Способ оценки активности инфекции, вызванной вирусами герпеса 4, 5 и 6 типа у детей Российский патент 2017 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки активности смешанной герпесвирусной инфекции у детей.

Вирусные заболевания смешанной этиологии - одна из актуальных проблем современной клинической медицины. Инфицированность населения герпесвирусами (ГВ) очень высока и составляет от 65% до 90%. За последние 10-15 лет возросло число пациентов с рецидивирующими герпесвирусными инфекциями. Наличие микст-герпесвирусной инфекции способствует затяжному течению респираторных заболеваний, хронизации бронхолегочной и ЛОР-патологии, а также вовлечению в процесс других органов и систем.

Представители семейства Herpesviridae обладают способностью пожизненно персистировать в организме инфицированного человека. В настоящее время известно 8 клинически значимых типов вирусов из семейства Herpesviridae: вирусы простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ 1, 2), вирус 3 типа (ветряной оспы-опоясывающего герпеса), вирус 4 типа (Эпштейна-Барр, ВЭБ), вирус 5 типа (цитомегаловирус, ЦМВ), вирусы герпеса типов 6, 7 и 8.

ВЭБ-инфекция, или инфекционный мононуклеоз - заболевание, которое характеризуется выраженной интоксикацией с лихорадкой, лимфопролиферативным синдромом с поражением миндалин, лимфатических узлов, печени, селезенки и своеобразными изменениями состава крови. Вэб-инфекционный мононуклеоз относится к антропонозным инфекциям. Источником являются больные с клинически выраженными и стертыми формами болезни, здоровые вирусоносители. Инфицированность ВЭБ составляет около 90% населения. После первичного инфицирования ВЭБ, протекавшего в форме инфекционного мононуклеоза, в 15-25% случаев в дальнейшем отмечается хроническое или рецидивирующее течение инфекции.

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) - одна из оппортунистических инфекций герпесвирусной группы с максимальной иммунодепрессивной активностью, самая широко распространенная внутриутробная инфекция с вертикальной трансмиссией до 95%. При хроническом течении формирует полиорганность поражений, при латентном - синдром нарушения противоинфекционной защиты. Реактивация хронического процесса и активация латентного у детей раннего возраста приводят к развитию тяжелых генерализованных форм с летальным исходом, особенно на фоне интеркуррентных заболеваний. ЦМВИ является триггером, поддерживающим фактором и маркером иммунопатологических синдромов, формируя контингент иммунокомпрометированных «часто болеющих» амбулаторных пациентов, представляющих значительные трудности в лечебной работе педиатров.

Вирус герпеса человека 6-го типа (ВГ-6) является широко распространенным β-герпес-вирусом, который обладает широким клеточным тропизмом, способен к длительной персистенции в организме человека. Инфекция, вызываемая ВГ-6 типа, является антропонозом. По данным отечественных авторов, частота носительства антител к ВГ-6 у детей раннего возраста в РФ варьирует от 72 до 95%. На сегодняшний день считается, что инфицирование происходит преимущественно в раннем детском возрасте. После первичного заражения ребенка возможно несколько вариантов развития болезни: от классической Roseola infantum до недифференцируемого заболевания, сопровождающегося лихорадочным состоянием, раздражительностью, отитом, судорожными приступами, сыпью.

Для диагностики активности герпесвирусных инфекций (ГВИ) традиционно используется серологический метод иммуноферментного анализа (ИФА) венозной крови с определением титра IgM и IgG с индексом авидности (ИА) в динамике (Современные аспекты герпесвирусных инфекций. Эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика: методические рекомендации / Правительство Москвы, Департамент Здравоохранения; [сост. Каражас Н.В. и др.]. - М.: Спецкнига, 2012. - с. 113).

Недостатки метода: данный метод не является прямым и недостаточно чувствительный - он косвенный и результат определяется индивидуальной иммунореактивностью, а иммуноглобулины не являются вируснейтрализующими. Метод не позволяет оценить степень репликативной активности вирусов, не определены «пороговые» значения вирусной нагрузки, разграничивающие активную и латентную стадию инфекции.

