ФЕРМЕНТИРОВАННОЕ МОЛОКО ИЛИ РАСТИТЕЛЬНЫЕ БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ РЕЦЕПТОРНЫЙ ЛИГАНД, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2010 года по МПК A61K35/20 A61P13/08 A61P15/10 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к композициям, содержащим рецепторные лиганды, полученные способом, включающим ферментацию пищевого материала, включающего животное молоко или растительные белки, в присутствии, по меньшей мере, одной молочнокислой бактерии с получением ферментированного пищевого материала, содержащего активные компоненты, способные воздействовать на специфические адренорецепторы и/или серотониновые рецепторы, и которые могут использоваться, например, для понижения и/или стабилизации частоты сердечных сокращений, лечения и/или облегчения эректильной дисфункции, и/или лечения и/или облегчения состояния при доброкачественной гипертрофии предстательной железы (ВРН) у млекопитающих.

Уровень техники

Некоторые исследования ясно подтверждают мнение о том, что низкая частота сердечных сокращений в состоянии покоя связана с увеличением продолжительности жизни. По совокупности результатов некоторых исследований показана сильная корреляция между высоким сердечным ритмом в состоянии покоя и повышением смертности. Двух-, трехкратное повышение смертности наблюдается у мужчин с частотой сердечных сокращений в состоянии покоя более 88 ударов в минуту (bpm) в сравнении с группой мужчин с частотой сердечных сокращений менее 65 bpm. Частота сердечных сокращений связана не только со смертностью от сердечно-сосудистых заболеваний, но, по-видимому, также связана со смертью от других причин, таких как заболевание раком. Более того, имеется гипотеза о том, что существует взаимосвязь между низкой частотой сердечных сокращений и средней продолжительностью жизни вообще (Zaza et al., 2001).

В настоящее время наиболее общая форма сердечно-сосудистых заболеваний в промышленно развитых странах представляет собой болезнь коронарной артерии (CAD) или ишемическую болезнь сердца (CHD), являющуюся лидирующей причиной сердечных приступов. CAD и CHD представляют собой «отвердевание» артерий на поверхности сердца, причем термин «отвердевание» относится к состоянию, приводящему к такому сужению и жесткости артерий, которое блокирует свободный ток крови.

Пониженная частота сердечных сокращений связана с лучшими последствиями, в особенности, с понижением опасности аритмий сердца. Повышенная частота сердечных сокращений отражает повышенный метаболизм и пониженный тонус блуждающего нерва, повышающие опасность возникновения ишемической болезни сердца. Кроме этого, повышенная частота сердечных сокращений ухудшает вентрикулярную функцию (Lombardi, F in Zaza et al., 2001). Таким образом, неудивительно, что имеются сообщения о том, что важным фактором риска, связанным с CAD или CHD, является высокая частота сердечных сокращений. CAD или CHD часто подвергают медикаментозному лечению. Такие лекарственные препараты относятся к следующим различным категориям:

1. Бета-блокаторы уменьшают объем работы сердца путем блокирования некоторых химических веществ и препятствия их связыванию с бета-рецепторами сердца.

2. Нитраты, непосредственно воздействующие на кровеносные сосуды, вызывающие их релаксацию и обеспечивающие больший доступ крови, обогащенной кислородом, к сердцу.

3. Блокаторы кальциевого канала, которые повышают кровоток через сердце и могут уменьшить объем его работы путем блокады ионов кальция и препятствия передачи сигналов кровеносным сосудам о сжатии или уплотнении.

4. Антитромбоциты (например, аспирин), которые ингибируют образование сгустков крови, понижая способность тромбоцитов (микроскопические частиц, обнаруженные в крови) к совместному связыванию и образованию кровяных сгустков.

Предотвращение высокого сердечного ритма на ранней стадии развития болезни может служить альтернативой медикаментозному лечению высокой частоты сердечных сокращений. Большое число биоактивных соединений пищевого происхождения в настоящее время рассматривается в качестве полезных средств или способствуют улучшению здоровья.

Известно, что молоко, ферментированное с помощью молочнокислых бактерий (LAB), может оказывать гипотензивный эффект за счет выделения пептидов из молочного казеина под действием протеолитической активности лактобактерий. Это явление описано в ЕР821968 (Calpis Food Industry), EP1016709 (Calpis Food Industry) и WO0132836 (Vallio Ltd.).

В статье Yamamoto et al. (1996) указывается, что молоко, ферментированное с помощью закваски, содержащей Lactobacillus helveticus и Saccharomyces cerevisiae, понижает систолическое и диастолическое давление крови и при этом не наблюдается изменений других показателей, включающих частоту пульса.

WO 0185984 (Davisco International Foods, Inc.) также относится к пептидам, обладающим гипотензивным действием (эффект понижения кровяного давления), которые представляют собой материал из ферментативного переваривания сывороточного молочного белка. Измеряли частоту сердечных сокращений и кровяное давление. Наблюдалось значительное снижение давления артериальной крови, и за исключением применения дозы в 75 мг/кг, при которой наблюдалось понижение сердечного ритма, не наблюдалось различия между дозами 30 и 10 мг/кг.

В статье Fugsland A., et al. (2002) аналогично результатам Yamamoto et al. (1996) отмечается, что пептиды ферментированного молока обладают гипотензивным действием. Однако во втором абзаце, на странице 3569 в колонке 1 отмечается в отношении тестированных образцов, что «влияние на частоту сердечных сокращений было незначительным в сравнении с действием неферментированного молока» (т.е. плацебо), что говорит о незначительном влиянии на частоту сердечных сокращений.

Результаты, представленные в работе Yamamoto et al. (1996) и статье Fuglsang (2002), а также в WO 185984, показывают, что несмотря на гипертензивные свойства продукта, ферментированного в присутствии лактобактерий, нет оснований полагать, что эти вещества обладают общим свойством понижать указанные свойства всегда.

Сущность изобретения

Проблема, решаемая настоящим изобретением, состоит в разработке альтернативной композиции, полезной для понижения частоты сердечных сокращений и/или облегчения и/или лечения доброкачественной гипертрофии предстательной железы (ВРН) и/или эректильной дисфункции.

Решение этой проблемы основано на том, что авторы изобретения неожиданно обнаружили, что в результате ферментации пищевого материала, предпочтительно молока, в присутствии лактобактерий (LAB) образуются активные компоненты, являющиеся лигандами некоторых специфических адренорецепторов, а также серотониновых рецепторов, и эти компоненты оказывают влияние на перечисленные выше заболевания и состояния.

Соответственно, первый аспект изобретения относится к использованию композиции, получаемой способом, включающим ферментацию пищевого материала, представляющего собой животное молоко или растительные белки, в присутствии, по меньшей мере, одной молочнокислой бактерии с образованием ферментированного пищевого материала, включающего, по меньшей мере, один компонент, являющийся лигандом адренергического или серотонинового рецептора, с целью производства продукта, предназначенного для уменьшения частоты сердечных сокращений у млекопитающих.

Другой интересный аспект относится к использованию материалов, описанных в первом аспекте изобретения, для лечения и/или предотвращения доброкачественной гипертрофии предстательной железы (ВРН) и/или эректильной дисфункции.

Согласно другому аспекту изобретение предусматривает ферментированный пищевой материал, обладающий способностью понижать частоту сердечных сокращений и/или используемый для предотвращения и/или лечения доброкачественной гипертрофии предстательной железы (ВРН) и/или эректильной дисфункции у млекопитающих, причем такой материал содержит, по меньшей мере, один компонент, являющийся лигандом адренергического или серотонинового рецептора, полученный ферментацией пищевого материала в присутствии, по меньшей мере, одного штамма молочнокислой бактерии. Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является пищевой материал, ферментированный в присутствии Lactobacillus helveticus CHCC5951 (DSM 14998) и/или Streptococcus thermophilus.

Часто утверждается, что пищевой материал, содержащий живые бактерии, обладает особенно полезными свойствами (т.е. является пробиотиком). Таким образом, еще один аспект изобретения предусматривает ферментированный пищевой материал, содержащий живые бактерии, обладающий способностью понижать частоту сердечных сокращений и/или который полезен для профилактики и/или лечения доброкачественной гипертрофии предстательной железы (ВРН) и/или эректильной дисфункции у млекопитающих. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения ферментированный пищевой продукт содержит живые бактериальные клетки штамма Lactobacillus helveticus DSM 14998 и/или Streptococcus thermophilus, или их мутантов.

Как можно видеть из результатов эксперимента по определению зависимости доза-эффект (Пример 2), возможна даже более сильная ответная реакция, если композиции содержат высокие концентрации соединений, понижающих частоту сердечных сокращений. Один из интересных аспектов изобретения предусматривает активные компоненты, изолированные от ферментированного пищевого материала.

Согласно другому аспекту изобретение относится к использованию ферментированного пищевого материала или компонента, являющегося лигандом альфа- или бета-семейства адренорецепторов и/или серотониновых рецепторов, выделенного из него, с целью производства лекарственного средства для лечения или ослабления симптомов заболевания коронарной артерии (CAD), или ишемической болезни сердца (CHD), таких как стенокардия, гипертония, атеросклероз, сердечный приступ, инфаркт миокарда, церебральный инфаркт и рестеноз после ангиопластики, аритмия, тахикардия, застойная сердечная недостаточность (CHF), регургитация клапана аорты, хроническая почечная недостаточность, дислипидемия, дислипопротенемия, и/или лечения, и/или облегчения симптомов доброкачественной гипертрофии предстательной железы (BPH) и/или эректильной дисфункции.

Определения

Перед подробным обсуждением вариантов осуществления изобретения приведено определение специальных терминов, связанных с основным аспектом изобретения.

Термин «для понижения частоты сердечных сокращений у млекопитающих» обозначает уменьшение частоты сердечных сокращений относительно частоты сердечных сокращений для приема описанной композиции. Перед испытанием на людях способность к уменьшению частоты сердечных сокращений должна быть установлена на животной модели. На одной из полезных животных моделей ферментированный продукт применяют на спонтанно гипертензивных крысах (SHR) с помощью желудочного зонда, и частоту сердечных сокращений находящихся в сознании крыс определяют в различные моменты времени через 24 часа после зондирования с помощью телеметрической аппаратуры. В качестве плацебо используют соответствующий неферментированный пищевой материал, такой как несквашенное молоко. Подробности эксперимента описаны в рабочем примере 1. Кроме этого, как показано в Примере 4, с целью оценки уменьшения частоты сердечных сокращений может использоваться модель на базе Wistar крыс с нормальным артериальным давлением.

