СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕРПЕСВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЛАЗ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано как для этиологической расшифровки воспалительных заболеваний глаз, вызванных герпесвирусами, так и в качестве критерия эффективности терапии заболевания.

В настоящее время известно несколько способов лабораторной диагностики офтальмогерпеса, суть которых состоит в определении антигена возбудителя в соскобе конъюнктивы (роговицы) больного глаза либо в лейкоцитарной взвеси методом флюоресцирующих антител (МФА, РИФ), а также методом иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA) установление титров антител (иммуноглобулинов M-IgM, иммуноглобулинов G-IgG) к антигенам герпесвирусов в сыворотке крови больных (Майчук Ю.Ф. Вирусные заболевания глаз. - М., 1981, - 272 с.). В последние годы широкое распространение получила полимеразно-цепная реакция (ПЦР), выявляющая ДНК вируса в исследуемом материале (соскоб конъюнктивы, лейкоцитарная взвесь).

Все вышеперечисленные способы лабораторной диагностики обладают рядом недостатков, в той или иной степени снижающих вероятность этиологической расшифровки герпесвирусных заболеваний глаз. Так, например, недостатком метода МФА (РИФ) является снижение диагностической ценности при переходе болезни в подострую стадию, при поражении заднего отдела глаза (в случае взятия на исследование соскоба с конъюнктивы), а также уже в первые дни этиотропной терапии. Кроме того, при исследовании МФА (РИФ) не исключен «человеческий фактор» с момента забора материала и до непосредственного заключения по результатам люминесцентного свечения в микроскопе.

ПЦР является высокоточным методом, разделяющим ВПГ на 1 и 2 типы, диагностически значим при определении ДНК герпесвируса, однако также не исключен ложноотрицательный результат на фоне этиотропной терапии.

Недостатком метода ИФА в сыворотке крови является низкая вероятность обнаружения IgM (около 30%), низкая диагностическая значимость IgG при офтальмогерпесе (Кричевская Г.И. Новости «Вектор-Бест». - 2004. - 2-3 с.). Вместе с тем, имеется указание, что метод ИФА, направленный на выявление антител в сыворотке крови, имеет диагностическое значение только при первичном герпесе, когда у больных удается установить нарастание титров антител (Майчук Ю.Ф. Вирусные заболевания глаз. - М., 1981, - 272 с.). Однако в связи с ростом иммунодефицитных состояний в популяции в последние годы на фоне нарастающих клинических проявлений герпеса у большинства пациентов нарастания уровня антител не наблюдается, особенно при офтальмопатологии, что требует поиска новых диагностических и прогностических критериев герпетического поражения органа зрения.

Задачей настоящего изобретения является оптимизация этиологической расшифровки офтальмогерпеса и оценка эффективности терапии заболевания.

Поставленная задача решается тем, что в лабораторной диагностике воспалительных заболеваний глаз, вызванных герпесвирусами (вирус простого герпеса-ВПГ, цитомегаловирус-ЦМВ) используют метод иммуноблотинга с исследованием слезной жидкости больного глаза пациента.

