СПОСОБ УЛУЧШЕНИЯ ОБУЧАЕМОСТИ И ПАМЯТИ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2010 года по МПК A61K38/17 A61K31/70 A61P25/28 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу улучшения обучаемости и/или памяти у млекопитающих при помощи диеты и, более детально, к способу улучшения обучаемости и/или памяти у млекопитающих путем введения пищевого источника сиаловой кислоты.

Уровень техники

Было давно замечено, что грудное вскармливание является предпочтительным способом вскармливания для человека. Среди наиболее значимых преимуществ необходимо отметить оптимальное умственное развитие. Поэтому существует необходимость создать композицию молочной смеси, которая будет обеспечивать оптимальное умственное развитие у детей на искусственном вскармливании, сравнимое по темпам с развитием детей на грудном вскармливании.

По сравнению с головным мозгом других приматов, головной мозг взрослого человека в четыре раза больше по отношению к массе тела, однако человеческий детеныш при рождении является относительно незрелым. Parker. S.T. et al., Origin of Intelligence, pp.313-345, The Johns Hopkins Univ. Press, Baltimore, MD (1999). Головной мозг активно развивается как до, так и после рождения, при этом для его правильного развития необходимо своевременное поступление питательных веществ. Оптимальная пищевая поддержка во время критической фазы раннего развития головного мозга оказывает продолжительный эффект на когнитивные функции - объект пристального внимания врачей и клиницистов. Lucas, A. et al., BMJ, 217:1481-1487 (1998), и Lucas. A. et al., Lancet, 339:261-264 (1992). В рандомизированных двойных слепых контролируемых исследованиях у недоношенных детей было показано, что коэффициент умственного развития в 8 лет (IQ) у детей, получавших стандартные молочные смеси, был ниже, чем у детей, получавших обогащенные молочные смеси. См. Lucas, Id. (1998). Вызывает беспокойство тот факт, что почти у половины детей мужского пола, получавших стандартные молочные смеси, отмечался пониженный IQ, составлявший только 13% IQ детей, вскармливаемых обогащенными молочными смесями. Такие исследования подчеркивают особенную восприимчивость недоношенных детей и детей с низкой массой тела при рождении к оптимальному вскармливанию.

Специфические уникальные компоненты человеческого молока обладают способностью поддерживать быстрое развитие головного мозга. В частности, сиаловые кислоты (семейство N- и O-замещенных производных нейраминовой кислоты; и, в частности, N-ацетилнейраминовой кислоты, или NANA), присутствующие в большом количестве в олигосахаридах человеческого молока (вплоть до 1 г/л) формируют концевые функциональные остатки ганглиозидов и гликопротеинов головного мозга. Wang, В. et al., Am. J. Clin. Nutr., 74:510-515 (2001) и Carlson, S. E, Am. J. Clin. Nutr., 41:720-726 (1985). Компоненты сиаловых кислот в высокой концентрации присутствуют в грудном молоке матери сразу после рождения ребенка. Idota et al., in J. of Japanese Soc. Of Nutr. and Food Sci. (Nihon Eiyo Shokuryo Gakkai-shi), 47(5):363-367(1994), продемонстрировал существенное уменьшение содержания 6'-сиалилактозы в грудном молоке человека с 3 по 482 день после родов.

В природе самые высокие концентрации сиаловой кислоты обнаруживаются в коре головного мозга человека. Schauer, R., Sialic acids, Chemistry, Metabolism and Function, Springer-Verlag, Wien, New York (1982) and Svennerholm, L. et al., Biochem Biophys Acta, 1005:109-117 (1989). В частности, нейрональная молекула клеточной адгезии (NCAM) представляет собой сиалидированный белок, который, по-видимому, играет очень важную роль в процессах обучения и памяти. Он принимает участие во многих морфогенетических процессах, включая миграцию клеток, рост нейритов, поиск пути прорастания нервных волокон, прорастание нервных волокон, регенерацию и синаптическую пластичность. Nakayama, J. et al., Virchows Archiv, 433:419-426 (1998), Mahal, L, К. et al., J.Biol. Chem., 277:9255-9261 (2002), and Ong, E. et al., Glycobiology, 8:415-424 (1998). У грызунов уровень полисиализации NCAM напрямую ассоциирован с повышенной способностью к обучению и запоминанию. Cremer, H. et al., Nature, 367:455-459 (1994).

Исследователи показали, что большая часть N-ацетилнейраминовых кислот (NANA) в головном мозге новорожденных крысят, получавших NANA посредством интраперитонеального введения, включается в интрасинаптическую фракцию. Morgan, B.L. G. et al., Br. J.Nutr., 46:231-238 (1981). Позже, Carlson, S.E. et al., in J.Nutr., 116:881-886 (1986) показал, что как оральное, так и интраперитонеальное введение N-ацетилнейраминовых кислот приводит к образованию значительного большего количества церебральных и церебеллярных ганглиозидов и гликопротеина N-ацетилнейраминовых кислот, чем введение глюкозы.

Morgan, В. L. G. et al., in J. Nutr., 110:416-424 (1980) также показал, что крысиные детеныши, получавшие плохое питание, которым интраперитонеально вводили N-ацетилнейраминовую кислоту, быстрее выучивали и запоминали лабиринт, чем детеныши, получавшие глюкозу, кроме того, у них регистрировалось меньше отклонений в поведении, несмотря на плохое питание.

Композиции на основе коровьего молока обычно содержат мало сиаловых кислот. В одном исследовании было показано, что концентрация сиаловых кислот в нескольких композициях, содержащих комбинацию казеин/сыворотка, составляла меньше 200 мг сиаловых кислот на литр. Кроме того, композиции на основе соевых белков также содержат очень низкое количество сиаловых кислот, даже по сравнению с композициями на основе коровьего молока. Таким образом, композиции на основе соевых белков, не содержащие лактозы, имеют очень низкое содержание сиаловых кислот. В некоторых исследованиях было показано, что диетические добавки сиаловых кислот, или содержащие сиаловые кислоты, имеют существенное преимущество.

Известно несколько источников сиаловых кислот в их различных конъюгированных формах. К ним относятся, без ограничений указанными, свободная N-ацетилнейраминовая кислота (или сиаловая кислота), олигосахарид сиалиллактозы, ганглиозиды, содержащие сиаловую кислоту, и макропептид казеина (СМР), также известный как гликомакропептид (GMP) и, если он выделен из коровьего молока, гликомакропептид казеина (CGMP) и т.п.

Способ получения CGMP описан в заявке на патент США 20040022918, который заключается в создании сыра из молока путем коагуляции коровьего молока, при этом химозин вызывает створаживание коагулята, поскольку он выжимает сыворотку. Макропептид казеина (СМР) высвобождается из белка казеина в результате воздействия химопсина на каппа-казеин, при этом с сывороткой удаляется около 90% СМР. СМР представляет собой гетерогенную группу белков, включающую все генетические вариации и посттрансляционные изменения каппа-казеина (Yvon et al., Reprod. Nutr. Dev., 34:527-537 (1994)). Преобладающим углеводородом является сиаловая кислота. Гликомакропептид или GMP является основным (50-75%) компонентом СМР. Углеводородная составляющая GMP делает его растворимым в 12% растворе трихлоруксусной кислоты. Целый ряд аналитических измерений включает предварительное лечение, которое включает раствор ТСА, что позволяет выделить, по крайней мере, часть негликозилированного СМР. Например, способ, опубликованный в источнике The Official Journal of the European Communities (L228/10 Annex IV), включает использование HPLC для измерения GMP в диетических продуктах и уровня GMP для расчета уровня сырной сыворотки, присутствующей в образце. Другие способы получения CGMP из молока описаны Brody, E.P., in., Br. J. of Nutr 84 (Suppl.1):S39-S46 (2000).

Способы добавления сиаловой кислоты или источников сиаловой кислоты в определенные питательные смеси описаны в патенте США No. 6,506,422, в котором раскрываются определенные питательные смеси, содержащие гликомакропептид казеина и комплементарные незаменимые аминокислоты, за исключением фенилаланина, предназначенные для больных фенилкетонурией. Уровни сиаловых кислот в молочных смесях не упоминаются.

В патенте США No. 6,270,827 описываются композиции, содержащие белки человеческого молока или рекомбинантные факторы устойчивости хозяина, одним из которых является рекомбинантный человеческий каппа-казеин, для обогащения искусственных молочных смесей.

В патенте США No. 4,762,822 раскрывается использование N-ацетилнейраминовой кислоты или ганглиозидов, содержащих сиаловые кислоты, в молочных смесях для защиты новорожденного от микроорганизмов, вызывающих инфекции желудочно-кишечного тракта.

Международная заявка на патент WO 01/60346 А2 касается питательной смеси, содержащей олигосахариды олигофруктозы и сиалиллактозу в качестве пребиотических добавок для улучшения роста бифидобактерий в кишечнике, которые могут использоваться в комбинации с молочной смесью.

Заявка WO-A-00 описывает использование гидролизата белков молока для лечения заболеваний костей и зубов. Гликомакропептид казеина (CGMP) экстрагируют из свежей сыворотки путем комбинации электродиализа, катионной обменной смолы, анионной обменной смолы, выпаривания, спрей-высушивания, ультрафильтрации и лиофилизации, и используют для обогащения пищевых продуктов и жидких энтеральных композиций.

