остатки неинтегрированной конструкции, и затем для определения интеграции трансгена в геном эмбриона методом ПЦР используют фракцию высокомолекулярной ДНК.

После проведения электрофореза фракцию высокомолекулярной ДНК каждого образца вырезают из геля одноразовыми пластиковыми трубочками, диаметр которых не превышает ширины зубца гребенки.

Из полученных срезов агарозного геля проводят быструю элюцию высокомолекулярной ДНК, которую используют для дальнейшего анализа с помощью высокочувствительного варианта ПЦР (one tube nested PCR). Кроме того, для исключения перекрестной контаминации содержимого лунок между собой, в процессе проведения электрофореза лунки, заполненные тотальной ДНК, выделенной из бластомеров, сверху запечатывают 0,8% агарозой с низкой температурой застывания, и буфер, используемый для электрофореза, заливают только до верхнего уровня агарозного геля (несубмариновый электрофорез).

Таким образом, основной отличительной особенностью вновь предлагаемого способа является микрофракционирование, перед проведением ПЦР-анализа, тотальной ДНК, выделенной из бластомеров эмбриона, на высокомолекулярную фракцию, в состав которой входит интегрированная в геном эмбриона чужеродная ДНК, и низкомолекулярную фракцию, в состав которой входит неинтегрированная генноинженерная конструкция. Для дальнейшего анализа методом ПЦР используют только фракцию высокомолекулярной ДНК.

Пример 1. Для полной и всесторонней проверки эффективности разработанной системы анализа были проведены эксперименты по определению интеграции введенных чужеродных генов в геном эмбрионов. В пронуклеусы 80 мышиных зигот была микроинъецирована чужеродная ДНК. Из них 45% зародышей развилось in vitro до стадии бластоцисты, которые затем были разделены на два фрагмента. Две половинки одной бластоцисты являлись контролем и опытом по отношению друг к другу. Лизис клеток этих фрагментов и выделение из них ДНК проводились по общепринятым методам.

Выделенную тотальную ДНК вносили в лунки 0,8% агарозного геля и запечатывали их сверху 0,8% агарозой с низкой температурой застывания. Буферный раствор заливали только до верхнего уровня агарозного геля. После проведения электрофореза высокомолекулярную ДНК каждого образца вырезали из геля одноразовыми трубочками. Из вырезанных фрагментов геля общепринятым методом проводили элюцию высокомолекулярной ДНК, которую использовали для дальнейшего анализа с помощью высокочувствительного варианта ПНР (one tube nested PCR).

Анализ результатов этого эксперимента показал (табл. 1), что путем микрофракционирования тотальной ДНК эмбрионов в агарозном геле можно полностью отделить неинтегрированную ДНК генноинженерной конструкции от интегрированной в геном эмбриона.

Пример 2. С целью проверки вновь предлагаемого способа в условиях практической работы проведен эксперимент на мышах. Для работы были использованы гибридные мыши (CBAхC57B1) первого поколения, эмбрионы которых достаточно хорошо проходят двуклеточный блок при культивировании вне организма до стадии бластоцисты. Эмбрионы на стадии зиготы, полученные от мышей-доноров, микроинъецировали генноинженерной конструкцией, включающей нуклеотидные последовательности гена эритропоэтина человека под промотором aS1-казеина. Микроинъецированные зиготы культивировали in vitro до стадии бластоцисты. После чего от каждой бластоцисты был отсечен фрагмент трофобласта (15-20 бластомеров), каждый из которых был разделен на две части и использован для определения интеграции инъецированной в зиготы генноинженерной конструкции. При этом в одной части фрагмента определение интеграции проводили прямым методом ПЦР, а в другой по вновь предлагаемому способу с микрофракционированием ДНК (пример 1).

После проведения ПЦР-анализа все оперированные бластоцисты были трансплантированы самкам-реципиентам по 6-7 штук каждому реципиенту. Сравнительный анализ эффективности вновь предложенного и известного способов показал (табл. 2), что при определении интеграции трансгена на стадии эмбриона вновь предложенным способом с признаками интеграции оказалось 17,6% эмбрионов, тогда как при определении прямым методом ПЦР с признаками интеграции оказалось 76,5% эмбрионов. Однако анализ интеграции трансгена, проведенный на мышах, родившихся из этих эмбрионов, показал, что только 15,8% потомков оказались трансгенными, т. е. это практически тот процент трансгенности (17,6%), который был определен при использовании вновь предлагаемого способа определения интеграции с микрофракционированием ДНК эмбрионов. Тогда как 76,5% интеграции, определенной прямым методом ПЦР, являлось явно завышенным и представляло собой ложноположительный результат. Кроме того, 6 эмбрионов с признаками интеграции трансгена, выявленные с помощью вновь предлагаемого способа, были трансплантированы трем из пяти самкам-реципиентам, и именно от этих трех самок были получены три трансгенных мышонка, что еще раз подтверждает правильность определения интеграции вновь предлагаемым способом.

Таким образом, в эксперименте с рождением трансгенных мышей показано, что вновь предлагаемый способ определения интеграции трансгена на стадии эмбриона с использованием принципа микрофракционирования тотальной ДНК клеток трофобласта позволяет определять истинную интеграцию трансгена в геном животных, в то время как прямой метод ПЦР не позволяет выявить истинной картины интеграции и дает очень высокий процент ложноположительных результатов.

Изобретение относится к биотехнологии получения трансгенных животных и может быть использовано для повышения эффективности технологии получения трансгенных животных. Способ определения интеграции чужеродной ДНК в геном животных на стадии эмбриона включает следующие стадии: введение генноинженерной конструкции в эмбрион, культивирование эмбриона до стадии бластоцисты, биопсию трофобласта бластоцисты, выделение из отсеченного фрагмента трофобласта тотальной ДНК, микрофракционирование тотальной ДНК несубмариновым вариантом электрофореза с запечатыванием лунок 0,8% агарозой с низкой температурой застывания с разделением на низкомолекулярную и высокомолекулярную фракции, определение интеграции трансгена в геном эмбриона методом ПЦР фракции высокомолекулярной ДНК. 2 табл.

Способ определения интеграции чужеродной ДНК в геном животных на стадии эмбриона, включающий введение генно-инженерной конструкции в эмбрионы, культивирование их до стадии бластоцисты, биопсию трофобласта бластоцист, выделение из отсеченного фрагмента трофобласта тотальной ДНК и использование тотальной ДНК для определения интеграции введенной чужеродной ДНК в геном эмбриона методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), отличающийся тем, что для определения истинной интеграции трансгена в геном эмбриона и повышения эффективности технологии получения трансгенных животных, для проведения ПЦР используют фракцию высокомолекулярной ДНК, выделенную из тотальной ДНК эмбриона, путем предварительного микрофракционирования тотальной ДНК эмбриона несубмариновым вариантом электрофореза с запечатыванием лунок 0,8% агарозой с низкой температурой застывания.