Технический результат, достигаемый изобретением, заключается в объективности, чувствительности и неинвазивности.

Указанные задачи достигаются путем определения количества ДНК герпесвируса - вирусной нагрузки (ВН), в соскобе из эпителия ротоглотки методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) (тест-системы Реал Бест ДНК ВГЧ-6, Реал Бест ДНК ВЭБ, Реал Бест ДНК ЦМВ (Вектор-Бест, Россия).

Установлено разделяющее значение ВН, при превышении которого делают предположение об активном течении инфекции, что определяет дальнейшую врачебную тактику, направленную на уточнение патологического состояния лабораторными и клиническими методами.

Для построения математической модели активной/латентной ГВИ используют методику регрессионного анализа. Входной переменной является значение ВН, выраженное числом копий ДНК герпесвируса на 10⁵ эпителиальных клеток соскоба ротоглотки пациента, выходная переменная-активная/латентная ГВИ у пациента (да/нет).

Для ГВИ 4 типа (ВЭБ) получают линейное уравнение регрессии: y=-0,55+0,7x, где x - значение вирусной нагрузки. Подставив значение ВН, в уравнение регрессии p=1/1+е^-(0,55+0,7x), получают значение вероятности наличия активной ГВИ при данной ВН. Затем, при помощи рок-анализа определяют разделяющее значение - то значение ВН, при котором сумма чувствительности и специфичности для данного теста максимальна, и которая показывает, после какого значения вероятности один класс сменяется другим. Для ГВИ 4 типа оптимальный порог определяют ВН=1000 копий ДНК ВЭБ на 10⁵ эпителиальных клеток соскоба ротоглотки. Таким образом, при значениях ВН≤1000 копий ДНК ВЭБ на 10⁵ эпителиальных клеток определяют латентную стадию инфекции, а при значениях ВН≥1000 копий ДНК ВЭБ на 10⁵ эпителиальных клеток, определяют активную стадию инфекции.

Аналогичный расчет производят для ГВИ 5 и 6 типа. Получают линейное уравнение регрессии общее для 5-6 типа: y=-2,8+1,18х, подставив значение ВН, в уравнение регрессии p=1/1+е^{-(-2,8+1,18x)}, получают значение вероятности наличия активной ГВИ 5-6 типа, методом рок-анализа определяют разделяющее значение ВН=10000 копий ДНК ГВ 5-6 типа на 10⁵ эпителиальных клеток. При значениях ВН≤10000 копий ДНК ГВ 5-6 типа на 10⁵ эпителиальных клеток определяют латентную стадию инфекции, а при значениях ВН≥10000 копий ДНК ГВ 5-6 типа на 10⁵ эпителиальных клеток, определяют активную стадию инфекции.

Таким образом, значения вирусной нагрузки, разделяющие активную стадию инфекции от неактивной:

- для ГВ-инфекции, вызванной вирусом 4 типа (ВЭБ) - 1000 копий ДНК ВЭБ на 10⁵ эпителиальных клеток;

- для ГВ-инфекции, вызванной вирусом 5 типа (ЦМВ) - 10000 копий ДНК ЦМВ на 10⁵ эпителиальных клеток;

- для ГВ-инфекции, вызванной вирусом герпеса человека 6 типа - 10000 копий ДНК ГВ-6 на 10⁵ эпителиальных клеток.

ПРИМЕР 1.

Больной А., 2 года 5 мес. ДДОУ не посещает.

Диагноз: инфекционный мононуклеоз, вызванный ВЭБ, средней тяжести.

Ребенок от 1 родов в 42 недели гестации. На первом году жизни: в возрасте 2 месяцев - атонический дерматит; 3 эпизода ОРВИ с 1 месяца жизни длительностью более 10 дней. За 6 месяцев третьего года жизни - 2 эпизода ОРВИ без антибиотикотерапии.