Несмотря на то, что была показана возможность применения сиаловой кислоты для различных целей, нет доказательств того, что пищевые добавки сиаловой кислоты влияют на обучение и память у млекопитающих. Поскольку применение различных диетических добавок является простым в использовании и распространенным способом введения различных агентов в организм, в особенности, новорожденным млекопитающим, он может быть полезен для улучшения обучаемости и памяти у млекопитающих. Указанный способ является особенно полезным для новорожденных млекопитающих в неонатальном периоде, когда существует необходимость улучшить обучаемость и память.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вкратце, настоящее изобретение относится к новому способу улучшения обучения и/или памяти у млекопитающих, заключающемуся во введении млекопитающему гликомакропептида казеина в количестве, достаточном для улучшения памяти и/или обучения у млекопитающих.

Настоящее изобретение также относится к новому способу увеличения количества пептидных связей сиаловой кислоты в головном мозге, заключающемуся во введении млекопитающему количества гликомакропептида казеина, которое является достаточным для увеличения количества пептидных связей сиаловой кислоты в головном мозге млекопитающих.

Настоящее изобретение относится к новому способу улучшения обучаемости и/или памяти у млекопитающих, который включает следующие этапы: определение того, насколько млекопитающее нуждается в улучшении памяти и/или обучаемости; и, если нуждается, введение гликомакропептида казеина в количестве, достаточном для улучшения процессов памяти и/или обучения у млекопитающих.

Данное изобретение имеет множество преимуществ, среди которых можно отметить то, что данное изобретение предлагает способ улучшения обучения и/или памяти у млекопитающих за счет диетических добавок, а также способ, который является особенно полезным для млекопитающих субъектов в неонатальном периоде, которые нуждаются в улучшении обучаемости и памяти.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На ФИГ.1 представлена схематическая иллюстрация лабиринта с 8 отсеками, который является полезным для тестирования обучаемости и памяти у поросят.

На ФИГ.2 представлена схематическая иллюстрация одного из отсеков лабиринта, представленного на ФИГ.1

На ФИГ.3 представлены визуальные сигналы, используемые (А) в задании на обучение 1 и (В) в задании на обучение 2, при тестировании обучаемости у поросят.

На ФИГ.4 представлен график, на котором показано, сколько поросят в каждой из четырех групп выучили правильный ответ на визуальный сигнал в задании 1 (число животных представлено как функция количества экспериментов), при этом поросята из Группы 4 (2-й лучший результат) получали диетическое питание, включающее сиаловую кислоту в количестве 842 мг/л, обогащенную гликомакропептидом казеина (240 мг/кг в день силовой кислоты), поросята из Группы 3 (3-й лучший результат) получали диету, включающую сиаловую кислоту в количестве 600 мг/л, обогащенную гликомакропептидом казеина (171 мг/кг в день сиаловой кислоты), поросята из Группы 2 (лучший результат) получали диету, включающую сиаловую кислоту в количестве 250 мг/л, обогащенную гликомакропептидом казеина (71 мг/кг в день сиаловой кислоты), а поросята из Группы 1 (худший результат) получали диету, обогащенную сиаловой кислотой в количестве 77 мг/л (25 мг/кг в день сиаловой кислоты) без гликомакропептида казеина.

На ФИГ.5 представлен график, на котором показано, сколько поросят в каждой из четырех групп выучили правильный ответ на визуальный сигнал в задании 2 (число животных представлено как функция количества экспериментов), при этом поросята из Группы 4 (2-й лучший результат) получали диетическое питание, включающее сиаловую кислоту в количестве 842 мг/л, обогащенную гликомакропептидом казеина (240 мг/кг в день силовой кислоты), поросята из Группы 3 (3-й лучший результат) получали диету, включающую сиаловую кислоту в количестве 600 мг/л, обогащенную гликомакропептидом казеина (171 мг/кг в день сиаловой кислоты), поросята из Группы 2 (лучший результат) получали диету, включающую сиаловую кислоту в количестве 250 мг/л, обогащенную гликомакропептидом казеина (71 мг/кг в день сиаловой кислоты), а поросята из Группы 1 (худший результат) получали диету, обогащенную сиаловой кислотой в количестве 77 мг/л (25 мг/кг в день сиаловой кислоты) без гликомакропептида казеина.

На ФИГ.6 представлена столбиковая диаграмма, показывающая общее количество ошибок в 1 и 2 заданиях в каждой группе поросят, при этом из диаграммы видно, что наибольшее количество ошибок было сделано поросятами из группы, не получавшей обогащения гликомакропептидом казеина, а диетическая поддержка в любом количестве приводит к улучшению процесса обучения животных.

На ФИГ.7 представлены две столбиковые диаграммы, при этом диаграмма (А) показывает среднее количество ошибок, совершенных животными из каждой из четырех групп в задании на память 1, а диаграмма (В) показывает среднее количество ошибок, совершенных животными из каждой из четырех групп в задании на память 2.

На ФИГ.8 представлены две столбиковые диаграммы, при этом диаграмма (А) представляет собой сравнение уровней кортизола в плазме в каждой из четырех групп животных на каждой неделе исследования; а диаграмма (В) представляет собой сравнение уровней кортизола в различных группах, получавших комбинированное лечение, и контрольной группе на каждой неделе 5-недельного исследования.

На ФИГ.9 представлена столбиковая диаграмма, при помощи которой сравнивается концентрация сиаловой кислоты в сером веществе головного мозга животных из экспериментальных и контрольных групп, при этом концентрация сиаловой кислоты в сером веществе головного мозга выше у животных, получавших диету, обогащенную гликомакропептидом казеина.

На ФИГ.10 представлены две точечные диаграммы концентрации связанной с белком сиаловой кислоты в ткани фронтальной коры головного мозга в зависимости от количества экспериментов, которое потребовалось для того, чтобы поросята выучили визуальный сигнал в задании 1 (А) и задании 2 (В), при этом обе диаграммы демонстрируют, что наиболее высокие уровни связанной с белком сиаловой кислоты в ткани фронтальной коры головного мозга коррелируют с улучшением памяти у поросят.

На ФИГ.11 представлены две точечные диаграммы концентрации связанной с гликозидом сиаловой кислоты в ткани фронтальной коры головного мозга в зависимости от количества экспериментов, которое потребовалось для того, чтобы поросята выучили визуальный сигнал в задании 1 (А) и задании 2 (В), при этом обе диаграммы демонстрируют, что наиболее высокие уровни связанной с белком сиаловой кислоты в ткани фронтальной коры головного мозга коррелируют с улучшением памяти у поросят.

На ФИГ.12 представлен график, показывающий количество ошибок в задании на память 1 в Группе 4 в зависимости от концентрации связанной с белком сиаловой кислоты в ткани фронтальной коры головного мозга, из графика видно, что животные, имеющие наиболее высокий уровень связанной с белком сиаловой кислоты в ткани фронтальной коры головного мозга, делают меньшее количество ошибок в заданиях на память и демонстрируют лучшую способность к запоминанию, чем животные, у которых уровень сиаловой кислоты ниже.

На ФИГ.13 представлена диаграмма, показывающая средний прирост массы тела поросят из каждой из четырех групп в течение всего исследования, диаграмма показывает, что диета в каждой группе была сравнима с ожидаемыми избыточными потребностями в питании поросят.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с настоящим изобретением было показано, что обучаемость и память у млекопитающих могут стимулироваться введением млекопитающим гликомакропептида казеина в количестве, достаточном для того, чтобы улучшить память и/или обучаемость у млекопитающих. Согласно полезному варианту осуществления настоящего изобретения гликомакропептид казеина может быть включен в состав.

Было показано, что поросята, получавшие диету, включающую 77 мг/л сиаловой кислоты (без обогащения) и 250 мг/л, 600 мг/л и 842 мг/л сиаловой кислоты, обогащенной гликомакропептидом казеина, демонстрируют различные способности к запоминанию и обучению. В действительности было показано, что как процесс памяти, так и процесс обучения улучшаются у животных, получавших диету, обогащенную гликомакропептидом казеина, по сравнению с животными, не получавшими обогащенную казеином, но в остальном, полностью сбалансированную по питательным веществам диету.

Данное улучшение оказалось неожиданным, поскольку авторам изобретения до настоящего момента не попадались данные о том, что возможно при помощи диетических добавок или диеты, обогащенной гликомакропептидом казеина, улучшить память и обучаемость. Также, предыдущие исследования показали наличие корреляции между пониженным пищевым рационом и включением CGMP в рацион. См., например, патенты США No. 20040077530 и 20030059496. Поскольку пониженный пищевой рацион чаще всего ассоциируется с низким умственным развитием и никак не способствует улучшению обучаемости и памяти, открытие, сделанное авторами настоящего изобретения, о том, что включение в рацион CGMP может значительно улучшить указанные показатели, оказалось неожиданным.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что гликомакропептид казеина является исключительно полезной пищевой добавкой для улучшения памяти и обучаемости. Это удивительно, поскольку коровье молоко, в целом, имеет низкое содержание сиаловой кислоты, кроме того, макромолекулы, с которыми связывается сиаловая кислота, отличаются от макромолекул человеческого молока. Тем не менее, авторы настоящего изобретения показали, что гликомакропептид казеина является удивительно полезной пищевой добавкой для улучшения обучения и памяти, и, кроме того, CGMP является относительно недорогой, легко доступной и безопасной для детей добавкой.