В контексте изобретения термин «лиганд» рецептора используется для описания компонента, способного связываться с рецептором и действовать как стимулятор (агонист) или ингибитор (антагонист). В конечном итоге может происходить конкуренция с рецептором.

Термин «адренорецепторы», также известный как «адренергические рецепторы», относится к рецепторам на норадреналин и адреналин.

В контексте изобретения термин «серотониновый рецептор» относится к рецепторам серотонина, которые связываются с [³H]5-гидрокситриптамином, как описано у Peroutka (1979).

Термин «молочнокислые бактерии» обозначает группу граммположительных, каталаза-негативных, неподвижных, микроаэрофильных или анаэробных бактерий, ферментирующих сахар с образованием кислот, преимущественно включающих молочную кислоту, уксусную кислоту, муравьиную кислоту и пропионовую кислоту. Предпочтительные молочнокислые (лакто) бактерии представляют собой бактерии филиума Firmicutes, более предпочтительно - класса Bacilli, еще более предпочтительно - отряда Lactobacillales. Внутри такого отряда предпочтительные молочнокислые бактерии представляют собой бактерии семейства Lactobacillacea, более предпочтительно - рода Lactobacillus. Предпочтительный микроорганизм представляет собой штамм Lactobacillus helveticus. Дополнительные подробности, касающиеся таксономии, приведены в (Bergey's Manual of Systematic Bacteriollogy, Second Edition, Volume 1: The Archea and the Deeply Branching and Phototrophic Bacteria). Примерами наиболее полезных промышленных молочнокислых бактерий могут служить Lactococcus spp., Streptococcus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., and Propionibacterium spp. Кроме этого, продуцирующие молочную кислоту бактерии, принадлежащие к группе строго анаэробных бактерий, bifidobacteria, т.е. Bifidobacterium spp, часто используемые в качестве отдельной пищевой закваски или совместно с молочнокислыми бактериями, обычно включают в группу молочнокислых бактерий.

Представленные ниже варианты осуществления изобретения приведены исключительно в качестве примеров.

Раскрытие сущности изобретения

Пищевые материалы

Пищевые материалы должны содержать животные молочные белки или растительные белки.

Предпочтительные материалы содержат животные молочные белки, с перечисленными компонентами молочного белка, такие как цельное или обезжиренное молоко или молочный казеин. Наиболее предпочтительным материалом является молоко от коров (Bos Taurus).

Предпочтительный пищевой материал с растительными белками может представлять собой кукурузу, кукурузный белок, пшеницу, пшеничный белок, сою, обезжиренную сою или соевый белок.

Продукт содержит, по меньшей мере, один компонент, являющийся антагонистом адренорецептора или серотонинового рецептора, который может использоваться для уменьшения частоты сердечных сокращений и/или для лечения и/или облегчения симптомов доброкачественной гипертрофии предстательной железы (ВРН) и/или эректильной дисфункции.

В примерах 5 и 6 показано, что использование описанных молочнокислых бактерий обеспечивает непосредственно после ферментации полезное количество активных компонентов, являющихся лигандами специфических адренергических рецепторов или серотонинового рецептора.

Описаны многочисленные подтипы адренергических рецепторов. Они сгруппированы в три семейства рецепторов: бета-рецепторы (содержащие бета-1 и бета-2), альфа-1 рецепторы и альфа-2 рецепторы. Все они представляют собой рецепторы, соединенные с семипроходным G-белком, различным образом связанные с метаболизмом аденилат циклазы и фосфоиносистидазного вторичного мессенджера. Катехоламиновые гормоны и нейротрансмиттеры: норпинеферин (норадреналин) и эпинефрин (адреналин), являются обычными физиологическими агонистами адренергических рецепторов, и многие нормальные, а также дисфункциональные физиологические реакции, связанные с регуляцией сердечно-сосудистой системы, опосредованы через адренергические рецепторы.

Альфа-адренергические рецепторы являются важными медиаторами реакций симпатической нервной системы, в особенности тех, что связаны с сердечно-сосудистым гомеостазом, таких как сокращение артериолярной гладкой мышцы и сердечное сокращение, каждая из которых может привести к повышению кровяного давления и частоты сердечных сокращений. Бета-адренергические рецепторы играют важную роль в регуляции сердечно-сосудистой системы. Стимуляция сокращаемости сердца опосредовано через активацию бета-1 и бета-2 адренергических рецепторов, а повышенная частота сердечных сокращений индуцируется посредством бета-1 адренергических рецепторов. Следовательно, антагонисты таких рецепторов могут использоваться для уменьшения и стабилизации частоты сердечных сокращений.

Хотя считается, что антагонисты серотонинового рецептора оказывают разнообразное воздействие на центральную нервную систему, по-видимому, они также участвуют в регуляции сердечно-сосудистой системы. В результате проведения клинического исследования антагониста серотонинового рецептора, кетасерина, было установлено, что это вещество является эффективным антигипертензивным агентом. Однако антигипертензивный эффект не может быть приписан исключительно антагонистической активности кетасерина в отношении серотонинового рецептора, поскольку кетасерин может блокировать альфа-1 адренорецепторы (Borne, 1994).

Таким образом, один из вариантов осуществления изобретения относится к использованию композиции, включающей антагонисты рецепторов, выбранных из группы, включающей альфа-адренергические рецепторы, бета-адренергические рецепторы и серотониновые рецепторы, с целью получения продукта, предназначенного для уменьшения частоты сердечных сокращений у млекопитающих.

Из данных примеров 5 и 6 можно видеть, что в результате ферментации коровьего молока согласно изобретению образуются соединения, являющиеся лигандами (наиболее вероятно антагонистами) ряда альфа- и бета-адренорецепторов, включающего альфа₁А-, альфа₁В-, альфа_2А(h)-, альфа_2В(h)-, альфа_2C(h)-, бета₁(h)-, бета₂(h)- и бета₃(h)-адренергический рецептор и даже серотониновые рецепторы. Таким образом, один из вариантов осуществления изобретения представляет собой использование композиции, содержащей антагонисты рецептора, выбранного из группы, включающей альфа₁А-, альфа₁В-, альфа_2А(h)-, альфа_2В(h)-, альфа_2C(h)-, бета₁(h)-, бета₂(h)- и бета₃(h)-адренергический рецептор и серотониновые рецепторы. Наиболее предпочтительно использовать композицию, включающую антагонисты рецепторов, выбранных из группы, содержащей альфа_2А(h)-, альфа_2В(h)- и бета₂(h)-адренергический рецептор.

Хорошо известно, что сексуальная жизнь и деятельность являются важным фактором, определяющим качество жизни. Такие нарушения, как эректильная дисфункция (ED) и женская сексуальная дисфункция, приобретают все возрастающее значение в результате старения. Поскольку данная тема широко обсуждается в прессе, мужчины и женщины всех возрастов находятся в поисках руководства, которое способно улучшить их взаимоотношения и приобрести опыт, удовлетворяющий их сексуальную жизнь. Сексуальная дисфункция часто связана с такими нарушениями, как диабеты, гипертония, заболевание коронарной артерии, неврологические нарушения и депрессия. У некоторых пациентов сексуальная дисфункция может явиться симптомом таких нарушений. Кроме этого, ЕD часто связана с побочным действием многих лекарственных препаратов. Удивительно, что гормональная недостаточность служит причиной эректильной дисфункции реже, чем диабет или сосудистые заболевания. Сосудистые заболевания являются причиной примерно половины всех случаев ED у мужчин старше 50 лет. Сосудистые заболевания включают атеросклероз, заболевание периферических сосудов, инфаркт миокарда и артериальную гипертонию. Современные пероральные лекарственные средства, используемые для лечения эректильной дисфункции, включают селективные ферментные ингибиторы, такие как силденафил (силденафил цитрат, Viagra®), варденафил HCI (Levitra®), тадалафил (Cialis®) и йохимбин (Yohimbine®, Yocon®).

Блокада альфа-адренергических рецепторов с помощью фентоламина и аналогичных соединений увеличивает эффективность сосудорасширяющих средств в пещеристом теле полового члена (Kim, 2000). Альфа-2 адренорецепторные антагонисты использовались в течение века для лечения эректильной дисфункции с использованием селективных лекарственных средств, таких как йохимбин (Morales, 2000). Показано, что тимоксамин (моксисилит), обладающий конкурентным и относительно селективным блокирующим действием на альфа-1 адренорецепторы, обеспечивает эрекцию при внутрикавернозной инъекции (Brindley, 1986). Следовательно, оба антогониста альфа-1 и альфа-2 адренорецепторов могут использоваться при лечении эректильной дисфункции (импотенции).

Таким образом, один из вариантов осуществления изобретения представляет собой использование композиции, включающей антагонисты рецептора, выбранного из группы, включающей альфа-адренергические рецепторы, для производства продукта, предназначенного для лечения или профилактики эректильной дисфункции у млекопитающих. Сердечно-сосудистые заболевания составляют почти половину всех случае ED у мужчин старше 50 лет. Предполагается, что композиции, которые кроме антагонистов альфа-2 и альфа-2 адренорецепторов дополнительно включают антагонисты бета-адренорецепторов и даже антагонисты серотонинового рецептора, а также другие вещества, включающие гамма-масляную кислоту (GABA), окажутся полезными средствами для лечения ED. Следовательно, такой вариант осуществления изобретения представляет собой использование композиции, включающей антагонисты рецепторов, выбранных из группы, включающей альфа-адренергические, бета-адренергические и серотониновые рецепторы, для получения продукта, предназначенного для лечения или профилактики эректильной дисфункции. Рассматриваемый продукт может дополнительно содержать агонисты GABA рецепторов, такие как сама GABA. Доброкачественная гиперплазия предстательной железы (BPH) представляет собой традиционное заболевание стареющих мужчин. Это нарушение характеризуется изменением размера, состава и функций предстательной железы и приводит к закупорке мочевого пузыря и уретры у мужчин среднего и пожилого возраста. Тонус гладкой мышцы простаты, передающийся, главным образом, через альфа-1 адренорецепторы, по-видимому, является критическим фактором при клиническом проявлении симптомов ВРН. Как следствие, альфа-1 адренорецепторные антагонисты трансформируют терапию ВРН от хирургического до фармакологического вмешательства (Altwein, 1995; Barry and Roehrborn, 1997). Альфа-2- адренорецепторные антагонисты, по-видимому, также положительно влияют на ВРН.