При осмотре: гипертрофия небных миндалин II ст., очаги налета белого цвета с обеих сторон, гранулезный фарингит. Подчелюстные лимфоузлы пакетами 2*3 см, безболезненные, заднешейные до 2 см единичные. При риноскопии - выраженный отек с обеих сторон, скудное слизистое отделяемое. Дыхание при аускультации - везикулярное. Печень увеличена на 1 см.

ИФА: анти-ВЭБ IgM (кач) - обнаружены, анти-ВЭБ IgG - 15,8 ОЕд/мл, ИА - 29%. Заключение: низкоавидные IgG анти-ВЭБ в сочетании с наличием анти-ВЭБ IgM - острая фаза герпесвирусной инфекции 4 типа (ВЭБ).

ПЦР количественно в соскобе эпителия ротоглотки - 38000 копий ДНК ВЭБ на 10⁵ эпителиальных клеток. Заключение: вирусная нагрузка соответствует активной стадии герпесвирусной инфекции 4 типа (ВЭБ).

Лечение: интерферон альфа-2b150.000 ME ректальные суппозитории 2 раза в день 3 курса по 10 дней; Acyclovirum 0,2 по 1 таб. 5 раз в день в течение 5 дней; Clarithromycin 125/5 по 1 ч.л. 2 раза в день в течение 7 дней на фоне и оральной детоксикации и местной терапии - орошение миндалин спреем «Каметон» (Camphora + Chlorobutanolum + Oleum foliorum Eucalypti viminalis + Levomentholum) 3 раза в день 5 дней.

Через 1 месяц от начала терапии - положительный клинический эффект: тонзиллит купирован, подчелюстные лимфоузлы уменьшились в размере - пакетами до 1*2, заднешейные - единичные до 1 см, носовое дыхание восстановлено в полном объеме, печень - по краю реберной дуги.

Положительный лабораторный эффект: ПЦР количественно в соскобе из ротоглотки - 400 копий ДНК ВЭБ на 10⁵ эпителиальных клеток. Заключение: вирусная нагрузка соответствует неактивной стадии герпесвирусной инфекции 4 типа (ВЭБ).

Терапия закончена. Рекомендована профилактика ОРВИ препаратами топического действия (Lysocime + Pyridoxine). Контроль методом количественной ПЦР ДНК ВЭБ в соскобе из ротоглотки при интеркуррентных заболеваниях.

Пример 2.

Больной Д., 4 года. В возрасте 2 лет перенес инфекционный мононуклеоз. В возрасте 3 лет впервые выявлена нейтропения средней тяжести (до 500 кл/мл крови), легкая анемия.

В настоящее время жалобы на слабость, плохой аппетит, увеличение лимфоузлов, частую «простудную» заболеваемость

При осмотре: пониженное питание; увеличение подчелюстных, заднешейных лимфоузлов (до 2 см, безболезненные). Анемия легкой степени поставлена на основании: Hb - 100 г/л. Вторичная иммунная недостаточность (ВИН), субкомпенсированная смешанного типа, диагностирована на основании нейтропении с абсолютным числом нейтрофилов 580 кл/мл (менее 1000 кл/мл) и гипоиммуноглобулинемии - IgG 273 мг/дл (N - 350-1400).

ИФА: анти-ВЭБ IgM - отрицательно, анти-ВЭБ IgG - 106,3 ОЕд/мл, ИА - 87%. Заключение: хроническая инфекция, вызванная герпесвирусом 4 типа (ВЭБ), латентное течение.

Методом количественной ПЦР в соскобе из ротоглотки - 300 копий ДНК ВЭБ на 10⁵ эпителиальных клеток. Заключение: вирусная нагрузка соответствует неактивной стадии герпесвирусной инфекции 4 типа (ВЭБ).

Лечение: ректальные суппозитории Кипферона (иммуноглобулиновый комплексный препарат (КИП) - 0,2 г; интерферон альфа-2b человеческий, рекомбинантный - 500000 ME) по 1 свече в день 3 курса по 10 дней, затем Pidotimod по 7 мл, один раз в день в течение 45 дней.