Настоящее изобретение полезно для любого млекопитающего. Однако оно наиболее полезно для человека. Млекопитающее может быть любого возраста. Однако было показано, что заявленный способ является наиболее полезным для млекопитающих в возрасте, приблизительно, от 1 дня до, приблизительно, 4-х лет. Этот возраст включает новорожденных и детей раннего возраста, если речь идет о человеке. Предпочтительно, млекопитающее находится в неонатальном периоде развития. Используемый здесь термин "неонатальный" используется для описания возраста от рождения до 2-х лет жизни.

Способ, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, наиболее полезен в том случае, когда млекопитающее нуждается в улучшении памяти и/или обучаемости. Термин "нуждающийся в улучшении памяти и/или обучаемости" используется здесь для описания субъекта, который получит пользу, неважно, большую или нет, от способа, используемого для улучшения памяти и/или обучаемости. Данный способ может включать следующие этапы: установить, нуждается ли млекопитающее в улучшении обучаемости и/или памяти; и, если нуждается, ввести млекопитающему композицию, включающую эффективное количество гликомакропептида казеина.

Термин "улучшение обучаемости/процессов обучения" обозначает любое улучшение, неважно, существенное или нет, способности к обучению у субъекта. Термин "улучшение памяти/процессов запоминания" обозначает любое улучшение, неважно, существенное или нет, способности к запоминанию у субъекта. Улучшение процессов обучения и/или памяти может быть измерено с помощью одного или нескольких тестов, которые используются для оценки процессов обучения и/или памяти у детей. Примерами таких тестов являются, без ограничений указанными, тест Фагана для определения интеллекта у детей (FTII), целевая перманентная шкала Узгириса-Ханта в модификации Дунста (ОР), тест перекрестного модального переноса (СМТ), шкалы Бэйли для оценки развития у детей, второе издание, индекс умственного развития (MDI), анкета Бэйли для оценки развития нервной системы у детей (BINS) и нейрологический тест Амиеля-Тисона (AT). Дополнительная информация по тестированию процессов обучения и памяти у детей может быть получена у Bayley, N., Manual for the Bayley scales for infant development. Psychological Corporation, New York (1969); Bates, J.E. et al., Child Dev., 50:794-803 (1979); and Black, M.M. et al., Bayley Scales of Infant Development II Assessment. Unlimited Learning Resources, Winston-Salem, NC(2003).

Считается, что необходимость улучшать процессы обучения и/или памяти у млекопитающих и, в частности, у человека может быть обусловлена множеством факторов, которые хорошо известны специалистам в данной области. Например, к таким факторам относятся недостаточное питание, различные факторы окружающей среды, такие как воздействие определенных металлов, недостаток кислорода, травмы, заболевания и другие факторы, которые обусловливают необходимость в таком улучшении. Как обсуждалось выше, из области техники ясно, что существует некая взаимосвязь между интеллектуальными способностями млекопитающих в неонатальном периоде и уровнем определенных питательных веществ в рационе, при этом было показано, что сиаловая кислота является одним из таких питательных веществ. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением раскрывается необходимость в улучшении процессов обучения и/или памяти, или способ определения необходимости улучшения процессов обучения и/или памяти у млекопитающего; при этом, по крайней мере, часть питательных потребностей млекопитающего удовлетворяется путем введения композиции, содержащей, по крайней мере, 100 мг/л сиаловой кислоты, и, в частности, практически все пищевые потребности млекопитающего удовлетворяются путем введения композиции, содержащей менее 100 мг/л сиаловой кислоты.

Когда употребляется выражение "удовлетворяется, по крайней мере, часть питательных потребностей млекопитающего", имеется в виду, что, по крайней мере, 25% пищевых потребностей млекопитающего удовлетворяется заявленной композицией в большую часть периода времени от рождения до настоящего возраста. Предпочтительно, указанная часть пищевых потребностей млекопитающего, которая удовлетворяется в течение большего периода времени от рождения до настоящего возраста, составляет, по крайней мере, 50%, более предпочтительно, 75%, и, еще более предпочтительно, составляет практически все пищевые потребности млекопитающего.

Поскольку в белках сои и белках коровьего молока количество сиаловой кислоты невелико, особенно по сравнению с человеческим молоком, в частности, в молозиве и молоке, вырабатывающимся на ранних стадиях лактации, считается, что млекопитающее, получающее молочные смеси, в которых большая часть белкового состава представлена белками сои или коровьего молока со средним уровнем сиаловой кислоты менее 100 мг/л, нуждается в улучшении процессов обучения и/или памяти. В частности, принято считать, что таким случаем является случай, когда, по крайней мере, 75% от общего веса белка в композиции представлено белками сои или белками коровьего молока, и это даже более верно, чем когда полностью весь белковый состав формулы представлен белками сои или белками коровьего молока.

В действительности принято считать, что необходимость в улучшении процессов обучения и памяти у млекопитающих возникает, когда пищевые потребности млекопитающего удовлетворяются диетой, обеспечивающей поступление сиаловой кислоты в количестве, которое ниже количества, которое в норме поступает в организм ребенка при грудном вскармливании. В том случае, когда употребляется выражение "пищевые потребности млекопитающего удовлетворяются", имеется в виду, что в течение большей части периода времени от рождения до настоящего возраста млекопитающего пищевые потребности млекопитающего полностью удовлетворяются. Термин "диета, обеспечивающая поступление сиаловой кислоты в количестве, которое ниже количества, которое в норме поступает в организм ребенка при грудном вскармливании", относится к диете, включающей введение жидкой композиции, в которой количество сиаловой кислоты ниже 100 мг/л. Согласно другим вариантам осуществления настоящего изобретения количество сиаловой кислоты в указанной жидкой композиции составляет менее 200 мг/л.

Согласно настоящему изобретению, композиция, которая содержит гликомакропептид казеина, может вводиться млекопитающему при помощи любого способа энтерального введения. Используемый здесь термин "энтеральное введение" означает введение композиции в любой отдел желудочно-кишечного тракта млекопитающего и включает, без ограничения указанными, пероральное введение и энтеральное зондовое введение.

Поскольку гликомакропептид казеина может вводиться млекопитающему сам по себе, или вместе с другими дополнительными соединениями или материалами, он является полезным источником CGMP как одного из ингредиентов композиции. Композиция, которая включает гликомакропептид казеина, может представлять собой любую питательную композицию, предпочтительно, молочную смесь. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, молочная смесь представляет собой полноценную по питательным веществам молочную смесь, содержащую углеводы, жиры и белки. Количество липидов или жиров может варьировать от 3 до 7 г на 100 ккал. Количество белков обычно варьирует от 1 до 5 г на 100 ккал. Количество углеводов обычно варьирует от 6 до 16 г на 100 ккал.

Используемый здесь термин "композиция" относится к созданной человеком композиции и, например, не относится к грудному молоку.

Источниками белков могут быть любые известные источники, например обезжиренное молоко, молочная сыворотка, казеин, соевый белок, гидролизированный белок, аминокислоты и т.п. Источниками углеводов могут быть любые известные источники, например, лактоза, глюкоза, кукурузный сироп, мальтодекстрины, сахароза, крахмал, рисовый сироп и т.п. Источниками липидов могут быть любые известные источники, включая овощные масла, такие как пальмовое масло, соевое масло, пальмоелин, кокосовое масло, масло триглицеридов средних цепей, высокоолеиновое подсолнечное масло, высокоолеиновое сафлоровое масло и т.п.

В качестве базовой основы для введения CGMP могут использоваться некоторые коммерчески доступные молочные смеси. Например, молочная смесь Enfamil® Lipil с железом (производимая компанией Mead Johnson & Company, Evansville, Indiana, U.S.A) может быть обогащена эффективным количеством CGMP и использоваться в соответствии со способом, заявленным в соответствии с настоящим изобретением. Определенные молочные смеси, подходящие для использования в соответствии с настоящим изобретением, описаны в Примерах, представленных ниже.

Общее количество белка в композиции, из всех доступных источников, является адекватным для детей и составляет, обычно, от 12 г на литр до 18 г на литр и, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, может составлять приблизительно 14 г на литр. Общее количество сиаловой кислоты в композиции может составлять от 200 до 1500 мг на литр. Предпочтительно, заявленная формула содержит жидкость с концентрацией сиаловой кислоты, по крайней мере, 200 мг на литр. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, более предпочтительно, чтобы композиция содержала жидкость с концентрацией сиаловой кислоты, по крайней мере, 300 мг на литр, более предпочтительно, 600 мг на литр. Предпочтительно, композиция содержит вплоть до 6 г гликомакропептида казеина (CGMP) на литр или родственной белковой фракции, коммерчески доступной из разных источников и содержащей приблизительно 81% белка и, приблизительно, от 40 до 60 SA на грамм белка; таким образом, общее количество сиаловой кислоты в композиции составляет от 194 до 1458 мг на литр; или вплоть до 6 г на литр фракции CGMP, содержащей повышенное количество сиаловой кислоты.