Как показано в Примере 6, ряд антагонистов альфа-1 и альфа-2 адренорецепторов, включающих антагонисты альфа₁А-, альфа₁В-, альфа_2А(h)-, альфа_2В(h)- и альфа_2С(h)- адренорецепторов, образуются при ферментации пищевого материала согласно изобретению. Таким образом, важным вариантом осуществления изобретения является использование композиции, полученной ферментацией пищевого материала, которая содержит антагонисты одного или нескольких рецепторов, выбранных из группы, включающей альфа-адренергические рецепторы и бета-адренергические рецепторы, с целью получения продукта для лечения или профилактики доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ВРН) у млекопитающих.

Особенно важным вариантом осуществления изобретения является использование композиции, полученной ферментацией пищевого материала, содержащего антагонисты одного или нескольких рецепторов, выбранных из группы, включающей альфа₁А-, альфа₁В-, альфа_2А(h)-, альфа_2В(h)-, альфа_2C(h)-, бета₁(h)-, бета₂(h)- и бета₃(h)-адренергические рецепторы и серотониновые рецепторы. Особенно предпочтительный продукт содержит антагонисты альфа_2А(h)-, альфа_2В(h)- или бета₂(h)- адренергических рецепторов.

Предполагается, что высокая эффективность может быть достигнута, если композиция, полученная ферментацией пищевого материала, содержит больше антагонистов различных релевантных рецепторов, например, если ферментированный пищевой материал содержит, по меньшей мере, один компонент, являющийся лигандом адренергического рецептора, и, по меньшей мере, один компонент, являющийся лигандом серотонинового рецептора, или если ферментированный пищевой материал содержит, по меньшей мере, один компонент, являющийся лигандом адренергического альфа-рецептора, и, по меньшей мере, один компонент, являющийся лигандом адренергического бета-рецептора. Можно ожидать, что наиболее релевантным типом лигандов являются лиганды с характеристиками антагониста рассматриваемых рецепторов.

Из Примеров 2-5, особенно из Примера 6, можно видеть, что несмотря на установление зависимости доза-эффект даже неконцентрированный ферментат содержит антагонисты в количестве, приводящем к специфическому ингибированию специфических рецепторов, и поэтому может использоваться для профилактики, облегчения и/или лечения ВРН, и/или эректильной дисфункции, а также для уменьшения частоты сердечных сокращений у млекопитающих. Следовательно, для реализации положительного эффекта изобретения необязательно дополнительно очищать или дополнительно концентрировать лиганды из ферментированного пищевого материала. Согласно одному из вариантов ферментированный пищевой материал может непосредственно упаковываться и поступать на рынок в качестве пищевого продукта, предпочтительно функционального пищевого продукта, или пищевой добавки, например, в лиофилизированной форме.

Ферментированный молочный продукт согласно изобретению представляет собой любой известный или будущий ферментированный продукт, такой как сыр, йогурт и питьевой йогурт.

Следует иметь в виду, что продукт согласно изобретению может содержать живые микроорганизмы, обеспечивающие общий целебный эффект. Таким образом, рассматриваемый продукт может рекламироваться и продаваться как пробиотический продукт.

Пример 1 демонстрирует этот факт. Вкратце, результаты Примера 1 показывают, что ферментированное молоко, как таковое, без какой-либо дополнительной обработки обладает хорошим эффектом, касающимся уменьшения частоты сердечных сокращений. Кроме этого, лиофилизированное ферментированное молоко может быть суспендировано в нейтральном молоке, в результате чего образуется подходящий пищевой продукт, обладающий эффектом согласно изобретению. Таким образом, лиофилизированное ферментированное молоко может рассматриваться как подходящая пищевая добавка.

Из Примера 5 следует, что активные компоненты ферментированного молочного продукта и сывороточной фракции связываются с адренорецепторами. Соответственно, предполагается, что продукт согласно изобретению может использоваться для профилактики, облегчения симптомов и /или лечения заболеваний и болезненных состояний, в развитии которых участвует рассматриваемый специфический рецептор. Такие заболевания и состояния, без конкретных ограничений, включают сердечные заболевания, ВРН и эректильные дисфункции.

Более того, поскольку активный компонент согласно изобретению представляет собой антагонистический лиганд некоторых альфа-адренорецепторов, бета-адренорецепторов и даже серотониновых рецепторов, открываются возможности совместного применения продукта согласно изобретению с лекарственными препаратами, соединениями, лигандами и т.п. с аналогичными эффектами, реализующимися по другому механизму. Если говорить о таких дополнительных соединениях, снижающих частоту сердечных сокращений, то эти соединения включают гамма-масляную кислоту, сокращенно обозначаемую как GABA. GABA продуцируется в результате декарбоксилирования глютамата (Glu) под действием декарбоксилазы (GAD; EC 4.1.1.15), при этом пиридоксалфосфат выполняет функцию кофактора. Сообщается о том, что микроорганизмы, в частности молочнокислые бактерии, такие как Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Bifidobacterium sp. и Streptococcus sp, обладают декарбоксилазной активностью в отношении глутаминовой кислоты и продуцируют из GABA.

GABA вызывает интерес в течение многих лет, что связано с ее целебным действием. Эта молекула представляет собой один из основных ингибиторных нейротрансмиттеров центральной нервной системы. Рассматриваемое вещество обнаружено в головном и спинном мозге млекопитающих и, естественно, широко распространено в нейронах коры головного мозга, внося существенный вклад в регуляцию моторики, зрение и многие другие кортикальные функции. Это вещество способствует кровотоку в головной мозг, что увеличивает подачу кислорода и усиливает мозговой обмен веществ. Кроме этого, GABA ингибирует секрецию вазопрессина (антидиуретического гормона) и в результате своего сосудорасширяющего действия уменьшает кровяное давление, а также снижает давление крови воздействием на вазомоторный центр спинного мозга.

Функционирование GABA осуществляется через рецепторы GABA-А и GABA-В.

Предполагается, что любой компонент, являющийся агонистом GABA-А и/или GABA-В рецепторов (например, самой GABA), или любой другой компонент, способствующий повышенному выделению GABA в организме человека, может быть включен в продукт, например в ферментированный молочный продукт, согласно изобретению.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения содержание GABA в ферментированном пищевом или кормовом продукте обеспечивается введением GABA-продуцирующих микроорганизмов в среду микроорганизмов, используемую для осуществления ферментации. Согласно особенно предпочтительному варианту в микросреду вводят GABA-продуцирующий Streptococcus thermophilis.

Используемый в тексте термин «функциональная пища» обозначает пищевой продукт, причем потребитель в какой-то степени проинформирован с его полезной функцией, касающейся упомянутых выше заболеваний или состояний.

Таким образом, вариант осуществления изобретения относится к описанному выше применению, в котором композиция представляет собой пищевой продукт, содержащий активные компоненты, с описанными выше свойствами, который получают способом, включающим следующие стадии:

(i) приготовление ферментированного пищевого материала согласно способу получения активных компонентов с описанными в тексте свойствами,

(ii) сушку ферментированного пищевого материала и

(iii) упаковку полученного материала подходящим способом с получением пищевого продукта или пищевой добавки.

Стадия (iii) предпочтительно представляет собой лиофилизацию.

Термин «упаковка» следует понимать в широком смысле. Он обозначает, что после ферментации пищевого материала и получения ферментированного пищевого материала последний должен быть расфасован с целью его доставки к потребителю. Продукт может быть расфасован в бутыли, упаковки типа тетра-пак и т.п. Предпочтительно, чтобы на упаковке или соответствующем торговом материале было указано, что продукт обладает свойствами, понижающими частоту сердечных сокращений. То же самое относится к любым аспектам или воплощениям описанного выше продукта.

Как показано в Примере 1, молочнокислые бактерии в пищевом продукте могут присутствовать в виде клеток бактерий. Термообработанный ферментированный пищевой материал также обладает способностью понижать частоту сердечных сокращений, следовательно, можно ожидать, что те же эффекты будут проявлять клетки лактобактерий.

Согласно предпочтительным вариантам ферментированный пищевой продукт содержит живые бактериальные клетки, оказывающие полезное целебное действие на хозяина-млекопитающего. Такие микроорганизмы часто называют пробиотиками.

В общем смысле пробиотики составляют класс микроорганизмов, определяемый как живые микробные организмы, оказывающие целебное воздействие на хозяев, животных или людей. Лактобактерии обычно распознаются как микроорганизмы, которые можно использовать в качестве пробиотиков, или как пробиотически активные организмы, в особенности, молочнокислые бактерии, выбранные из Lactobacillus, Streptococci and Bifidobacterium sp (Fuller (1989)).

Применение продукта с вышеописанными свойствами

Как проиллюстрировано в Примере 1, свойства, обеспечивающие уменьшение частоты сердечных сокращений, могут быть установлены чреззондовым применением продукта на спонтанно гипертензивных крысах (SHR) и определением с помощью телеметрической аппаратуры частоты сердечных сокращений находящихся в сознании крыс в различные моменты времени в течение 24 часов после применения. Однако для оценки эффективности влияния ферментированного продукта на частоту сердечных сокращений могут использоваться и другие животные модели. Одним из примеров таких моделей могут служить крысы Wistar с нормальным кровяным давлением, описанные в Примере 4.

Рассматриваемый продукт может использоваться для лечения заболеваний коронарной артерии (CAD) или коронарных заболеваний сердца (CHD), таких как стенокардия, гипертония, атеросклероз, сердечные приступы, инфаркт миокарда, внутримозговой инфаркт, а также рестеноз после ангиопластики, аритмия, тахиаритмия, застойная сердечная недостаточность, регургитация клапана аорты, хроническая почечная недостаточность, дислипидемия, дислипопротеинемия. В таких случаях рассматриваемый продукт предпочтительно представляет собой медикамент. Предпочтительными заболеваниями в этих случаях являются стенокардия, гипертония и атеросклероз.

Помимо уже отмеченных состояний представляет интерес исход сердечных флуктуаций. В Примерах 1, 2 и 3 показано, что ферментированный продукт эффективно уменьшает частоту сердечных сокращений и неожиданно уменьшает флуктуации частоты сердечных сокращений в активном периоде экспериментальных животных. В отмеченных ситуациях, когда часто наблюдается значительная флуктуация частоты сердечных сокращений, уменьшение амплитуды флуктуаций сердечного ритма может оказаться важным фактором, поскольку изменения частоты сердечных сокращений коррелируют с показателем смертности в рамках экспериментальной модели (Zaza et al. 2001).

Поскольку заболевания коронарной артерии развиваются в течение длительного времени, имеются возможности их профилактики и контроля в течение жизни отдельного индивидуума. Поэтому другое предпочтительное использование продукта изобретения относится к мерам профилактики. В таких случаях продукт может представлять собой пищевой продукт или пищевую добавку, потребляемую ежедневно или постоянно.