При постановке этого метода диагностики применяют набор EUROIMMUN Anti-CMV-WESTERNBLOT (Германия), основанный на определении антител класса IgG к высокоспецифичным (рр130, рр28), низкоспецифичным (р55, рр52, р38) и неспецифичным (р65) антигенам ЦМВ в сыворотке или плазме крови человека методом иммуноблотинга. Способ диагностики заключается в обеспечении качественного измерения in vitro человеческих антител класса IgG к антигенам ЦМВ в слезной жидкости, продуцируемой больным глазом пациента. Набор содержит тестовые стрипы, покрытые параллельными полосами, содержащими антигены, очищенные методом электрофореза. Иммуноблотовые стрипы инкубируют на первой стадии реакции с образцом слезной жидкости пациента. Образец считается положительным в том случае, если специфические антитела IgG (а также классов IgA, IgM) связываются с соответствующими антигенными полосами. Для обнаружения связанных антител проводят вторую инкубацию с использованием ферментного конъюгата (антитела к IgG человека, меченные щелочной фосфатазой), который способен вызывать развитие цветной реакции. Для оценки сигнала принимают во внимание положение и интенсивность окрашивания, так как отрицательные сыворотки давали слабое окрашивание индивидуальных полос. Используют набор EUROLINE-WB (Германия), заключающийся в определении антител (IgM, IgG) к антигенам ВПГ 1 типа и специфическому гликопротеину G-2 ВПГ 2 типа (gG-1, gB-2, gD-1, gD-2) в сыворотке или плазме крови человека. В качестве материала для исследования данным методом используют слезную жидкость больного глаза пациента. Данный тест Anti-HSV-l/HSV-2 EUROLINE-WB (IgM, IgG) обеспечивает количественное определение in vitro антител человека к ВПГ-1 и к специфическому гликопротеину G-2 ВПГ-2 и основан на методе Вестерн-блота (WESTERNBLOT). Набор содержит тестовые стрипы с электрофоретически разделенными экстрактами антигенов ВПГ-1 с мембранным чипом с гликопротеидом G-2, очищенным аффинной хроматографией. Стрипы блокируют и инкубируют на первой стадии реакции с образцом разведенной сыворотки или плазмы пациента. Образец считается положительным, если специфические антитела класса IgG (а также IgM, IgA) связываются с антигенами. Для обнаружения связанных антител проводят вторую инкубацию с использованием ферментного конъюгата (антитела к IgM человека, меченные щелочной фосфатазой), который способен вызывать развитие цветной реакции. Для оценки сигналов учитывают положение и интенсивность полос на окрашенном стрипе в сравнении с полосами на контрольном стрипе оценочного шаблона.

Обнаружение IgM, IgG к различным вышеперечисленным антигенам герпесвирусов (результат - «положительно», «резко-положительно») свидетельствует о наличии активности (реактивации) данного вида инфекции. Напротив, отсутствие антител к большинству антигенов данного вида инфекции свидетельствует о наличии инфицированности (ремиссии), что характерно для 95% и выше взрослого населения в России (Глинских Н.П. Герпесвирусы человека. / Н.П. Глинских // Неизвестная эпидемия: герпес. - Смоленск, - 1997. - С.32-57). Полное отсутствие антител к антигенам информирует об отсутствии данного вида герпесвирусной инфекции в организме обследуемого. Контроль эффективности противовирусной и иммуномодулирующей терапии методом иммуноблотинга заключается в изменении (отсутствии изменений) выработки антител к различным антигенам (например, от «положительно» до «резко-положительно» или от «положительно» до «отрицательно») при исследовании данным методом слезной жидкости в динамике.

Нами было отобрано 60 человек в возрасте от 18 до 47 лет с офтальмопатологией воспалительного генеза для проведения комплекса лабораторных исследований, одним из которых является метод иммуноблотинга в слезной жидкости. В анамнезе этих пациентов отмечались простудные заболевания (ОРЗ, грипп) до 4-5 раз в год, а также частый рецидивирующий лабиальный (орофациальный) герпес. В 28 случаях (28 глаз) отмечался рецидив настоящего заболевания. Все обследованные проходили осмотр смежных специалистов (оториноларинголога, стоматолога, фтизиатра, ревматолога) для исключения сопутствующей патологии. Пациенты были разделены на 6 групп (по 10 человек в каждой), выделенных на основании общепринятых клинических признаков заболевания при поражении переднего или заднего отделов глаза в соответствии с международной классификацией болезней МКБ-10 (см. табл.1).

Результаты лабораторных исследований различными методами, в том числе, методом иммуноблотинга в слезной жидкости во всех 6 группах представлены в таблице 2.

В процессе сравнения лабораторных методов диагностики получен недостоверный результат исследования соскоба конъюнктивы методами РИФ и ПЦР. В то же время очевидна разница (достоверный результат) между исследованиями РИФ и ПЦР в лейкоцитарной взвеси. Обнаружение IgM методом иммуноблотинга в слезной жидкости достоверно выше, чем методом ИФА в крови. Достоверной разницы при определении IgG этими же методами не получено. Методом ИФА крови получены титры IgG к ВПГ или ЦМВ: 1/3200, либо 1/6400. Методом иммуноблотинга в слезной жидкости выявили IgM и IgG к BnT(gG-l, gB-1, gD-1, gG-2) и ЦМВ (рр 130, рр 28 р 55, рр 52, р 38, р 65) в разных вариантах: «резко-положительно», «положительно», «отрицательно».