Казеин гликомакропептида, который является полезным в соответствии с настоящим изобретением, в целом, может быть выделен из любого источника и иметь любую степень очистки или качество, подходящее для использования в пищевых целях или для включения в молочную смесь. Гликомакропептид казеина может быть выделен из молока при помощи любого подходящего способа. Например, гликомакропептид казеина может быть выделен из концентрата, полученного после концентрации сывороточных белков. Например, это может быть осуществлено путем частичного удаления лактозы из концентрата с последующим добавлением этанола для того, чтобы вызывать преципитацию. Супернатант затем собирают и высушивают для получения гликомакропептида казеина. Более детальное описание этого процесса представлено в патенте США No. 5,216,129, который включен в настоящее описание в качестве ссылки и чье содержание не противоречит информации, представленной здесь. CGMP, полезный для использования в соответствии со способом, заявленным в настоящем изобретении, также может быть получен с помощью способов, описанных в патентах США Nos. 6,555,659, 5,280,107, 5,968,586 и 5,075,424 а также в заявках РСТ/ и 894/15952 и WO 03/049547. Альтернативно, CGMP может быть получен из коммерческих источников, таких как, например, The Tatua Co-Operative Dairy Company Limited, Tatuanui, Morrinsville, New Zealand, MD Foods Ingredients amba of DK-6920 Videbaek, Denmark, DMV International of NCB-laan 80, NL-5460 BA Veghel, The Netherlands.

В соответствии с заявленным способом, предпочтительно, гликомакропептид казеина или композиция, содержащая гликомакропептид казеина, вводится в количестве, достаточном для того, чтобы обеспечить поступление сиаловой кислоты в организм млекопитающего в концентрации 100 мг/кг в день, и, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, концентрация сиаловой кислоты 200 мг/кг в день является более предпочтительной.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, предпочтительно, общее количество белка в композиции составляет от 12 до 16 грамм на литр, при этом не более 40% по весу указанного белка составляет гликомакропептид казеина. Более предпочтительно, общее количество белка в композиции составляет от 13 до 15 грамм на литр, при этом не более 30% по весу указанного белка составляет гликомакропептид казеина. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, белковый состав композиции представлен гликомакропептидом казина и белками сои.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, используются новые CGMP продукты, в которых уровень сиаловой кислоты выше, чем в стандартных CGMP продуктах, которые являются коммерчески доступными. Указанные новые продукты могут использоваться самостоятельно или в комбинации для того, чтобы увеличить содержание сиаловой кислоты до уровня, близкого к уровню в грудном молоке, при этом учитывается количество сиаловой кислоты в различных ингредиентах. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, гликомакропептид казеина включает гликомакропептид казеина с повышенным содержанием сиаловой кислоты.

Используемый здесь термин "CGMP, имеющий повышенное содержание сиаловой кислоты" относится к содержащей гликомакропептид казеина (CGMP) фракции молока, которая была специально обработана для увеличения уровня сиаловой кислоты и в которой уровень сиаловой кислоты выше, чем до обработки. CGMP продукты, содержащие повышенные уровни сиаловой кислоты, описаны ниже в Примерах 2 и 3.

Один из указанных продуктов, примерный состав которого описан ниже в Примере 2, далее в тексте обозначается как "CGMP, имеющий повышенный уровень сиаловой кислоты" или "CGMP с высоким уровнем сиаловой кислоты". Предпочтительно, количество сиаловой кислоты в указанном CGMP продукте составляет более 60 мг на грамм белка. Предпочтительно, количество сиаловой кислоты превышает 100 мг на грамм белка, более предпочтительно, превышает 150 мг на грамм белка, еще более предпочтительно, 200 мг на грамм белка. Обычно, общее содержание белка в указанном продукте составляет 50-60% по весу сухого порошкового продукта, содержание сиаловой кислоты составляет, приблизительно, 190-230 мг на грамм белка, или, приблизительно, 100-130 мг на грамм порошка. Для сравнения, стандартный сухой порошок CGMP (например, гликомакропептид компании Tatua Co-Operative Dairy Company Limited) содержит 81% белка по весу, а количество сиаловой кислоты составляет приблизительно 52 мг на грамм белка или 42 мг на грамм порошка. Очевидно, что количество сиаловой кислоты в указанном продукте CGMP с высоким содержанием сиаловой кислоты увеличено в 3 раза (из расчета на вес порошка) или в 4 раза (из расчета на белок) по сравнению со стандартными CGMP продуктами. Для сравнения, электродиализированная (ED) сыворотка в порошке содержит 14% белка на сухое основание и, приблизительно, 30 мг сиаловой кислоты на грамм белка, или 4.3 мг сиаловой кислоты на грамм порошка.

Преимущество использования CGMP с высоким содержанием сиаловой кислоты в качестве источника белков в молочных смесях заключается в том, что количество сиаловой кислоты в композиции может быть увеличено без замещения или уменьшения количества стандартных источников белков, которые используются в композиции. Эта особенность является полезной, поскольку обеспечивает минимальное нарушение аминокислотного профиля белков композиции.

Согласно определенному варианту осуществления настоящего изобретения, уровень аминокислоты треонина в CGMP продукте с высоким содержанием сиаловой кислоты ниже, чем в источнике гликомакропептида, из которого получен новый продукт. Указанный тип продукта CGMP с высоким содержанием сиаловой кислоты в данном описании может также обозначаться терминами "CGMP, имеющий повышенный уровень сиаловой кислоты и пониженный уровень треонина" или "CGMP с высоким содержанием сиаловой кислоты и пониженным содержанием треонина". Примерный состав указанного продукта представлен ниже в Примере 3.

Количество сиаловой кислоты в продукте CGMP с высоким содержанием сиаловой кислоты и пониженным содержанием треонина составляет приблизительно 60 мг на грамм белка, а концентрация треонина - менее 15 грамм на 16 грамм азота. Предпочтительно, содержание сиаловой кислоты составляет 100 мг на грамм белка, более предпочтительно, составляет, приблизительно, 150 мг на грамм белка и, еще более предпочтительно, составляет 200 мг на грамм белка. Обычно содержание сиаловой кислоты в CGMP продукте с повышенным содержанием сиаловой кислоты и пониженным содержанием треонина составляет от 85 до 150 мг сиаловой кислоты (SA) на грамм порошка, предпочтительно, от 90 до, приблизительно, 140 мг SA на грамм порошка, что сравнимо с содержанием сиаловой кислоты в CGMP продукте с повышенным содержанием сиаловой кислоты. Однако содержание треонина в CGMP продукте с повышенным уровнем сиаловой кислоты составляет одну четвертую от содержания указанной аминокислоты в коммерческих CGMP продуктах. Предпочтительно, содержание треонина в продукте менее 10 г на 16 г азота, более предпочтительно, менее 7 г на 16 г азота, еще более предпочтительно, менее 5 г на 16 г азота, и, еще более предпочтительно, менее 4 г на 16 г азота. Альтернативно содержание треонина можно выразить другим способом по весу в расчете на общий вес аминокислот в белке, в таком случае содержание треонина ниже 8% по весу в расчете на общий вес аминокислот, предпочтительно, ниже 6%, еще более предпочтительно, ниже 4% и, еще более предпочтительно, ниже 3%.

Преимущество указанного обогащенного сиаловой кислотой продукта заключается в том, что помимо повышенного содержания сиаловой кислоты без нарушения аминокислотного профиля, как обсуждалось выше, может контролироваться количество треонина в источниках белка, входящих в состав данной молочной смеси. Это может быть полезно в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, когда требуется снизить вероятность развития гипертреонинурии или другого заболевания, которое вызывается или потенцируется высоким уровнем треонина в пище.

Например, молочная смесь, которая является полезной в соответствии с настоящим изобретением, может быть составлена таким образом, чтобы содержание сиаловой кислоты составляло, по крайней мере, 200 мг на литр, а общее содержание белка составляло от 12 до 16 грамм на литр, при этом не более 40% по весу обеспечивается CGMP с повышенной концентрацией сиаловой кислоты. Предпочтительно, указанная молочная смесь имеет общее содержание белка от 13 до 15 грамм на литр, при этом не более 30% по весу обеспечивается CGMP с повышенной концентрацией сиаловой кислоты, более предпочтительно, молочная смесь имеет общее содержание белка от 13 до 15 грамм на литр, при этом не более 15% по весу обеспечивается CGMP с повышенным содержанием сиаловой кислоты.

Также в качестве примера, молочная смесь, заявленная в соответствии с настоящим изобретением, может быть составлена таким образом, чтобы содержание сиаловой кислоты составляло, по крайней мере, 400 мг на литр, а общее содержание белка находилось от 13 до 15 грамм на литр, при этом не более 15% по весу обеспечивается CGMP с повышенным содержанием сиаловой кислоты.

Обогащенные гликомакропептидом молочные смеси, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут использоваться таким же образом, как и любые другие коммерчески доступные молочные смеси. Она может быть представлена порошком для последующего разведения или жидкой формой. Композиция должна упаковываться, храниться и транспортироваться таким же образом, как и любой аналогичный продукт, и, в целом, использоваться аналогичным образом.

В представленных ниже примерах описаны некоторые варианты осуществления настоящего изобретения. Другие варианты осуществления настоящего изобретения, в пределах представленной ниже формулы изобретения, будут очевидны специалистам в данной области. Подразумевается, что специфические варианты осуществления настоящего изобретения, а также примеры их реализации представлены исключительно с целью иллюстрации и лучшего понимания настоящего изобретения и находятся в пределах представленной ниже формулы изобретения без ограничения его объема и сущности. Во всех представленных ниже примерах, если дополнительно не оговаривается иное, все данные выражены в процентах от массы.