Предпочтительный эффект от применения продукта, уменьшающего частоту сердечных сокращений, превышает эффект плацебо, по меньшей мере, на 10% в том случае, когда плацебо представляет собой соответствующий неферментированный пищевой материал. В рамках данного определения более предпочтительный продукт обеспечивает уменьшение частоты сердечных сокращений, по меньшей мере, на 15% выше эффекта плацебо, еще более предпочтительно, когда продукт уменьшает частоту сердечных сокращений на 20% больше, чем при использовании плацебо, и наиболее предпочтительно, когда эффект уменьшения частоты сердечных сокращений при применении продукта превышает эффект действия плацебо, по меньшей мере, на 25%.

Последующая очистка компонента, представляющего рецептор-лиганд от ферментированного пищевого материала

Как отмечалось выше, использование описанных лактобактерий обеспечивает непосредственно после ферментации полезное количество активных компонентов с очень хорошими свойствами, касающимися понижения частоты сердечных сокращений, и обладающих ожидаемым действием на другие ранее упомянутые состояния и заболевания.

Однако в определенных обстоятельствах предпочтительно проводить последующую очистку или концентрирование активных компонентов ферментированного пищевого материала. Так, например, такие операции необходимо проводить, когда активные компоненты предназначены для использования в качестве таких медикаментозных форм, как фармацевтические таблетки, или другие лекарственные формы, для которых необходима высокая концентрация активного компонента. Соответственно, согласно одному из вариантов осуществления изобретения продукт представляет собой медикамент.

Кроме этого, пример 1 иллюстрирует тот факт, что эффект понижения частоты сердечных сокращений пропорционален концентрации продукта.

Соответственно, один из вариантов осуществления изобретения относится к описанному выше применению, в котором ферментированный пищевой материал дополнительно обрабатывают таким способом, который обеспечивает очистку или концентрирование активных компонентов, представляющих собой лиганд альфа-адренорецепторов, бета-адренорецепторов или серотониновых рецепторов, получаемых способом, включающим следующие стадии:

(i) приготовление ферментированного пищевого материала согласно способу получения активных компонентов с описанными выше свойствами,

(ii) последующую обработку ферментированного пищевого материала со стадии (i) таким образом, чтобы очистить или концентрировать активные компоненты, обладающие свойством понижать частоту сердечных сокращений,

(iii) соответствующую упаковку с получением продукта.

Все описанное выше соответствует ситуации, когда желательно иметь относительно высокую концентрацию активных компонентов при желательных свойствах продукта.

Если рассматриваемый материал представляет собой пищевой продукт, способ может включать дополнительную стадию (iv), в ходе которой сверхконцентрированные активные компоненты со стадии (ii) добавляют в пищевой продукт.

Предпочтительный вариант осуществления концентрирования согласно стадии (ii) предусматривает центрифугирование ферментированного пищевого материала, содержащего активные компоненты, и выделение полученного супернатанта, включающего активные компоненты. Если пищевой материал представляет собой молоко, то такой продукт будет представлять собой сыворотку. Как следует из данных, представленных в Примере 1, сыворотка представляет собой продукт с отличной способностью к уменьшению частоты сердечных сокращений. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения продукт представляет собой сыворотку, хотя могут приниматься во внимание и другие фракции ферментированного пищевого или кормового материала.

Центрифугирование может проводиться со скоростью 2000-20000 об/мин в течение времени от 1 часа до двадцати минут. Для осуществления центрифугирования может использоваться центрифуга. Полученный супернатант может быть подвергнут дополнительной очистке с использованием обратимо-фазной смолы с целью получения образца с повышенным содержанием активных компонентов. Очистка с помощью обратимо-фазной смолы может осуществляться способом абсорбции и элюирования, и/или обратимо-фазной хроматографии, в результате чего повышается чистота активных ингредиентов.

Дополнительные технические подробности, связанные с использованием обратимо-фазной смолы, описаны в ЕР821968.

Дополнительная обработка ферментированного пищевого материала может проводиться методом нанофильтрации. Цель такой обработки заключается в удалении из ферментированного пищевого материала молочной кислоты или одновалентных ионов.

Дополнительные технические подробности, связанные с процессом нанофильтрации, приведены в WO01/32905.

Как указывается в Примере 2, наблюдается отчетливое дозазависимое действие сывороточных продуктов с коэффициентом концентрации 21 на частоту сердечных сокращений. Не имеется экспериментальных доказательств достижения стационарного или асимптотического уровня концентраций, что свидетельствует о том, что композиции, содержащие большие количества активных компонентов, могут использоваться в качестве медикаментов.

Ферментация

Согласно способу изобретения пищевой материал ферментируют с помощью лактобактерий при рабочих условиях, которые могут меняться в зависимости от типов пищевого материала и/или комбинации молочнокислых бактерий. Если пищевой материал не находится в виде раствора, то его предпочтительно растворять в подходящем водном растворителе, который затем смешивают лактобактериями и культивируют ферментацией.

Культивацию молочнокислых бактерий можно проводить добавлением предкультивированной культурной закваски из лактобактерий в среду пищевого материала, которая может подвергаться предварительной термостерилизации и охлаждению до определенной температуры с целью инкубации. Прививочное количество лактобактериальной закваски может составлять 10⁵-10⁷ клеток молочнокислых бактерий/мл среды, однако в зависимости от природы закваски могут применяться и другие количества. Инкубацию проводят при температуре 20-50°С, предпочтительно 30-45°С. Продолжительность инкубации обычно составляет 3-48 часов, предпочтительно 6-24 часа. Особенно предпочтительно проводить культивацию в среде с рН в интервале 3,5-7, более предпочтительно 5-6, что обеспечивает эффективную культивацию лактобактерий. Кроме этого, предпочтительно осуществлять так называемую «рН-stat» культивацию, поддерживая рН в интервале 4-7. Инкубация может быть прервана, когда число лактобактерий достигнет 10⁸ клеток/мл.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к описанному выше способу, в котором ферментацию пищевого материала проводят при условиях, продуцирующих 0,5-25 мг активных компонентов на 100 мл пищевого материала, более предпочтительно 1-5 мг активных компонентов на 100 мл пищевого материала.

Млекопитающие

Как отмечалось выше, термин «молочнокислая (лакто) бактерия» относится к группе граммположительных, каталаза-негативных, неподвижных, микроаэрофильных или анаэробных бактерий, ферментирующих сахар с образованием кислот, включающих молочную кислоту в качестве основного продукта, а также уксусную кислоту, муравьиную и пропионовую кислоту.

Рассматриваемый термин также включает разновидности молочнокислых бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus, таких как Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbruekii subsp. Bulgaricus и т.п., молочнокислых бактерий, принадлежащих к виду Lactococcus, таких как Lactococcus lactis, разновидности молочнокислых бактерий, принадлежащих к виду Streptococcus, таких как Streptococcus salivarius subsp. Thermophilus, разновидности молочнокислых бактерий, принадлежащих к виду Leuconostoc, таких как Leuconostoc lactis, разновидности молочнокислых бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium, таких как Bifidobacterium longum или Bifidobacterium breve, а также разновидности молочнокислых бактерий, принадлежащих к виду Pediococcus.

Молочнокислые бактерии могут использоваться в виде смеси с другими микроорганизмами, например дрожжами.

Многочисленные виды молочнокислых бактерий известны специалисту в данной области, и предполагается, что особенно полезные смеси включают комбинацию Lactobacillus helveticus и Streptococcus thermophilus. В этом отношении можно сослаться на Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ); а также на интернетовский браузер по таксономии NCBI [дата подачи заявки доступна по адресу http://www/.ncbi. nlm. gov/.].

Образец особенно предпочтительного Lactobacillus helveticus штамма СНСС5951 депонирован в DSMZ (Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH) под каталожным номером DSM 14998 с датой депонирования 15-го Мая 2002г. Депонирование произведено по условиям Будапештского договора о Международном признании депонирования микроорганизмов в целях патентования.

Соответственно, особенно предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к описанному выше применению, в котором используемая молочнокислая бактерия представляет собой Lactobacillus helveticus с регистрационным номером DSM 14998. Согласно еще одному интересному варианту, имеющему отношение к частоте сердечных сокращений, упомянутый выше штамм DSM 14998 используется совместно со штаммом Streptococcus thermophilus.

Кроме этого, образец штамма Lactobacillus helveticus СНСС4080 депонирован в DSMZ (Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH) под каталожным номером DSM 14997 и дате депонирования 15-го Мая 2002г. Депонирование произведено по условиям Будапештского договора о Международном признании депонирования микроорганизмов в целях патентования.

Подписи к чертежам:

Фигура 1. Измерение частоты сердечных сокращений у животных, получавших концентрацию 3 (сывороточная композиция, содержащая твердые сывороточные компоненты, с фактором концентрации 14,3) или плацебо. Каждая точка на графике представляет собой среднее значение для 8 животных. Период активности животных совпадал с периодом без освещения, т.е. периодом, отмеченным черными столбиками.

Фигура 2. Уменьшение частоты сердечных сокращений у животных за 12-15 часов после применения сывороточных композиций, содержащих твердые сывороточные компоненты, концентрированные в 2, 6, 14,2 и 21 раза относительно количества твердых компонентов в сыворотке, полученной после ферментации молока. Животные получали сывороточные продукты через зонд, т.е. питались через желудочный зонд. Символ (О) обозначает плацебо. Частоту сердечных сокращений у животных определяли по методике, описанной в Примере 1, и сравнивали с частотой сердечных сокращений у животных, не получавших лечения.

Примеры

Пример 1: In vivo тест на свойства, обеспечивающие уменьшение частоты сердечных сокращений

Материалы и методы

Штаммы и культивация

Штаммы штрихами наносили на MRS агар и подвергали анаэробной инкубации в течение 48 часов при 37°С. Отбирали одну колонию, которую инокулировали в MRS бульон, и выращивали в течение ночи при 37°С. Исходные культуры готовили из ночной культуры и хранили при -80°С в 20% глицерине. Штаммы подвергали предкультивации в молоке в течение ночи и инокулировали 1% (об./об.) в свежее молоко для последующей ферментации.