Через 1 месяц от начала терапии - положительный клинический эффект: улучшился аппетит, прибавил в массе, уменьшились подчелюстные лимфоузлы, не болел. Положительный лабораторный эффект: повышение количества нейтрофилов до 1000 кл/мл и IgG до возрастной нормы (370 мг/дл).

ПРИМЕР 3.

Больная Д., 8 мес. Диагноз: хроническая ЦМВИ, реактивация, острая фаза, с поражением печени (гепатит с синдромом цитолиза). ВИН, субкомпенсированная, смешанного типа (нейтропения, гипоиммуноглобулинемия G). Анемия легкой степени.

Высокий перинатальный риск ВУИ (ЦМВ): угроза прерывания 1 беременности в сроке 14 и 26 недель гестации; высокий антителогенез к ЦМВ (IgG 1: 6400) на фоне ОРВИ в I триместре. Иктеричность с 1 суток до 1,5 месяцев. Максимальный уровень общего билирубина 243 мкмоль/л, прямой билирубин 56 мкмоль/л (более 10% от общего); АЛТ 98 Е/л (3 N), ACT 79 Е/м (2,5 N) с волнообразным снижением и повышением в динамике.

В настоящее время жалобы на плохой аппетит, диспепсию (запоры), недостаточную прибавку в массе.

При осмотре: пониженного питания; увеличение подчелюстных лимфоузлов (II порядка) и размеров печени (выступает на 3 см из-под края реберной дуги).

УЗИ - гепатоспленомегалия, реактивные изменения в печени.

Анемия легкой степени поставлена на основании: Hb - 100 г/л.

ВИН, субкомпенсированная смешанного типа, диагностирована на основании нейтропении с абсолютным числом нейтрофилов 980 кл/мл (менее 1000 кл/мл) и гипоиммуноглобулинемии - IgG 273 мг/дл (N - 350-1400).

В биохимическом анализе крови: АЛТ - 74 Е/л (N - 0-31), ACT - 60 Е/л (N - 0-32) при нормальном значении ГГТП - 28 Е/л (N - 8-61).

ИФА: анти-CMV IgM - отрицательно, анти-CMV IgG - 106,3 МЕ/л, ИА - 47%. Заключение: поздняя стадия острой фазы герпесвирусной инфекции 5 типа (ЦМВ).

ПЦР на ДНК ЦМВ количественно: в слюне 3000000 копий на 10⁵ эпителиальных клеток. Заключение: вирусная нагрузка соответствует активной стадии герпесвирусной инфекции 5 типа (ЦМВ).

Лечение: ректальные суппозитории Кипферона 500000 ME 1 раз в день 3 курса по 10 дней, ликопид 0,001 (1 таб.) 1 раз в день 10 дней 3 курса с цикличным чередованием, на фоне урсодезоксихолиевой кислоты (урсофальк) в дозе 15 мг/кг (135 мг однократно на ночь) и оральной детоксикации.

Через 3 месяца от начала терапии - положительный клинический эффект: улучшился аппетит, повысилась прибавка в массе, нормализовался размер печени и стул, уменьшились подчелюстные лимфоузлы.

Положительный лабораторный эффект: снижение до верхней границы нормы АЛТ - 31 Е/л, ACT - 32 Е/л. Повышение количества нейтрофилов до 1700 кл/мл и IgG до возрастной нормы (370 мг/дл). ПЦР на ДНК ЦМВ количественно в слюне 2700 копий на 10⁵ эпителиальных клеток. Заключение: вирусная нагрузка соответствует неактивной стадии герпесвирусной инфекции 5 типа (ЦМВ). Системная противовирусная терапия закончена. Рекомендован режим «антигенного щажения», контроль ПЦР на ДНК ЦМВ через 3 месяца, а также контроль АЛТ, ACT после интеркуррентных заболеваний.

ПРИМЕР 4.