СПРАВОЧНЫЙ ПРИМЕР 1

В данном примере описывается питательный состав коммерчески доступной молочной смеси, подходящей для обогащения сиаловой кислотой, в соответствии с настоящим изобретением.

Таблица 1 Питательный состав молочной смеси (Enfamil® Lipil с железом) Питательные вещества (нормальное разведение) На 100 каллорий (5 жидких унций) Белки, г 2,1 Жиры, г 5,3 Углеводы, г 10,9 Вода, г 134 Линолевая кислота, мг 860 Витамины A, ME 300 D, ME 60 Е, МЕ 2 К, мкг 8 Тиамин (витамин В1), мкг 80 Рибофлавин (витамин В2), мкг 140 В6, мкг 60 В12, мкг 0,3 Ниацин, мкг 1000 Фолиевая кислота, мкг 16 Пантотеновая кислота, мкг 500 Биотин, мкг 3 С (Аскорбиновая кислота) 12 Холин, мг 12 Инозитол, мг 6 Минералы Кальций, мг 78 Фосфор, мг 53 Магний, мг 8 Железо, мг 1,8 Цинк, мг 1 Марганец, мкг 15 Медь, мкг 75 Йод, мкг 10 Селен, мкг 2,8 Содиум, мкг 27 Калий, мг 108 Хлор, мг 63

Указанная молочная смесь включает следующие ингредиенты: сыворотку с пониженным содержанием минералов, обезжиренное молоко, овощное масло (пальмовое, соевое, кокосовое и высокоолеиновое подсолнечное масла), лактозу и ряд ингредиентов с содержанием менее 1%: масло гриба mortierella alpine, масло Crypthecodinium cohnii, пальмитат витамина А, витамин D3, ацетат витамина Е, витамин К1, гидрохлорид тиамина, гидрохлорид витамина В6, витамин В 12, ниацинамид, фолиевая кислота, пантотенат кальция, биотин, аскорбат натрия, инозитол, хлорид кальция, фосфат кальция, сульфат железа, сульфат цинка, сульфат марганца, сульфат меди, хлорид натрия, цитрат натрия, гидроксид калия, селенит натрия, таурин, нуклеотиды (аденозин 5'-монофосфат, цитидин 5'-монофосфат, динатриевая соль гуанозин 5'-монофосфата, динатриевая соль уридин 5'-монофосфата).

В соответствии со способом, заявленным в настоящем изобретении, к указанной композиции необходимо добавить, например, гликомакропептид казеина в количестве, достаточном для обеспечения концентрации сиаловой кислоты в смеси, описанной в Таблице 1, от 250 мг на литр до, приблизительно, 1500 мг на литр. Добавленное количество сиаловой кислоты будет представлять собой часть общего количества белка в смеси (общее содержание белка приблизительно 2.1 грамм на 100 калорий).

ПРИМЕР 1

В данном примере описываются определенные комбинации источников белка с общим содержанием сиаловой кислоты приблизительно 250 мг на литр. Ингредиенты, представленные в Таблице 2, могут использоваться для замещения белкового компонента композциии, описанной в Таблице 1.

Таблица 2 Источники белка композиции А Ингредиент мг SA/грамм белка^а % белка в ингредиенте Грамм ингредиента/литр Грамм белка/литр мг SA/литр Концентрат белков сыворотки 23,00 35,00 20,26 7,09 163,08 Обезжиренное сухое молоко, немного подогретое 6,37 34,00 15,38 5,23 33,31 CGMP^b 52,00 81,00 1,45 1,17 61,07 Заметки: a. "SA" в таблице обозначает сиаловую кислоту b. CGMP обозначает гликомакропептид казеина

ПРИМЕР 2

В данном примере описываются определенные комбинации источников белка с общим содержанием сиаловой кислоты приблизительно 300 мг на литр. Ингредиенты, представленные в Таблице 3, могут использоваться для замещения белкового компонента композциии, описанной в Таблице 1.

Таблица 3 Источники белка композиции В Ингредиент мг SA/грамм белка^а % белка в ингредиенте Грамм ингредиента/литр Грамм белка/литр мг SA/литр Концентрат белков 23,00 35,00 37,00 12,95 297,85 сыворотки           CGMP^b 52,00 81,00 1,45 1,17 61,07 Заметки: a. "SA" в таблице обозначает сиаловую кислоту b. CGMP обозначает гликомакропептид казеина

ПРИМЕР 3

В данном примере описываются определенные комбинации источников белка с общим содержанием сиаловой кислоты приблизительно 600 мг на литр. Ингредиенты, представленные в Таблице 4, могут использоваться для замещения белкового компонента композиции, описанной в Таблице 1.

Таблица 4 Источники белка композиции В Ингредиент мг SA/грамм белка^а % белка в ингредиенте Грамм ингредиента/литр Грамм белка/литр мг SA /литр Концентрат белков сыворотки 23,00 35,00 13,00 4,55 104,65 CGMP^b 52,00 81,00 12,00 9,72 505,44 Заметки: а. "SA" в таблице обозначает сиаловую кислоту b. CGMP обозначает гликомакропептид казеина

ПРИМЕР 4

В Таблице 5 представлена примерная полноценная питательная композиция молочной смеси с общим содержанием сиаловой кислоты приблизительно 250 мг на литр.

Таблица 5 Пример молочной смеси, содержащей сиаловую кислоту Ингредиент Масса Количество на 10000 литров Лактоза (95% твердого вещества)   573,000 кг Жировая смесь   332,500 кг Концентрат белков сыворотки (36% белка, 5,8% Ash)   202,578 кг Обезжиренное сухое молоко (36% белка, 52% углеводов)   153,844 кг Гликомакропептид казеина (CGMP, 81,18% белка)   14,500 кг Моно- и диглицериды   7,233 кг Фосфат кальция, трехосновный   6,520 кг Одноклеточное масло арахидоновой кислоты   6,485 кг Сухая смесь витаминов для жидкой композиции Enfamil AR   5,250 кг Аскорбиновая кислота 2924,250 г   Инозитол 834,750 г   Твердый зерновой сироп 654,938 г   Таурин 582,750 г   Ниацинамид 119,438 г   Пантотенат кальция 44,730 г   Витамин В 12, 0,1% в крахмале 29,400 г   Биотин, 1% гомогенный 25,095 г   Гидрохлорид тиамина 13,913 г   Рибофлавин 10,238 г   Гидрохлорид пиридоксина 8,138 г   Фолиевая кислота 2,363 г   Концентрат лецитина   3,694 кг Цитрат калия   3,350 кг Одноклеточное масло докозагексаеновой кислоты   3,243 кг Смесь нуклеотидов порошка Enfamil   2,900 кг Мальтодекстрин, 15 DE 2552,290 г   Свободная от цитидин 5-монофосфата кислота 202,710 г   Динатриевая соль уридин 5-монофосфата 59,740 г   Аденозин 5-монофосфат, свободная кислота 47,357 г   Динатриевая соль гуанозин 5-монофосфата 37,903 г   Каррагенан   2,826 кг Хлорид магния   1,657 кг Хлорид кальция, дигидрат   1,200 кг Хлорид холина   0,700 кг Железистый сульфат гептагидрата   0,682 кг Цитрат натрия, дигидрат, гранулированный   0,455 кг Смесь минералов в следовых количествах w/селенит в порошке   0,392 кг Сульфат цинка, моногидрат 276,238 г   Порошок селенита натрия 0,5% 65,907 г   Сульфат меди, порошок 29,510 г   Лактоза, в порошке А 16,323 г   Сульфат марганца, 4,022 г   моногидрат     Смесь витаминов A, D, Е, K в жидкой смеси Enfamil   0,324 кг Ацетат токоферола 160,882 г   Соевое масло 139,612 г   Пальмитат витамина А 17,253 г   Концентрат холекальциферола 5,715 г   Витамин K, жидкий 0,538 г   Аскорбиновая кислота   0,150 кг L-карнитин   0,150 кг Дефторированная вода q.s.   10310,986 кг Гидрохлорид калия   ---

В Таблицах 6 и 7 представлено содержание специфических компонентов в композиции, описанной в Таблице 5 в процентах: 1) масса к массе 2) масса к объему и 3) калорий. Специфическая плотность указанной определенной композиции составляет 1.0310986.

Таблица 6 Композиция молочной смеси Компонент % вес/вес % вес/об. Белки 1.38 1.42 Жиры 3.50 3.61 Углеводы 7.20 7.43 Остаток 0.37 0.38 Общее содержание твердых веществ 12.45 12.84

Таблица 7 Распределение калорий в молочной смеси Компонент % Белки 8.38 Жиры 47.83 Углеводы 43.79

ПРИМЕР 5

В Таблице 8 представлен питательный состав композиции, описанной в Примере 4, на 100 калорий, а также на 100 миллилитров композиции.