Приготовление образцов

Сыворотка: образец 1

Молоко (содержание белка 9,5%) ферментировали в присутствии штамма единичной культуры в течение 16 часов при уровне инокуляции 1% (об./об.). Ферментированный продукт центрифугировали, осадок после центрифугирования отбрасывали, сыворотку фильтровали через 0,45-мм фильтр и лиофилизировали. Вторую ферментационную среду, ферментированную в тех же условиях, что использовались для первой ферментации, центрифугировали и получали сывороточную фракцию. Осадок после центрифугирования отбрасывали, сыворотку фильтровали через фильтр с 0,45-мм отверстиями и замораживали. Полученную сыворотку использовали для солюбилизации лиофилизированного сывороточного порошка и его концентрирования в 21 раз перед использованием на крысах.

Лиофилизированное ферментированное молоко, растворенное в сыворотке: образец 2

Молоко (содержание белка 9,5%) ферментировали в присутствии штамма единичной культуры в течение 16 часов при уровне инокуляции 1% (об./об.). Полученный продукт лиофилизировали. Вторую ферментационную среду, полученную в тех же условиях, что использовались при первой ферментации, подвергали центрифугированию. Осадок после центрифугирования отбрасывали, сыворотку фильтровали через 0,45-мм фильтр и замораживали. Сыворотку использовали для растворения лиофилизированного ферментированного молока с целью его концентрации в 5 раз до кормления крыс.

Лиофилизированное ферментированное молоко, растворенное в молоке: образец 3

Молоко (содержание белка 9,5%) ферментировали в присутствии штамма единичной культуры в течение 16 часов при уровне инокуляции 1% (об./об.). Полученный продукт сушили вымораживанием. Молоко (с содержанием белка 9,5%) использовали для растворения лиофилизированного порошка с целью его концентрации в 5 раз до кормления крыс.

Продукт ночной ферментации молока: образец 4

Молоко (содержание белка 9,5%) ферментировали в присутствии штамма единичной культуры в течение 16 часов при уровне инокуляции 1% (об./об.).

Термообработанный продукт ночной ферментации молока: образец 5

Молоко (содержание белка 9,5%) ферментировали в присутствии штамма единичной культуры в течение 16 часов при уровне инокуляции 1% (об./об.).

Крысы со спонтанной гипертонией

Спонтанно гипертензивных крыс (SHR) получали от IFFA CREDO (a Charles River company), Lyon, France.

Каждый препарат применяли с помощью зонда в период от 9:15 ч до 9:30 ч и каждое животное получало по 2,5 мл препарата.

План эксперимента

Формировали три группы животных:

Группа 1 (n=16): животные получали лечение по схеме 1 (молоко; n=16)

Группа 2 (n=12): курс последовательного лечения, когда после каждого приема препарата следовал 3-дневный период промывки желудка

Группы: 1) Плацебо (молоко)

2) Образец 1 (лиофилизированная сыворотка, суспендированная в обычной сыворотке. Применяемый препарат характеризуется фактором концентрации 21)

2) Образец 2 (лиофилизированное ферментированное молоко, суспендированное в сыворотке. Применяемый препарат характеризуется фактором концентрации 5)

3) Образец 3 (лиофилизированное ферментированное молоко, суспендированное в молоке, с нейтральным рН. Применяемый препарат характеризуется фактором концентрации 5)

4) Образец 4 (ферментированный молочный продукт)

5) Образец 5 (ферментированное молоко, подвергнутое термообработке после ферментации)

6) Образец 6: (молоко, не подвергнутое ферментации, но содержащее живые бактерии)

Перед экспериментами все SHR проходили акклиматизацию в специальных приспособлениях в течение 9 недель. Кроме этого, всех животных приучали к использованию зонда и измерению систолического кровяного давления за три дня до первого кормления через желудочный зонд.

Параметры исследования

Систолическое кровяное давление и частоту сердечных сокращений находящихся в сознании SHR измеряли через определенные промежутки времени в течение 24 часов после кормления через зонд с помощью телеметрического оборудования (Data Sciences Int.).

Средние значения (за 1-минутные периоды) систолического, диастолического кровяного давления и частоты сердечных сокращений регистрировали каждые 15 минут в течение 24 часов до приема препарата и 48 часов после приема препарата. В результате такого мониторинга для каждой группы рассчитывали 24-часовые средние значения систолического, диастолического кровяного давления и частоты сердечных сокращений.

Кроме этого, изменения систолического и диастолического кровяного давления, вызванные приемом каждого вещества, в сравнении с соответствующими значениями, полученными без приема вещества, рассчитывали в течение 24 часов после кормления через желудочный зонд и в периоды времени от 3 до 6, от 12 до 15 и от 21 до 24 часов после чреззондового кормления.

Статистика

Все результаты выражали как среднее значение ± среднеквадратичная ошибка. Различия между значениями без приема веществ и значениями, полученными после кормления каждым из веществ через желудочный зонд, оценивали с помощью парного критерия Стьюдента в том случае, когда расчет проводился по программе SISTAT 8.0.

Результаты

В Таблице 1 представлены установленные изменения частоты сердечных сокращений.

Таблица 1
Частота сердечных сокращений (удары/мин) после
кормления через зонд Группа Период Изменения относительно объектов
Без лечения   0-24 3-6 12-15 21-24 0-24 3-6 12-15 21-24 Без лечения¹ 320+1 291+1 343+1 319+1         Образец 1 297+2* 268+2* 326+8 294+3* -26,4+3,4 -26,4+5,5 -19,8+9,3 -29,7+3,6 Без лечения² 330+4 291+6 361+5 289+5         Образец 2 307+6* 282+6 333+11∗ 265+4* -21+3 -9+5 -27+8 -24+4 Образец 3 312+6* 272+8* 344+5* 272+5* -16+1 -19+5 -17+4 -18+4 Образец 4 318+6 297+6 335+6 279+7 -10+3 7+6 -26+4 -10+6 Образец 5 313+5* 290+6 337+6* 280+5 -15+4 -1+7 -23+5 -9+4 Образец 6 343+9 330+17 359+9 305+5∗ 14+9 38+17 -2+7 16+7 *: р<0,05 для группы без лечения
«Без лечения¹» и «без лечения²» представляют собой контроли в исследовании 1 и исследовании 2 соответственно. Без лечения 1 относится к плацебо для образца 1, а без лечения 2 относится к плацебо для всех прочих образцов. Использовались два плацебо, поскольку проводилось два независимых in vivo исследования.

Полученные результаты показывают, что сывороточный продукт с фактором концентрации 21 (образец 1) обладает наиболее выраженными свойствами, касающимися уменьшения частоты сердечных сокращений.

Полученные результаты также свидетельствуют о том, что отсутствует необходимость в чрезмерном концентрировании ферментированного молочного продукта, поскольку он уже обладает значительным эффектом, касающимся уменьшения частоты сердечных сокращений. Образцы 4 и 5 представляют собой ферментированные молочные продукты, ферментированные в течение ночи, и они обладают способностью уменьшать частоту сердечных сокращений. Однако эффект понижения частоты сердечных сокращений пропорционален фактору концентрации продукта.

Очевидно, что сывороточная часть продукта, содержащая пептиды и другие активные компоненты, играет основную роль в уменьшении частоты сердечных сокращений. Наблюдается зависимость частоты сердечных сокращений от дозы продукта.

Образец 3 представляет собой лиофилизированное ферментированное молоко, суспендированное в молоке с нейтральным значением рН. Этот образец обеспечивает значительное уменьшение частоты сердечных сокращений. Этот факт демонстрирует широкую применимость описанного ферментированного продукта, поскольку его можно растворять в различных жидкостях с получением материала, подходящего для требуемого конечного применения. Такая характеристика, как различные значения рН, не оказывает влияния на активность продукта в отношении уменьшения частоты сердечных сокращений.

Образец 5, подвергнутый термообработке после ферментации, также уменьшает частоту сердечных сокращений. В рассматриваемом образце уничтожены почти все бактерии. Таким образом, полученный результат показывает, что присутствие живых бактерий в конечном продукте не является обязательным.

Образец 6 не подвергался ферментации, но содержал живые бактерии. Этот образец не уменьшает частоту сердечных сокращений. Полученный результат свидетельствует о необходимости проведения стадии ферментации.

Пример 2: Эксперимент по определению зависимости доза-эффект

С целью дополнительного обоснования результатов, представленных в Примере 1, проводили эксперимент по определению зависимости доза-эффект, в котором на спонтанно гипертензивных крысах (SHR) применяли композиции, содержащие различные количества лиофилизированной сыворотки, полученной из ферментированного молока, суспендированного в сыворотке из ферментированного молока.

В эксперименте использовались те же материалы и методы, а так же тот же план эксперимента, что и в Примере 1.

Молоко ферментировали в присутствии Lactobacillus helveticus штамма СНСС5951 (DSM 14998) в течение 16 часов при уровне инокуляции 1% (об./об.). Ферментированное молоко центрифугировали, осадок выбрасывали, а сыворотку лиофилизировали. Вторую ферментационную среду, полученную в тех же условиях, что и первая, подвергали центрифугированию. Осадок отбрасывали и сыворотку хранили при 4°С. Сыворотку использовали для растворения лиофилизированного сывороточного порошка, в результате чего получали композиции, содержащие твердые сывороточные компоненты, более концентрированные в 2, 6 и 14,3 раза по сравнению с количеством твердых компонентов в сыворотке, полученной во второй ферментации. Конечную стадию растворения проводили непосредственно перед кормлением крыс указанной композицией.

Как и в Примере 1, неферментированное молоко использовали в качестве плацебо.

Дозы испытывали на одинаковых животных в течение трех отдельных периодов тестирования, начиная с самых низких концентраций. После каждого периода тестирования следовал трехдневный период промывки, в котором животные не получали ферментированного сывороточного продукта с целью исключения активности предыдущей дозы.

Полученные результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 2
Частота сердечных сокращений (удары/мин) после
кормления через желудочный зонд   Период Изменения относительно плацебо   0-24 3-6 12-15 21-24 0-24 3-6 12-15 21-24 Без лечения 306+2 265+5 337+5 273+2         Плацебо 304+2 268+2 333+3 278+4 -2 +3 -4 +5 Плацебо 314+11 282+12 335+12 295+14         Концентрация 1 302+7 278+10 324+7 274+7 -12 -4 -11 -21 Плацебо 314+9 278+8 346+9 288+8         Концентрация 2 309+9 287+10 334+9 289+11 -5 +8 -12 1 Плацебо 311+9 278+9 337+11 279+8         Концентрация 3 297+9 279+15 314+7 277+10 -14 +1 -24 -2 Примечания к таблице: Необработанные крысы не получали ни молока, ни сывороточного продукта. Плацебо представляет собой неферментированное молоко. Концентрации 1, 2 и 3 относятся к сывороточным композициям, содержащим твердые компоненты сыворотки, сконцентрированные в 2, 6 и 14,3 раза соответственно. Следует отметить, что период активности животных совпадал с периодом без освещения, т.е. периодом времени от 9 до 21.