Больной Е., 4,5 года. Посещает ДДОУ с 2,6 лет. Диагноз: хронический рецидивирующий аденоидит, тонзиллофарингит, ВИН, субкомпенсированная, смешанного типа (нейтропения, лимфоцитопения, гипоиммуноглобулинемия A, G).

Высокий перинатальный риск ВУИ (ЦМВ): 3 беременность у женщины 40 лет (1 выкидыш, 2 - замершая) с угрозой прерывания в сроке 12 и 22 недель; ОРВИ в сроке 24 недели при активации латентной ЦМВ-инфекции (ИА IgG к ЦМВ 12%).

На 1 году жизни 7 эпизодов ОРВИ, трижды с госпитализацией и антибиотикотерапией. Хронический аденоидит с двух лет с частыми обострениями. С момента начала коллективного воспитания ОРВИ ежемесячно с непрекращающимся насморком в интервалах.

На пятом году жизни, за последние 6 месяцев - 5 эпизодов ОРВИ. Индекс резистентности (ИР)=0,83 (низкий).

При осмотре: круги под глазами, носовое дыхание значительно затруднено, ночной «храп». Лимфоузлы подчелюстные и переднешейные II порядка. ГНМ III степени с умеренной гиперемией и отеком, гранулезный фарингит. Дыхание пуэрильное, проводные хрипы.

ВИН, субкомпенсированная, смешанного типа поставлена на основании клинической картины; нейтропении с абсолютным числом нейтрофилов 1380 кл/мл (менее 1500 кл/мл), лимфоцитопении (1900 клеток в мл); гипоиммуноглобулинемии А - 6,6 мг/дл (N - 21-291) и G - 210 мг/дл (N - 350-1400).

ИФА: анти-CMV IgM - отрицательно, анти-CMV IgG - 106,4 МЕ/л, ИА- 68%. Заключение: хроническая герпесвирусная инфекция 5 типа (ЦМВ), латентное течение. Лечение не требуется. ПЦР на ДНК ЦМВ количественно в слюне 1300 копий на 10⁵ эпителиальных клеток. Заключение: вирусная нагрузка соответствует неактивной стадии герпесвирусной инфекции 5 типа (ЦМВ).

Рекомендации: контроль ПЦР на ДНК ЦМВ через 3 месяца.

ПРИМЕР 5.

Больной А., 5 мес. Ребенок от 2 беременности, 2 родов, плановое кесарево сечение, вес при рождении 3178, рост 49, Апгар 8/9. Выписан на 5 сутки. На искусственном вскармливании. Период новорожденности без особенностей. Привит по календарю. В 4 месяца - гипохромная анемия, назначен Мальтофер. В 5 месяцев заболел остро, появилась температура до 39°C, снижение аппетита. Лихорадка и катаральные явления отмечались в течение 2 суток. На 3-й сутки болезни на фоне снижения температуры до 37,5°C и улучшения самочувствия одномоментно появилась сыпь на коже, розовая, мелкая, пятнисто-папулезная, без явного зуда.

При осмотре - кожные покровы бледно-розового цвета, чистые. Лимфатические узлы - мелкие, единичные: подчелюстные, заднешейные, подмышечные и паховые. Слизистая ротоглотки ярко гиперемирована, умеренное увеличение миндалин, наложений нет. При риноскопии - умеренный отек с обеих сторон. В легких пуэрильное дыхание, проводится во все отделы, хрипов нет. Живот мягкий, безболезненный. Печень и селезенка не увеличены. Стул и диурез не нарушены. Менингеальной и очаговой симптоматики нет.

Проведено обследование: клинический анализ крови: лейкоциты - 10⋅10*6, нейтрофилы - 3230 кл/мл, лимфоциты - 55%, моноциты - 7%, СОЭ - 20 мм/ч. Общий анализ мочи - норма.