Таблица 8 Питательный состав молочной смеси   На 100 калорий На 100 мл Калории, кал 100 68 Белки, г 2.1 1.42 Жиры, г 5.3 3.6 Углеводы, г 10.9 7.4 Линолевая кислота, мг 860 580 Линоленовая кислота, мг 80 54 Арахидоновая кислота, мг 34 23 Докозагексаеновая кислота, мг 17 11.5       Витамин А, ME 300 200 Витамин D, ME 60 41 Витамин Е, ME 2 1.35 Витамин K1, мкг 12 8.1 Тиамин, мкг 120 81 Рибофлавин, мкг 140 95 Витамин Вб, мкг 60 41 Витамин В 12, мкг 0.5 0.3 Ниацин, мкг 1200 812 Фолиевая кислота, мкг 16 10.8 Пантотеновая кислота, мкг 500 340 Биотин, мкг 3 2 Витамин С, мг 14 9.5 Холин, мг 12 8.1 Инозитол, мг 6 4.1 Таурин, мг 6 4.1 L-карнитин, мг 2 1.35       Кальций, мг 78 53 Фосфор, мг 53 36 Магний, мг 8 5.4 Железо, мг 1.8 1.2 Цинк, мг 1 0.68 Марганец, мг 26 17.6 Медь, мг 85 57 Йод, мг 15 10 Натрий, мг 27 18.3 Калий, мг 108 73 Хлор, мг 63 43 Селен, мг 2.8 1.89 Сиаловая кислота, мг 37 25       Соотношение кальций/фосфор ----- ----       AMP Эквиваленты, мг (а) 0.5 0.34 СМР Эквиваленты, мг (а) 2.5 1.69 GMP Эквиваленты, мг (а) 0.3 0.20 UMP Эквиваленты, мг (а) 0.9 0.61 Эквиваленты нуклеотидов, мг (а) 4.2 2.84 TPAN-AMP, мг -- -- TPAN-CMP, мг -- -- TPAN-GMP, мг -- -- TPAN-UMP, мг -- -- Общее содержание TPAN -- -- TPAN-CMP/TPAN-GMP -- -- соотношение     Заметка: Суммарное содержание нуклеотидов и соответствующих нуклеозидов, выраженное по массе нуклеотидов.

СПРАВОЧНЫЙ ПРИМЕР 2

Данный пример иллюстрирует создание CGMP продукта с повышенным содержанием сиаловой кислоты.

Фракцию сырной сыворотки, обогащенную GMP, фракционируют при помощи анионной хроматографии для получения фракции, обогащенной сиаловой кислотой. Аминокислотный профиль продукта аналогичен аминокислотному профилю коммерчески доступного GMP (например, компании Tatua Co-Operative Dairy Company Limited, Tatuanui, Morrinsville, New Zealand), при этом содержание сиаловой кислоты в 1.5-3 раза выше, чем в стандартном продукте.

Из полученной фракции, обогащенной сиаловой кислотой, могут быть удалены все соли при помощи электродиализа, если это необходимо, после чего фракцию высушивают для получения сухого порошка, который затем можно использовать для добавления в жидкую или порошковую молочную смесь. Данный продукт является CGMP продуктом с повышенным содержанием сиаловой кислоты и, к моменту подачи заявки, поставляется компанией Tatua Co-Operative Dairy Company Limited; продукты обозначаются как Х4738, Х4739, Х4740 и Х4741. Содержание белков, сиаловой кислоты, аминокислотный профиль указанных продуктов представлены в Таблице 9.

СПРАВОЧНЫЙ ПРИМЕР 3

Данный пример иллюстрирует получение CGMP продукта с повышенным содержанием сиаловой кислоты и низким содержанием треонина.

Фракцию сырной сыворотки, обогащенную GMP, подвергают частичному протеолитическому гидролизу с последующим фракционированием при помощи анионной хроматографии для получения фракции, обогащенной сиаловой кислотой, с низким содержанием треонина. Содержание сиаловой кислоты в указанном продукте в 1.5-3 раза превышает ее содержание в коммерчески доступных CGMP продуктах, но при этом уровень треонина составляет одну четвертую часть от уровня в исходном CGMP материале.

Из полученной фракции, обогащенной сиаловой кислотой, с низким содержанием треонина, могут быть удалены все соли при помощи электродиализа, если это необходимо, после чего фракцию высушивают для получения сухого порошка, который затем можно использовать для добавления в жидкую или порошковую молочную смесь. Данный продукт является CGMP продуктом с повышенным содержанием сиаловой кислоты и с пониженным содержанием треонина к моменту подачи заявки поставляется компанией Tatua Co-Operative Dairy Company Limited; продукт обозначается как W 4733. Содержание белков, сиаловой кислоты, аминокислотный профиль указанных продуктов представлены в Таблице 10.

Таблица 10 Аминокислотный профиль и содержание сиаловой кислоты четырех CGMP продуктов с высоким содержанием сиаловой кислоты и низким содержанием треонина Аминокислота CGMP с высоким содержанием сиаловой кислоты и низким содержанием треонина       W4733 CGMP порошок ED порошок сыворотки Аргинин 2.3 1.4   Гистидин - 1   Изолейцин 13.1 11.6   Лейцин 5.3 4.6   Лизин 3.2 8.3   Метионин 0.7 1.5   Цистин 0.1 0.2   Фенилаланин 0 1.8   Тирозин 0 0.4   Треонин 3.8 15.9   Триптофан 0 0   Валин 16.3 9.7   Аланин 15.9 6.6   Аспарагиновая кислота 6.3 11.1   Глутаминовая кислота 38.9 26.2   Глицин 2.5 1.5   Пролин 16.9 14.2   Серин 0 8.1           Общее 125.4 124.1           % белка   81 14.31 мг SA/грамм белка   52 29.92 мг SA/грамм 138.03 42.12 4.28 порошка       (повторный анализ) 117.02     Среднее 127.525     Количество аминокислот выражено в граммах аминокислоты на 16 грамм азота CGMP порошок является коммерчески доступным гликомакропептидом, поставляемым компанией Tatua Co-Operative Dairy Company Limited ED сыворотка в порошке представляет собой коммерчески доступную электродиализированную сыворотку в порошке Образцы W4731, W4733 и W4735 представляют собой CGMP с высоким содержанием сиаловой кислоты и низким содержанием треонина и доступны в компании Tatua Co-operative Dairy Company Limited, Tatuanui, Morrinsville, New Zealand.

Как уже упоминалось выше, уровень треонина в новом продукте составляет одну четвертую его уровня в коммерческом продукте. Соответственно, считается, что использование CGMP, обогащенного сиаловой кислотой, с низким уровнем треонина в молочной смеси позволяет создать композицию, имеющую высокий уровень сиаловой кислоты и нормальное, желаемое содержание белка, составляющее приблизительно 14 г белка на литр, а также желаемый аминокислотный профиль с низким уровнем треонина.

ПРИМЕР 6

В данном примере описывается использование CGMP фракции, обогащенной сиаловой кислотой, в молочной смеси.

CGMP продукт, обогащенный сиаловой кислотой, может использоваться в качестве источника белка в молочной смеси аналогичным образом, что и порошок сыворотки или обычный CGMP порошок. В Таблице 11 показано ожидаемое количество сиаловой кислоты в молочной смеси, белковый состав которой обеспечивается за счет традиционных источников. Количество используемого CGMP порошка строго лимитируется для того, чтобы избежать нежелательного отклонения аминокислотного профиля белков от желаемого стандартного профиля для молочной смеси.

Таблица 11 Содержание сиаловой кислоты в молочной смеси, белковый состав которой обеспечивается из традиционных источников Источник белка Сиаловая кислота, мг/ белок, г Процент белка Белок, г/л Сиаловая кислота, мг/л Концентрат белков сыворотки 23 35% 6.82 156.77 Обезжиренное сухое молоко немного подогретое 6.37 34% 6.25 39.8 CGMP продукт, обогащенный сиаловой кислотой 214 54.93% 1.11 237.54 Итого     14.17 434.12

CGMP порошок, используемый в данной композиции, может быть заменен на новый CGMP продукт, обогащенный сиаловой кислотой, как описано выше в справочном примере 3. В Таблице 12 показано, что в этом случае общее содержание сиаловой кислоты увеличивается более чем в два раза без нарушения аминокислотного профиля белка.

Таблица 12 Содержание сиаловой кислоты в молочной смеси, белковый состав которой обеспечивается традиционными источниками, а также новым CGMP продуктом, обогащенным сиаловой кислотой Источник белка Сиаловая кислота, мг/белок, г Процент белка Белок, г/л Сиаловая кислота, мг/л Концентрат белков 23 35% 6.82 156.77 сыворотки         Обезжиренное сухое молоко Low heat 6.37 34% 6.25 39.8 CGMP продукт, обогащенный сиаловой кислотой 214 54.93% 1.11 237.54 Итого     14.17 434.12

В том случае, если CGMP порошок, обогащенный сиаловой кислотой, используется в двойном количестве, как описано выше, при расходе обезжиренного сухого молока содержание сиаловой кислоты в молочной смеси может увеличиваться до уровня, представленного в Таблице 13.

Таблица 13 Содержание сиаловой кислоты в молочной смеси, белковый состав которой обеспечивается традиционными источниками, а также новым CGMP продуктом, обогащенным сиаловой кислотой Источник белка Сиаловая кислота, мг/белок, г Процент белка Белок, г/л Сиаловая кислота, мг/л Концентрат белков сыворотки 23 35% 6.82 156.77 Обезжиренное сухое молоко Low heat 6.37 34% 5.14 32.74 CGMP продукт, обогащенный сиаловой кислотой 214 54.93% 2.22 475.08 Итого     14.18 664.59

ПРИМЕР 7

В данном примере иллюстрируется эффективность диеты, включающей гликомакропептид казеина, в отношении улучшения процессов обучения и памяти у поросят.