На фигуре 1 представлены результаты для одного полного периода с использованием концентрации 3 (фактор концентрации 14,3).

На основе лиофилизированного сывороточного порошка получали композиции, содержащие компоненты твердой сыворотки, сконцентрированные в 21 раз относительно количества твердых компонентов в сыворотке, полученной во второй ферментации. На фигуре 2 представлены результаты кормления животных сывороточным продуктом, сконцентрированным в 2, 6, 14,3, а также в 21 раз.

Представленные результаты демонстрируют явный дозазависимый эффект на частоту сердечных сокращений, оказываемый сывороточными продуктами, сконцентрированными до фактора концентрации 21. Чем выше доза сывороточных продуктов, тем в большей степени уменьшается частота сердечных сокращений. Предполагается, что стационарный или асимптотический уровень не достигается, что свидетельствует в пользу того, что композиции, содержащие повышенные концентрации активных соединений, могут более эффективно влиять на уменьшение частоты сердечных сокращений.

Пример 3: Понижение флуктуаций частоты сердечных сокращений в периоде высокой активности

В периоде высокой активности животных происходит повышение частоты сердечных сокращений. Период активности животных в данном исследовании почти совпадает с периодом без освещения, т.е. с периодом, обозначенным черными столбиками (см. Фигуру 1). Однако из наблюдений, результаты которых представлены на Фигуре 1, следует не только частота сердечных сокращений, но неожиданно и флуктуации сердечного ритма выше у необработанных животных по сравнению с животными, леченными ферментированным сывороточным продуктом с фактором концентрации 14,3.

С целью количественного определения флуктуаций частоты сердечных сокращений оценивали вариацию значений частоты сердечных сокращений, наблюдаемую в период времени от 12 до 15 часов. Среднеквадратичное отклонение оценивали как для животных, не получавших лечения, так и у леченных животных с использованием программы SISTAT 8.0, описанной в Примере 1, и полученные значения использовали для расчета дисперсии ((среднеквадратичное отклонение)² = дисперсия).

Среднеквадратичное отклонение у животных, получавших лечение, составило 5,9, что соответствует дисперсии (5,9²) = 34,8.

Среднеквадратичное отклонение у животных, не получавших лечения, составило 10,4, что соответствует дисперсии (10,4²) = 108,2.

Предполагая нормальное распределение первичных данных, дисперсия, равная 34,8, статистически значимо отличается от дисперсии 108,2 при уровне достоверности 95%.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что число флуктуаций частоты сердечных сокращений в ходе периода активности (измеренных как дисперсия) значительно выше у нелеченных животных по сравнению с числом флуктуаций частоты сердечных сокращений у животных, получавших лечение в виде х14,3 концентрированного ферментированного сывороточного продукта.

В заключение следует отметить, что флуктуации частоты сердечных сокращений стабилизируются с помощью сывороточного продукта, ферментированного Lactobacillus helveticus штаммом СНСС5951 (DSM 14998). Этот факт может служить важным отличительным признаком продукта, поскольку установлено, что изменения частоты сердечных сокращений хорошо коррелируют со смертностью при исследовании экспериментальной кроличьей модели (Zaza et al. 2001), поскольку в стрессовых ситуациях часто наблюдаются значительные флуктуации частоты сердечных сокращений.

Пример 4: Сравнение молочных продуктов, ферментированных в присутствии L. helveticus strain CHCC5951 с аналогичным коммерческим продуктом, ферментированным в присутствии различных штаммов

Цель примера состояла в сравнении молочного продукта, ферментированного в присутствии коммерческих молочнокислых бактерий, с продуктом, ферментированным в присутствии Lactobacillus helveticus штамма CHCC5951 (DSM 14998).

Влияние двух указанных продуктов на кровяное давление и частоту сердечных сокращений оценивали применением рассматриваемых продуктах на крысах Wistar и измерением систолического артериального давления крови, диастолического кровяного давления и частоты сердечных сокращений у анестизированных животных.

Если специально не оговорено, то использовались те же материалы и методы, описанные в Примере 1.

Молоко ферментировали в присутствии Lactobacillus helveticus штамма СНСС5951 (DSM 14998) в течение 16 часов при уровне инокуляции 1% (об./об.), и полученный в результате продукт сушили сублимацией с получением лиофилизированного молочного порошка. Вторую ферментационную среду получали в тех же условиях, что и первую, и подвергали центрифугированию. Осадок после центрифугирования отбрасывали, и сыворотку фильтровали через 0,45-мкм фильтр и замораживали. Непосредственно перед кормлением крыс лиофилизированный молочный порошок растворяли в сыворотке. Количество растворенного порошка соответствовало количеству, полученному из объема ферментированного молока, который в 5 раз превосходил объем взятой сыворотки (например, 4,28 г порошка в 30 мл сыворотки). В данном примере рассматриваемую композицию относили к 5-кратно концентрированной системе. Композицию применяли на крысах Wistar c нормальным кровяным давлением, не получавших пищи в течение ночи (300-320 г), в промежутке времени от 09:15 ч до 09:30 ч с помощью желудочного зонда, используя дозу 5-кратно концентрированной композиции, составляющую 7,5 мл на кг. Эффект от приема композиции оценивали в период между 14:30 ч до 16:30 ч, т.е. через 5-7 часов после перорального приема, в результате измерения значений артериального кровяного давления и частоты сердечных сокращений у анестезированных животных.

Полученные результаты представлены в Таблице 3.

Таблица 3
Влияние двух различных ферментированных продуктов на кровяное давление и частоту сердечных сокращений   Без лечения Коммерческий продукт CHCC5951 ферментированный молочный продукт Систолическое кровяное давление (mm Hg) 134±3 125±3* 125±3* Диастолическое кровяное давление (mm Hg) 107±3 98±4* 96±2* Среднее кровяное давление (mm Hg) 116±3 107±4* 106±2* Частота сердечных сок-ращений (Удары, мин-1) 390±7 387±6 353±6* Значения (среднее + SEM систолического, диастолического, среднего артериального кровяного давления и частоты сердечных сокращений в трех различных группах, через 5-7 часов после кормления через желудочный зонд.
* показывает значительное отличие при p<0,05 между крысами, не получавшими лечения, и леченными крысами. Статистический анализ проводили с использованием ANOVA, с последующим использованием критерия множественного сравнения Таки.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что коммерческий продукт, как и СНСС5951 ферментированный продукт, снижают кровяное давление в одинаковой степени. Однако из данных Таблицы 3 неожиданно следует, что лишь СНСС5951 ферментированный продукт значительно уменьшает частоту сердечных сокращений.

Пример 5: Связывание ферментированного продукта с адренергическими альфа-рецепторами

Цель данного эксперимента состояла в исследовании возможности связывания молочного продукта, ферментированного в присутствии штамма Lactobacillus helveticus CHCC5951 (DSM 14998), со специфическим рецептором при использовании in vitro рецепторосвязывающего анализа.

Молоко ферментировали в присутствии штамма Lactobacillus helveticus CHCC5951 (DSM 14998) в течение 16 часов при уровне инокуляции 1% (об./об.). Ферментат центрифугировали, осадок отбрасывали и сыворотку разделяли на две части. Одну часть сыворотки сушили сублимацией. Другую часть сыворотки хранили при +4°С до последующего использования. Этот материал обозначали как концентрирование 1Х.

Лиофилизированную композицию хранили при -50°С до разбавления в соответствующем разбавителе. 200Х исходный раствор готовили путем растворения лиофилизированного порошка в объеме воды с получением исходного раствора, имеющего в 200 раз более высокую концентрацию сывороточных белков относительно нелиофилизированной сывороточной композиции.

Проводили in vitro конкурентно-связывающий анализ ряда рецепторов, как показано в следующей ниже Таблице 4.

Таблица 4
In vitro конкурентно-связывающий анализ Семейство рецепторов Рецепторный анализ Биологическое происхождение рецептора Соединение используемое для сравнения Анализ, проведенный согласно Адренергический α ₁ (не-селективный) Кора головного мозга крыс празозин Greengrass and Bremner(1979) Адренергический α ₂ (не-селективный) Кора головного мозга крыс йохимбе UhlenandWikberg(1991)

Результаты конкурентно-связывающего анализа in vitro представлены ниже, в Таблице 5.

Таблица 5
Результаты конкурентно-связывающего анализа in vitro Тип рецептора Концентрация ферментированного продукта % ингибирования контрольного специфического связывания α₁ (не-селективный) 0,05 X 41 α₁ (не-селективный) 0,1 X 91 α₁ (не-селективный) 10X 97 α₁ (не-селективный) 20 X 97 α₂ (не-селективный) 10X 100 α₂ (не-селективный) 20 X 100

В случае адренергического α₁ рецептора значения IC₅₀ (концентрация, вызывающая 50% ингибирование контрольного специфического связывания) и коэффициенты Hill (n_H) определяли нелинейным регрессионным анализом конкурентных кривых с использованием подбора кривой, соответствующей уравнению Hill. Константы ингибирования (K_i) рассчитывали из уравнения Cheng Prusoff (K_i=IC₅₀/(1+(L/K_D), в котором L=концентрация радиоактивного лиганда, а K_D=сродство радиолиганда к рецептору). Результаты: IC₅₀=1,2·10^-9M, K_i=3,1·10^-10M, а n_H=0,7.

Из представленных данных можно заключить, что пищевой материал, ферментированный в присутствии штамма Lactobacillus helveticus СНСС5951 (DSM 14998), содержит компоненты, обеспечивающие доза-зависимое, специфическое связывание с адренергическим α₁ рецептором, выделенным из коры головного мозга крыс.

Пример 6: Связывание ферментированного продукта со специфическими адренорецепторами и мускариновыми рецепторами

Цель данного эксперимента состояла в исследовании возможности связывания молочного продукта, ферментированного в присутствии штамма Lactobacillus helveticus CHCC5951 (DSM 14998), с конкретным специфическим адренергическим или мускариновым рецептором при использовании in vitro рецепторосвязывающего анализа.

Материалы и методы

Молоко ферментировали в присутствии штамма Lactobacillus helveticus CHCC5951 (DSM 14998) в течение 16 часов при уровне инокуляции 1% (об./об.). Ферментат центрифугировали, осадок отбрасывали и сыворотку хранили при +4°С до последующего использования. Этот материал обозначали как концентрирование 1Х.