Данные, полученные методом иммуноблотинга при исследовании слезной жидкости, позволяют установить активацию ВПГ или ЦМВ (а также микст-инфекцию) вне зависимости от обнаружения таковых другими методами. Связь активности ВПГ и ЦМВ с воспалением в глазу установили на основании уменьшения (исчезновения) клинической симптоматики заболевания при подключении противовирусной и иммуномодулирующей терапии.

Во время противовирусной и иммуномодулирующей терапии проводились дополнительные исследования методом иммуноблотинга в слезной жидкости у пациентов (n=60) через 1, 3 и 6 месяцев. Через 1 месяц после начала лечения отмечалось увеличение синтеза антител к антигенам (переход результата от «положительно» к «резко-положительно»), или исчезновение антител к определенным антигенам («положительно» к «отрицательно»), что указывало на повышение сопротивляемости иммунной системы по отношению к герпесвирусной инфекции. В это же время отмечалась клиническая ремиссия заболевания глаз. Контрольные исследования через 3 месяца показали снижение синтеза антител к антигенам (от «резко-положительно» к «положительно» и от «положительно» к «отрицательно»). Это свидетельствовало о постепенной нормализации противовирусного иммунитета. Через 6 месяцев при стойкой клинической ремиссии заболевания отмечались результаты инфицированности герпесвирусами без признаков их активности: «положительно» к gG-1 или gB-1 (ВПГ) и к рр130, рр55 или рр65 (ЦМВ), к другим антигенам - «отрицательно».

Данный метод целесообразно применять лицам с различным уровнем поражения глаз предположительно герпесвирусной этиологии (ВПГ, ЦМВ) с целью установления первичной активности или рецидива герпинфекции определенного антигенного серотипа. Это позволяет применять адекватную терапию заболевания уже с момента первичного обследования методом иммуноблотинга в слезной жидкости.

Кроме того, забор исследуемого материала (слезная жидкость) не требует стерильных условий, как, например, при заборе крови и может быть собран непосредственно пациентом в домашних условиях. Исследование методом иммуноблотинга слезной жидкости с целью обнаружения активности ВПГ и (или) ЦМВ может применяться у пациентов с абсолютными и относительными противопоказаниями к забору крови из вены и при длительной местной терапии.

Применение данного метода для этиологической расшифровки с начала заболевания и на фоне лечения в динамике позволяет оценить адекватность этиотропной терапии, необходимость ее коррекции и длительность этапа лечения до достижения ремиссии заболевания (стадии инфицированночти).

Пример 1. Больной К., 27 лет. Диагноз: Фибринозно-пластический иридоциклит, рецидив правого глаза. РИФ в соскобе конъюнктивы к ВПГ (отрицательно), к ЦМВ (отрицательно). ИФА в сыворотке крови: l/6400-IgG к ВПГ, l/6400-IgG к ЦМВ, IgM в обоих случаях - отрицательно. При обследовании методом иммуноблотинга в слезной жидкости к ВПГ 1, 2 типа и ЦМВ обнаружена реактивация ВПГ 1 типа, отсутствие ВПГ 2 типа, завершающий этап активации ЦМВ. Назначена комплексная (местная и общая) противовирусная и иммуномодулирующая терапия, на фоне которой при клинической ремиссии заболевания в динамике исследования методом иммуноблотинга в слезной жидкости через 1,3 и 6 месяцев отмечалось усиление выработки антител к герпесвирусам, с дальнейшим переходом в стадию инфицированности (лабораторная ремиссия заболевания).

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторным методам исследования. Сущность способа диагностики герпесвирусных заболеваний глаз, заключается в том, что в слезной жидкости методом иммуноблотинга определяют наличие антител IgM и IgG к специфичным антигенам цитомегаловируса. Использование способа позволяет оптимизировать этиологическую расшифровку воспалительных заболеваний глаз. 2 табл.

Способ диагностики герпесвирусных заболеваний глаз в жидкой среде методом иммуноблотинга, отличающийся тем, что определяют наличие антител IgM и IgG к специфичным антигенам цитомегаловируса в слезной жидкости.