Методы

Животные

В течение 20 месяцев из промышленного свинарника отбирают домашних поросят мужского пола в возрасте 3-х дней (Sus scrofa) весом от 1.5 до 2.4 кг от 14 различных пометов. Животных распределяют по весу и случайным образом разделяют на 4 группы для различной терапии. Поросят содержат парами, согласно выбранной диете, в проволочных загонах с бетонным полом в комнате с регулируемой температурой. В каждой описанной комнате имеется "гнездо" (резиновая шина, покрытая полотенцем), лампа нагрева и идентичные пластиковые игрушки. Поросят обучают пользоваться дальним углом загона в качестве туалета, загоны чистят ежедневно. Организуют следующий световой цикл: 12 ч свет (8 am - 8 pm)/темнота (8 pm - 8 am).

CGMP поддержка

Гликомакропептид казеина (CGMP) с содержанием сиаловой кислоты 60 мг/г предоставляется компанией Tatua Dairy Cooperative (Morrinsville, New Zealand) и добавляется в заменитель свиного молока в специфическом количестве по Woombaroo Food Products (Glen Osmond, Australia). Количество сиаловой кислоты в итоговой молочной смеси варьирует в зависимости от группы: 77 мг/л (группа 1, контрольная группа получает смесь без добавления CGMP), 250 мг/л (группа 2, низкая доза), 600 мг/л (группа 3, средняя доза) и 842 мг/л (группа 4, высокая доза). Указанные концентрации соответствуют получению 25, 71, 171 и 240 мг сиаловой кислоты на кг массы тела. Заменители составляют таким образом, чтобы общее поступление белка оставалось таким же, независимо от количество добавляемого CGMP. Для поддержания нормальных показателей роста поросята получали 285 мл молока на кг массы тела в первые 2 недели исследования и 230 мл на кг массы тела в течение оставшихся недель. Кормление осуществляют в 8:00, 13:00, 18:00 и 23:00, дополнительно ночью дают 50 мл молока. Массу тела, потребление молока и медикаментов регистрируют ежедневно.

Оценка способности к обучению и запоминанию

Формальное тестирование способности к обучению начинают с 23-дневного возраста поросят при помощи лабиринта с радиальным расположением 8 отсеков (ФИГ.1 и ФИГ.2). Лабиринт представляет собой специально сконструированную деревянную конструкцию, расположенную в обучающем секторе (4.2 м × 4.4 м), соединенном с домашними загонами. Для того чтобы уменьшить стресс, парам поросят разрешают изучить лабиринт за день до начала формального исследования. Осуществляют два теста на обучение: задание 1 и задание 2. Для каждого задания в один отсек лабиринта помещают доступное молоко, а в остальные 7 - недоступное молоко, таким образом, что из всех 8 отсеков лабиринта исходит одинаковый обонятельный сигнал. Для каждого задания на дверь отсека, содержащего доступное молоко, помещают визуальный сигнал, состоящий из 3-х точек (ФИГ.3). В первом задании (легкое задание) одну черную точку помещают на двери остальных семи отсеков. Во втором задании (более сложное задание) на оставшиеся 7 дверей помещают две черные точки.

Всех поросят тестируют в лабиринте индивидуально. Сорок экспериментов задания 1 осуществляют в течение 5 дней (8 экспериментов в день) и 40 экспериментов задания 2 осуществляют в течение 6 дней. Оценку скорости обучения определяют, подсчитывая количество повторений, которое потребовалось для того, чтобы успешно выучить визуальный сигнал, и количество ошибок (неправильная дверь) и удачных попыток (правильная дверь) найти доступное молоко в каждом эксперименте. Ошибкой считается каждый случай, когда поросенок входит в неправильную дверь или просто просовывает голову через неправильную дверь. Успешным выполнением задания считается, когда поросенок входит через правильную дверь и находит доступное молоко. Критерием выучивания визуального сигнала считается максимум одна ошибка в трех последовательных экспериментах. Через два дня после завершение экспериментов по заданию 1 и 2 осуществляют аналогичные задания или "тест памяти", но для каждого задания осуществляют только один эксперимент. Все тесты оценивают 2 группы исследователей, осведомленные о количестве потребляемой сиаловой кислоты, однако результаты тестов затем позднее подтверждают независимым анализом видеоматериала.

Оценка стресса

Поскольку стресс может оказывать влияние на обучение или память, измеряют уровень кортизола в крови с утра, с недельными интервалами, начиная с 7-го дня при помощи коммерчески доступного набора (Coat-A-Count Cortisol, Diagnostic Products, Doncaster, Australia). Вариации между экспериментами и во время экспериментов составляли 9% и 12% соответственно.

Анализ количества связанной с ганглиозидами и белками сиаловой кислоты

На 34 и 35 день поросят умерщвляют при помощи инъекции пентотала натрия (50 мг/кг). Ткань головного мозга из фронтальной коры собирают и хранят при -80° до момента анализа. Количество сиаловой кислоты, связанной с ганглиозидами и с белками, определяют отдельно при помощи известных из литературы способов (см. Mahal, Id). Все образцы анализируют дважды, конечную концентрацию сиаловой кислоты в каждой фракции выражают в мкг/г свежей ткани.

Статистический анализ

Разницу в скорости обучения (количество экспериментов, которое потребовалось для выучивания визуального сигнала) сравнивают при помощи анализа долговечности Каплана-Мейера с регрессией Кокса для изучения возможных ковариаций, которые могут влиять на скорость обучения. Сравнение средних показателей (без ковариаций и с ними) осуществляют при помощи общей линейной модели (одномерная ANOVA). Корреляцию Пирсона используют для изучения взаимосвязи между количеством ошибок, успешных попыток, массой тела и показателями памяти. Весь статистический анализ завершают при помощи программы SPSS для Windows 11 Inc, Chicago. Устанавливают уровень достоверности 0.05.

Результаты

Скорость обучения

Как в легком, так и в сложном задании, группы поросят, получавшие диету, обогащенную сиаловой кислотой, выучивали визуальный сигнал быстрее, чем поросята из контрольной группы (Каплан-Мейер, Р=0.0014 в задании 1 и Р=0.0177 в задании 2, см. ФИГ.4 и ФИГ.5). В задании 1 только 45% поросят из контрольной группы достигли результатов в 40 экспериментах, в то время как лучшие показатели обучения были зарегистрированы для группы 2 (100% поросят выучили сигнал за 40 экспериментов), затем для группы 4 (80%) и группы 3 (70%). В задании 2 была выявлена связь между дозой и ответом (Р=0.0177), при этом поросята из всех 4 групп достигли результатов за 30 экспериментов. Различия между группами по-прежнему оставались существенными, при изучении различий массы тела во время исследования (Р<0.05).

Ковариации обучения

По-видимому, поросята использовали информацию, полученную во время задания 1, для запоминания визуального сигнала в задании 2. Поэтому исследователи использовали общее количество ошибок и успешных попыток в задании 1 в качестве ковариаций для анализа скорости обучения в задании 2. Различия между группами после поправки оставались достаточно высокими (Р=0.002 ошибки как ковариаций & 0.004 успешных попыток как ковариаций), а вот дозозависимый эффект скорости обучения в задании 2 не менялся. Результаты считались аналогичными, если учитывались все 40 экспериментов в задании 1 или только последние 20 экспериментов. Количество ошибок в экспериментах 21-40 задания 1 также значительно варьировало между группами. Это был случай с использованием или без использования ошибок в экспериментах 1-10 в качестве ковариаций (Р=0.016). Контрольная группа сделала значительное большее количество ошибок, чем группа 2 (Р=0.005) и группа 4 (Р=0.006), но незначительно больше, чем группа 3 (Р=0.06). В аналогичном анализе для задания 2 ковариация была значительной, однако показатели групп существенно не отличались (с ковариацией или без нее) (Р>0.05) (ФИГ.6). Аналогичный анализ с использованием общего количества ошибок во всех экспериментах выявил существенные различия между экспериментальными группами (объединенные группы 2, 3 и 4) и контрольной группой (Р=0.009) и незначительные различия между группами в задании 2 (р=0.048).

Тест на память

У поросят, которые оказались способными пройти тест на обучение, изучают способность к запоминанию визуального сигнала через 48 часов. Общие различия между группами оказались статистически значимыми для задания 2 (Р=0.036), но не для задания 1 (Р=0.165, ФИГ.7 (А)).

Дозозависимый эффект не наблюдался ни в одном из заданий. Во 2 задании показатели группы 3 и контрольной группы были приблизительно эквивалентны (ФИГ.7 (В)). При объединении результатов групп 2, 3 и 4 (экспериментальных групп) количество ошибок составляло менее 35% (среднее=1.5) по сравнению с контрольной группой (среднее=2.4, р=0.036).