Рецепторосвязывающий анализ проводили в соответствии с данными, представленными в Таблице 6, и литературными данными, указанными в Таблице 7. Результаты рецепторносвязывающего анализа приведены в Таблице 8.

Таблица 6
Рецепторносвязывающие анализы Анализ Лиганд Конц. Не-специфический Инкубация Способ детекции a_1A(h) [³H]празозин 0,06 nM празозин (10 мкM) 60
мин/22°C Подсчет сцинтилляций a_1B(h) [³H]празозин 0,05 nM празозин (10 мкM) 60
мин/22°C Подсчет сцинтилляций a₂ A(h) [³H]RX 821002 1 nM (-) эпинефрин
(100 мкM) 30 мин/22°C Подсчет сцинтилляций a₂B(h) [³H]RX 821002 2,5 nM (-) эпинефрин
(100 мкM) 30 мин/22°C Подсчет сцинтилляций β₁(h) [³H](-)CGP 12177 0,15 nM алпренолол (50 мкM) 60 мин/22°C Подсчет сцинтилляций β₂(h) [³H](-)CGP 12177 0,15 nM Алпренолол (50 мкM) 60 мин/22°C Подсчет сцинтилляций β₃(h) [¹²⁵I]CYP (+1 мкM
(-)пропранолол) 0,6 nM пропранолол (1 mM) 90
мин/37°C Подсчет сцинтилляций 5-HT (не-селектив-ный) [³H]серотонин 2nM серотонин (10мкM) 15 мин/37°C Подсчет сцинтилляций

Таблица 7
Конкурентный in vitro связывающий анализ Семейство рецепторов Рецепторный анализ Биологическое происхождение рецептора Соединение, используемое для конкуренции Анализ осуществлен, как описано Адренергические α₁ A Слюнные железы крыс WB4101 Michel et al. (1989) Адренергические α₁ В Печень крыс спиперон Michel et al. (1989) Адренергические α₂A(h) Человеческий рекомбинант (CHO клетки) йохимбе Langin et al. (1989) Адренергические α₂B(h) Человеческий рекомбинант (CHO клетки йохимбе Devedjian et al. (1994) Адренергические α₂C(h) Человеческий рекомбинант (CHO клетки) йохимбе Devedjian et al. (1994) Адренергические β₁(h) Человеческий рекомбинант (HEK-293 клетки) атенолол Levin et al. (2002) Адренергические β₂(h) Человеческий рекомбинант (Sf9 cells) ICI 118551 Smith and Teitler (1999) Адренергические β₃(h) SK-N-MC клетки рекомбинант (S19 клетки) цианопиндолол Curran and Fishman (1996) Серотониновые 5-HT (не-селективный) Кора головного мозга крыс серотонин Peroutka and Snyder(1979)

Таблица 8
Результаты конкретного in vitro связывающего анализа Тип рецептора Концентрация ферментированного продукта % ингибирования контрольного специфического связывания α₁ A 0,05 X
0,1 X -11
78 α₁ В 0,05 X
0,1 X 18
76 α₂A(h) 0,05 X
0,1 X 37
91 α₂B(h) 0,05 X
0,1 X 43
93 α₂C(h) 0,05 X
0,1 X 13
86 β₁(h) 0,05 X
0,1 X 16
62 β₂(h) 0,05 X
0,1 X 83
103 β₃(h) 0,05 X
0,1 X -2
28 5-HT (не-селективный) 0,05 X
0,1 X 65
120

На основании представленных данных можно сделать вывод о том, что пищевой материал, ферментированный в присутствии штамма Lactobacillus helveticus СНСС5951 (DSM 14998), содержит компоненты, которые обеспечивают доза-зависимое, специфическое связывание с адренорецепторами и серотониновыми рецепторами.

Несколько рецепторов подвергается ингибированию, что подчеркивает сложность композиции супернатанта. Разнообразные эффекты, по всей вероятности, осуществляются различными пептидами с различными целевыми профилями.

В заключение следует отметить, что соединения, присутствующие в сыворотке ферментата, экспрессируют наивысшую ингибиторную активность относительно бета 2(h) (в среднем 93%) и 5-НTns (в среднем 93%) рецепторов, и далее в следующем ряду: альфа 2В(h) (в среднем 68%)> альфа 2А(h) (в среднем 64%)> альфа 2С(h) (в среднем 50%) и альфа 1В(h) (в среднем 47%). Рассматриваемые соединения незначительно ингибируют рецепторы бета1(h) (в среднем 39%) и альфа 1А(h) (в среднем 34%).

Рассматриваемые соединения не обладали активностью в отношении рецептора бета3(h).

ЛИТЕРАТУРА

EP821968 (Calpis Food Industry)

EP1016709 (Calpis Food Industry)

WO0132836 (Valio Ltd.)

WO0185984 (Davisco International Foods, Inc.)

Altwein (1995) The changing therapy of benign prostatic hyperplasia. Scand J Urol Nephrol Suppl.; 168:1-6.

Barry and Roehrborn (1997), Management of benign prostatic hyperplasia. Annu Rev Med, 48:177-89).

Brindley GS (1986) Pilot experiments on the actions of drugs injected into the human corpus cavernosum penis. Br J Pharmacol 87:495-500.

Curran, P.K. and Fishman, P.H. (1996) Endogenous β₃-but not β₁-adrenergic receptors are resistant to agonist-mediated regulation in human SK-N-MC neurotumor cells. Cell Signal, 8: 355-364.

Devedjan, J.C., Esclapez, F., Denis-Ploxviel, C., and Paris, H., (1994) Further characterization of human α₂-adrenoreceptor subtypes: [³H]RX82102 binding and definition of additional selective drugs. Eur. J. Pharmacol., 252:43-49.

Fuglsang, A.; et al. (2002) Applied and Environmental Microbiology, 3566-3569.

Fuller R. (1989) Probiotics in man and animals. J AppI Bacteriol 66: 365-78.

Greengrass, P. and Bremner, R. (1979) Binding characteristics of [³H]-prazosin to rat brain alpha-adrenergic receptors. Eur. J. Pharmacol., 55:323-326.

Kenny, B. et al. (1995) Alpha 1-Adrenoreceptor Antagonists As Treatments For Benign Prostatic Hyperplasia, Exp.Opin. Invest. Drugs, (1995); 4(10), 915-23.

Kim NN et al. (2000) Alpha-adrenergic receptor blockade by phentolamine increases the efficacy of vasodilators in penile corpus cavernosum. Int J Impot Res. 12 Supp1 1:S26-36.

Langin, D., Lafontan, M., Stilling, M.R., and Paris, H. (1989) [³H]RX82102: a new tool for the identification of α₂-adrenoreceptors. Eur. J.Pharmacol., 167: 95-104.

Levin, M.C., Marullo, S., Muntaner, O., Anderson, B. and Magnusson, Y. (2002). The myo-cardium-protective Gly-49 variant of the beta 1-adrenergic receptor exhibits constitutive activity and increased desensitization and down regulation. J. Biol.Chem. 277:30429-30435.

Michel, A.D., Loury, D.N. and Whiting, R.L. (1989) Identification of a single α₁-adrenoreceptor corresponding to the α_1A-subtype in rat submaxillary gland. Brit. J. Pharmacol., 98: 883-889.

Morales (2000) Yohimbine in erectile dysfunction:the facts. Int J Impot Res. 12 (Supp1 1): S70-S74.

Peroutka, S.J. and Snyder, S.H. (1979) Multiple serotonin receptors: differential binding of [³H]-hydroxytryptamine, [³H]lysergic acid diethylamide and [³H]spiroperidol. Mol. Pharma col., 16:687-699.

Ronald F. Borne (1994) Serotonin: The Neurotransmitter for the "90s. Drug Topics, October 10, 1994, p.108 (http://web.tampabay.rr.com/lymecfs/seroton.htm).

Smith, C. and Teitler, M. (1999) Beta-blocker selectivity at cloned human beta₁ and beta₁-adrenergic receptors. Cardiovasc. Drugs Ther., 13,: 123-126.

Uhlen, S. and Wikberg, J.E. (1991) Rat spinal chord α2-adrenoceptors are of the α2A-subtype:comparison with α2A- and α2B-adrenoreceptors in rat spleen, cerebral cortex and kidney using ³H-RX821002 ligand binding. Pharmacol. Toxicol., 69:341-350.

Yamamoto et al. (1996) Am. J. Clin. Nurt., 64:767-71.

Zaza, A., T. Opthof, J. Camm, F. Lombardi and S. Hohnloser (2001) "Heart rate reduction:optimism with some caveats". nEwSCast Report presented to the XXIII'th Congress of the European Society of Cardiology, Stockholm 2001 (http://ftp.escardio.org/newscast/archivesstock.htm).

Относительно депонированных бактериальных микроорганизмов [Экспертное решение]

Следующая ниже информация применима ко всем депонированным бактериальным микроорганизмам, упомянутым в данной заявке на патент.

ЕВРОПА

В соответствии с указаниями, образец депонированного микроорганизма может стать доступным для Европейского патента до публикации ссылки о выдаче Европейского патента или до даты отказного решения по заявке или отзыва заявки лишь в случае передачи образца эксперту, предложенному субъектом, запросившим образец, и при утверждении i) Авторами изобретения и/или (ii) Европейским патентным ведомством (Правило 28(4) и 28(5) ЕРС).

КАНАДА

Авторы изобретения требуют, чтобы до выдачи Канадского патента на основе заявки или получении отрицательного решения по заявке, или приостановления ее подачи без права восстановления, или ее отклонения, Комиссар по патентам лишь санкционирует предоставление образца депонированного биологического материала, на который ссылаются в заявке, независимому эксперту, предложенному Комиссаром, причем авторы изобретения должны в письменной форме информировать Международное ведомство до завершения технической подготовки к публикации международной заявки.

НОРВЕГИЯ

Авторы изобретения запрашивают о том, чтобы до опубликования заявки для всеобщего ознакомления (Норвежским патентным ведомством) или до окончательного решения Норвежского патентного ведомства без опубликования для всеобщего ознакомления предоставление образца может быть осуществлено экспертом в данной области. Запрос на такое действие должен быть подан заявителем совместно с Норвежским патентным ведомством не позже того времени, когда заявка станет доступной для публики согласно Параграфу 22 и 33(3) Норвежского патентного закона. Если запрос исходит от заявителя, то любой запрос, сделанный третьей стороной о предоставлении образца, предполагает привлечение эксперта. В качестве Эксперта может быть привлечена любая персона, внесенная в перечень признанных экспертов, составленный Норвежским патентным ведомством, или персона, утвержденная заявителем в индивидуальном порядке.