Серологическое обследование: специфические антитела IgG к ВГЧ-6 не обнаружены. ДНК ВГЧ-6 обнаружена в соскобе слизистой ротоглотки в количестве 48000 копий ДНК ВГЧ-6 на 10⁵ эпителиальных клеток. Маркеры других герпесвирусных инфекций - не обнаружены. Заключение: вирусная нагрузка соответствует активной стадии герпесвирусной инфекции 6-типа.

Диагноз:Roseola infantum, вызванная вирусом герпеса человека 6 типа.

Получал лечение: интерферон альфа-2b 150.000 ME ректальные суппозитории 2 раза в день 3 курса по 10 дней

На 6 сутки наблюдения произошла полная элиминация экзантемы, без пигментации кожи. Температура тела нормализовалась. Сохранялась незначительная заложенность носа.

Через 1 мес от начала лечения - ПЦР количественно: в соскобе из ротоглотки ДНК ВГЧ-6 не обнаружена. Клинический эффект - положительный, ребенок здоров, жалоб нет.

ПРИМЕР 6.

Ребенок М., возраст 2 г. 6 мес. Направлен для обследования по поводу частых ОРВИ: 4 раза за последние 6 месяцев (дважды осложненных бронхитом и отитом с антибиотикотерапией), кашля и субфебрильной температуры в течение последних двух недель, Последнее заболевание 1 месяц назад сопровождалось увеличением затылочных и подчелюстных лимфоузлов. При осмотре: кожные покровы бледные, чистые; подчелюстные лимфоузлы 2 порядка множественные, заднешейные 1-2 порядка - единичные; гипертрофия миндалин 2 ст. При риноскопии - слизистая чистая, бледная. При аускультации дыхание везикулярное. Живот мягкий, безболезненный, стул 1 раз в день.

Серологические маркеры острых герпесвирусных инфекций не обнаружены: ИА IgG к ЦМВИ=61%, IgM к ЦМВ=0; ИА IgG к VCA ВЭБ=63%, IgM к ВЭБ=0; анти-ВГб IgG=0.

ПЦР-анализ соскоба ротоглотки на ДНК ГВ 4, 5, 6 типа: ДНК ВЭБ - не обнаружена, ДНК ЦМВ - не обнаружена, ДНК ВГ-6 типа - 3000 копий ДНК на 10⁵ эпителиальных клеток.

Заключение - значения вирусной нагрузки соответствуют неактивной стадии герпесвирусной инфекции 6 типа.

Положительный эффект данной методики - возможность объективной оценки герпесвирусной инфекции 4, 5 и 6 типа по показателям вирусной нагрузки, отражающим активность инфекционного процесса, с помощью неинвазивного экспресс-метода - количественной ПЦР со 100% специфичностью и высокой чувствительностью.

Изобретение используют в медицине, педиатрии, инфекционных болезнях и касается способа оценки активности инфекции, вызванной вирусами герпеса 4, 5, 6 типа у детей. Сущность способа: у детей с подозрением на герпесвирусную инфекцию (ГВИ) 4, 5, 6 типа определяют количество ДНК вируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в соскобе из эпителия ротоглотки и при количестве ДНК более 1000 копий на 10⁵ клеток для 4 типа ГВИ, и более 10000 копий на 10⁵ клеток для 5 и 6 типа ГВИ, определяют активную стадию инфекции. Изобретение обеспечивает объективную оценку герпесвирусной инфекции 4, 5, 6 типа по показателям вирусной нагрузки, отражающим активность инфекционного процесса с помощью неинвазивного экспресс-метода со 100%-ной специфичностью и высокой чувствительностью. 6 пр.

Способ оценки активности инфекции, вызванной вирусами герпеса 4, 5, 6 типа у детей с помощью лабораторной диагностики, отличающийся тем, что у ребенка с подозрением на герпесвирусную инфекцию (ГВИ) 4, 5, 6 типа определяют количество ДНК вируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в соскобе из эпителия ротоглотки, и, при количестве ДНК более 1000 копий на 10⁵ клеток для 4 типа ГВИ, и более 10000 копий на 10⁵ клеток для 5 и 6 типа ГВИ, определяют активную стадию инфекции.