Неудивительно, что количество ошибок и успешных выполнений теста во время периода обучения значительно влияет на процесс запоминания у всех поросят. Таким образом, если в период обучения было сделано большое количество ошибок, можно предположить, что в тесте на память также будет много ошибок (Р=0.03 в задании 1 и Р=0.029 в задании 2, двусторонние корреляции Спирмана). Аналогично, большое количество правильно выполненных экспериментов во время первого задания ассоциируется с небольшим количеством ошибок в тесте на память в задании 1 (Р=0.007), но не в задании 2 (Р=0.20). Масса тела, прирост массы тела и скорость обучения не оказывали существенного влияния на выполнение теста на память (Р>0.05).

Уровень кортизола в плазме

Средняя концентрация кортизола в каждой группе в течение 5-ти недель исследования представлена на ФИГ.8 (А). Во всех группах различия концентрации на первой неделе и в течение остальных недель оказались существенными (неделя 1 vs 2, 3, 4 и 5 недель; Р=0.031, 0.015, 0.001 и 0.001 соответственно). Начиная со 2 недели и далее концентрация кортизола в сыворотке у всех поросят в среднем понижалась, но незначительно (Р>0.05). Когда все экспериментальные группы объединили в одну группу, то различия между экспериментальными группами и контрольной группой оказались несущественными (Р>0.05, ФИГ.8 (В)). На 2-й неделе различия между группой 2 и группой 3 были существенными (Р=0.044). В том случае, когда концентрацию кортизола используют как ковариацию во время обучения, существенные различия не наблюдаются (Р>0.05).

Концентрация сиаловой кислоты в головном мозге

Большая часть сиаловой кислоты во фронтальной коре головного мозга поросят (86%) была связана с ганглиозидами, небольшая фракция (~13%) была связана с гликопротеином, еще меньшая часть (2%) находилась в свободной форме. Эти данные соответствуют предварительно опубликованным данным Brunngraber, E.G. et al., Brain Res., 38:151-162 (1972) и Mahal, L.K. et al., in J. Biolo. Chem., 277:9255-9261 (2002). Была выявлена существенная дозозависимая взаимосвязь между содержанием связанной с белком сиаловой кислоты в головном мозге и количеством CGMP в диете, например, для группы 4 был отмечен наибольший уровень, затем располагались группы 3, 2 и 1. Уровень в группе 1 был существенно меньше, чем в группе 4 (Р=0.001) и группе 3 (Р=0.001), но не в группе 2 (Р=0.126). В среднем, содержание связанной с белком сиаловой кислоты в сером веществе было на 6-10% выше в группах, получавших CGMP, чем в контрольной группе (Р=0.000, Таблица 14).

Таблица 14 Средний уровень сиаловой кислоты, связанной с ганглиозидами, сиаловой кислоты, связанной с белком, и свободной сиаловой кислоты во фронтальной коре головного мозга, в зависимости от количества вводимого CGMP Группа n^a Связанная с ганглиозидом SA (мкг/г) Связанная с белком SA (мкг/г) Свободная SA (мкг/г) Итого (мкг/г) среднее SE среднее SE среднее SE среднее SE Группа 1 14 162 9 114 2 3.0 0.2 279 10 Группа 2 13 176 9 121 2 3.1 0.2 300 10 Группа 3 14 182 9 126 2 3.0 0.2 311 10 Группа 4 12 185 10 127 2 3.2 0.2 315 10 Р величина   0.307 0.001 0.876 0.068 Заметки: а. "n" - количество поросят в группе

Средняя концентрация сиаловой кислоты, связанной с ганглиозидами, также зависела от дозы (на 13%, 11% и 8% выше в группе 4, в группе 3 и в группе 2 соответственно, vs контроль), однако различия не были статистически значимыми (Р=0.089, 0.124 и 0.299 соответственно, Таблица 14). Когда все группы, получавшие CGMP, объединяют в одну группу, различия между экспериментальными группами и контрольной группой оказались незначительными (Р=0.07, ФИГ.9). Вариации между индивидуальными показателями сиаловой кислоты, связанной с ганглиозидами, были выше, чем вариации сиаловой кислоты, связанной с белками (CV=~5% для связанной с ганглиозидами vs 2% для связанной с белками сиаловой кислоты). Такой же феномен был получен в исследовании головного мозга детей человека, проведенном Mahal, L.K., Id.

Общая концентрация сиаловой кислоты (связанной с ганглиозидами + связанной с белками) была незначительно выше в объединенной экспериментальной группе, получавшей CGMP, чем в контрольной группе (Р=0.051), но не концентрация свободной сиаловой кислоты (Р=0.58, ФИГ.9).

Корреляция между концентрацией сиаловой кислоты в головном мозге и обучаемостью

Высокая концентрация сиаловой кислоты, связанной с ганглиозидами, сиаловой кислоты, связанной с белками, и общей сиаловой кислоты ассоциируется с более быстрым обучением в обоих заданиях 1 и 2 (см. ФИГ.10 (А), ФИГ.10 (В), ФИГ.11 (А) и ФИГ.11 (В)).

Ни одна из корреляций, параметрическая или непараметрическая, не достигала статистической значимости (см. ФИГ.10 и ФИГ.11). В аналогичном анализе теста на память негативная корреляция (высокое содержание сиаловой кислоты, небольшое число ошибок) определялась в обоих заданиях 1 и 2, однако результаты снова не достигали статистической значимости (Р>0.05), за исключением связанной с белком сиаловой кислоты в группе 4 для задания 1 (Р=0.045, ФИГ.12). Наблюдалась существенная положительная корреляция между общим количеством успешных результатов и концентрацией сиаловой кислоты, связанной с ганглиозидами, в задании 1 (Р=0.045), но не в задании 2 (Р 0.05).

Прирост массы тела

Средняя (±SE) начальная масса тела была одинаковой к каждой группе (2.1±0.04 кг), все животные набирали массу тела с одинаковыми темпами (ФИГ.13). Несмотря на то что контрольная группа весила незначительно больше, чем другие группы на момент окончания исследования, темпы прироста массы тела (г в день) среди групп существенно не различались (Р=0.503).

Все ссылки, приведенные в данном описании, в том числе на публикации, патенты, патентные заявки, отчеты, обзоры, рукописи, тезисы, брошюры, книги, сайты Интернета, журнальные статьи, периодические издания и т.д., включены в описание исключительно в качестве цитируемого материала. Обсуждение ссылок имеет целью просуммировать утверждения авторов указанных публикаций и здесь не делается каких-либо допущений по поводу их вхождения в уровень техники. Заявителю оставляют право оспорить точность и достоверность цитируемых источников информации.

Из приведенного выше описания очевидны преимущества, которые достигаются при использовании настоящего изобретения, а также преимущества получаемых результатов.

Раскрытые в описании и другие модификации и варианты настоящего изобретения могут быть осуществлены специалистом в данной области знаний без выхода за пределы объема изобретения, который отражен в формуле. Кроме того, должно быть понятно, что различные аспекты и воплощения изобретения могут быть частично или полностью изменены без изменения его сущности. Специалисту в данной области также ясно, что приведенное в данной заявке описание изобретения служит исключительно иллюстративным целям и ни в коей мере не ограничивает объема изобретения, сущность которого выражена в формуле. Таким образом, содержание и широта притязаний формулы изобретения не ограничивается описанием, которое характеризует предпочтительные воплощения изобретения.

Изобретение относится к области медицины, а именно для улучшения обучаемости и памяти у млекопитающих. Ребенку вводят молочную смесь, которая содержит гликомакропептид казеина в количестве, достаточном для обеспечения поступления в организм ребенка, по крайней мере, 100 мг/кг в день сиаловой кислоты. Способ расширяет арсенал средств для улучшения обучаемости и памяти ребенка. 10 з.п. ф-лы, 14 табл., 16 ил.

1. Способ улучшения обучаемости и/или памяти у человеческого ребенка, который включает введение ребенку молочной смеси, содержащей гликомакропептид казеина в количестве, достаточном для обеспечения поступления в организм ребенка, по крайней мере, 100 мг/кг в день сиаловой кислоты

2. Способ по п.1, при котором возраст ребенка составляет от 1 дня до 4 лет.

3. Способ по п.1, при котором ребенок представляет собой ребенка в неонатальном периоде развития.

4. Способ по п.1, при котором необходимость в улучшении обучаемости и/или памяти возникает, когда по меньшей мере часть пищевых потребностей ребенка удовлетворяются введением молочной смеси с содержанием сиаловой кислоты менее 100 мг на литр.

5. Способ по п.4, при котором большая часть белков композиции представлена белками сои или белками коровьего молока.

6. Способ по п.5, при котором, по крайней мере 75% (по весу) белков композиции представлено белками сои или белками коровьего молока.

7. Способ по п.5, при котором практически весь белковый состав композиции представлен белками сои или белками коровьего молока.

8. Способ по п.1, при котором молочная смесь является сбалансированной по питательным веществам и содержит белки, жиры и углеводы.

9. Способ по п.8, при котором белок выбран из группы, включающей белки коровьего молока, белки сои и их смесь.

10. Способ по п.1, при котором количество гликомакропептида казеина в молочной смеси достаточно для обеспечения поступления в организм ребенка, по крайней мере, 200 мг/кг в день сиаловой кислоты.

11. Способ по п.1, при котором общее содержание белка в молочной смеси составляет от 12 до 16 г на литр, при этом не более 40% по весу его обеспечивается гликомакропептидом казеина.