АВСТРАЛИЯ

Заявитель предупреждает, что образец микроорганизма может быть предоставлен только до выдачи патента или по истечении срока действия, отказном решении или изъятии заявки специалисту в данной области, не имеющих интересов, связанных с изобретением (Положение 3.25 Австралийских патентных правил).

ФИНЛЯНДИЯ

Заявитель запрашивает о том, чтобы до опубликования заявки для всеобщего ознакомления (Национальным советом по патентам и нормам), или в том случае, когда Национальным советом по патентам и регистрации принято окончательное решение по заявке без ее опубликования для всеобщего ознакомления, образец был предоставлен только эксперту в данной области.

ВЕЛИКОБРИТАНИЯ

Настоящим заявитель запрашивает о том, чтобы предоставление образца микроорганизма было доступно только для эксперта. Запрос о таком действии должен быть подан заявителем совместно с Международным Ведомством до завершения технической подготовки к международному опубликованию заявки.

ДАНИЯ

Настоящим заявитель запрашивает о том, чтобы до опубликования заявки для всеобщего ознакомления (Датским патентным ведомством), или в том случае, когда Датским патентным ведомством принято окончательное решение по заявке без ее опубликования для всеобщего ознакомления, образец был предоставлен только эксперту в данной области. Запрос о таком действии должен быть подан заявителем совместно с Датским патентным ведомством не позже того времени, когда заявка станет доступной для публики согласно Разделу 22 и 33(3) Датского закона о патентах. Если запрос подан заявителем, то любой запрос, сделанный третьей стороной о предоставлении образца, предполагает привлечение эксперта. В качестве Эксперта может быть привлечена любая персона, внесенная в перечень признанных экспертов, составленный Датским патентным ведомством, или персона, утвержденная заявителем в индивидуальном порядке.

ШВЕЦИЯ

Настоящим заявитель запрашивает о том, чтобы до опубликования заявки для всеобщего ознакомления (Шведским патентным ведомством), или в том случае, когда Датским патентным ведомством принято окончательное решение по заявке без ее опубликования для всеобщего ознакомления, образец был предоставлен только эксперту в данной области. Запрос о таком действии должен быть подан заявителем совместно с Международным ведомством до истечения 16-месячного срока от даты приоритета (предпочтительно в виде формы PCT/RO/132, приведенной в приложении Z тома 1 Руководства для заявителей PCT). Если запрос подан заявителем, то любой запрос, сделанный третьей стороной о предоставлении образца, предполагает привлечение эксперта. В качестве Эксперта может быть привлечена любая персона, внесенная в список признанных экспертов, составленный Шведским патентным ведомством, или персона, утвержденная заявителем в индивидуальном порядке.

НИДЕРЛАНДЫ

Настоящим Заявитель запрашивает, чтобы до даты выдачи Нидерландского патента или даты ее отклонения, изъятия или признания ее недействительной, микроорганизм был доступен, в соответствии с 3IF(1) Патентных правил, только эксперту, которому будет предоставлен соответствующий образец. Запрос о таком действии должен быть подготовлен заявителем совместно с Нидерландским бюро по промышленной собственности до даты представления заявки на публичное рассмотрение, в соответствии с Разделом 22С или Разделом 25 закона о патентах Королевства Нидерландов, независимо от того, какая из этих дат относится к более раннему сроку.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для изготовления продукта для лечения или предотвращения доброкачественной гипертрофии предстательной железы и/или эректильной дисфункции у млекопитающих. Продукт получают ферментацией пищевого материала, содержащего животное молоко, в присутствии, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий. Полученную молочную сыворотку используют для лечения или предотвращения указанной патологии. Использование такого продукта обеспечивает в том числе блокаду α_1A-адренорецепторов, что в свою очередь приводит к снижению тонуса гладкой мускулатуры простаты и выходного отверстия мочевого пузыря. 30 з.п. ф-лы, 2 ил., 8 табл.

1. Применение композиции, полученной способом, включающим ферментацию пищевого материала, содержащего животное молоко, в присутствии, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий с получением ферментированного пищевого или кормового материала, содержащего, по меньшей мере, один компонент, являющийся лигандом адренергического или серотонинового рецептора для изготовления продукта, предназначенного для лечения или предотвращения доброкачественной гипертрофии предстательной железы (ВРН) и/или эректильной дисфункции у млекопитающих.

2. Применение композиции по п.1, в котором рецептор выбирают из группы, содержащей альфа-адренергические рецепторы, бета-адренергические рецепторы и серотониновые рецепторы.

3. Применение композиции по п.2, в котором рецептор выбирают из группы рецепторов, включающей альфа₁A-, альфа₁B-, альфа_2A(h)-, альфа_2B(h)-, альфа_2C(h)-, бета₁(h)-, бета₂(h)- и бета₃(h)-адренергический рецептор и серотониновые рецепторы.

4. Применение композиции по п.3, в котором рецептор выбирают из группы рецепторов, включающей альфа_2A(h)-, альфа_2B(h)-, и бета₂(h)-адренергический рецептор.

5. Применение композиции по любому из пп.1-3, где указанный ферментированный пищевой материал содержит, по меньшей мере, один компонент, являющийся лигандом адренергического рецептора и, по меньшей мере, один компонент, являющийся лигандом серотонинового рецептора.

6. Применение композиции по любому из пп.1-4, где указанный ферментированный пищевой материал содержит, по меньшей мере, один компонент, являющийся лигандом адренергического альфа-рецептора и, по меньшей мере, один компонент, являющийся лигандом адренергического бета-рецептора.

7. Применение по любому из пп.1-4, где указанный лиганд указанного рецептора обладает характеристиками антагониста рецептора.

8. Применение по п.6, где указанный лиганд указанного рецептора обладает характеристиками антагониста рецептора.

9. Применение по п.7, в котором продукт является пищевым или кормовым продуктом.

10. Применение композиции по любому из пп.1-4 для изготовления продукта, дополнительно предназначенного для уменьшения частоты сердечных сокращений у млекопитающих.

11. Применение композиции по любому из пп.1-4, дополнительно включающей, по меньшей мере, один компонент, являющийся лигандом GABA рецептора.

12. Применение по п.11, где, по меньшей мере, один компонент, являющийся лигандом GABA рецептора, получают способом, включающим ферментацию пищевого или кормового материала, содержащего животное молоко, с по меньшей мере, одним штаммом молочнокислых бактерий с образованием ферментированного пищевого материала.

13. Применение композиции по п.10, в котором продукт в дополнение к уменьшению частоты сердечных сокращений используется для лечения или облегчения заболевания коронарной артерии (CAD) или ишемической болезни сердца (CHD) такой, как стенокардия, гипертония, атеросклероз, удар, инфаркт миокарда, церебральный инфаркт и рестеноз после ангиопластики, аритмия, тахиаритмия, застойная сердечная недостаточность (CHF), регургитация клапана аорты, хроническая почечная недостаточность, дислипидемия, дислипопротеинемия.

14. Применение по любому из пп.1-4, в котором лечение также приводит к понижению флуктуации частоты сердечных сокращений.

15. Применение композиции по пп.1-4, дополнительно содержащей, по меньшей мере, один компонент, выбранный из группы, состоящей из оксида азота или компонентов, ингибирующих фосфодиэстеразу-5 или 5-альфа редуктазу, для изготовления продукта для лечения или предотвращения доброкачественной гипертрофии предстательной железы (ВРН) и/или эректильной дисфункции.

16. Применение по п.10, в котором ферментированный пищевой материал дополнительно обрабатывают таким образом, чтобы очистить или дополнительно концентрировать активные компоненты, обладающие свойствами, понижающими частоту сердечных сокращений, получаемые способом, включающим следующие стадии:
(i) приготовление ферментированного пищевого материала в соответствии со способом получения активных компонентов, обладающих свойствами, понижающими частоту сердечных сокращений согласно любому из предыдущих пунктов,
(ii) дополнительную обработку ферментированного материала со стадии (i), проводимую таким образом, что обеспечивается очистка или дополнительная концентрация активных компонентов, обладающих свойствами, понижающими частоту сердечных сокращений,
(iii) упаковку подходящим методом для получения продукта.

17. Применение по п.16, в котором концентрирование в соответствии со стадией (ii), осуществляют центрифугированием и выделяют полученный супернатант, содержащий активные компоненты.

18. Применение по п.16, в котором пищевой материал представляет собой молоко, а продукт представляет собой сыворотку.

19. Применение по любому из пп.1-4, где молочнокислые бактерии выбирают из группы, состоящей из рода Lactobacillus, рода Lactococcus, рода Streptococcus, рода Leuconostoc, рода Bifldobacterium и рода Pediococcus.

20. Применение по п.10, где молочнокислые бактерии выбирают из группы, состоящей из рода Lactobacillus, рода Lactococcus, рода Streptococcus, рода Leuconostoc, рода Bifldobacterium и рода Pediococcus.

21. Применение по п.19, где молочнокислые бактерии рода Lactobacillus представляют собой Lactobacillus helveticus.

22. Применение по п.19, где молочнокислые бактерии рода Streptococcus представляют собой Streptococcus thermophilus.

23. Применение по п.19, где пищевой или кормовой материал ферментируют с использованием комбинации, по меньшей мере, двух молочнокислых бактерий.

24. Применение по п.20, где пищевой или кормовой материал ферментируют с использованием комбинации, по меньшей мере, двух молочнокислых бактерий.

25. Применение по п.23, где пищевой или кормовой материал ферментируют с использованием молочнокислых бактерий рода Lactobacillus helveticus и молочнокислых бактерий рода Streptococcus thermophilus.

26. Применение по любому из пп.1-4, в котором молочнокислая бактерия представляет собой Lactobacillus helveticus с регистрационным номером DSM 14998 или ее мутант.

27. Применение по п.10, в котором молочнокислая бактерия представляет собой Lactobacillus helveticus с регистрационным номером DSM 14998 или ее мутант.

28. Применение по любому из пп.1-4, в котором ферментированный пищевой или кормовой материал содержит живые бактериальные клетки.

29. Применение по п.10, где ферментированный пищевой или кормовой материал содержит живые бактериальные клетки.

30. Применение по любому из пп.1-4, где ферментированный пищевой или кормовой материал содержит живые бактериальные клетки штамма Lactobacillus helveticus DSM 14998 или его мутанта.

31. Применение по п.10, в котором ферментированный пищевой или кормовой материал содержит живые бактериальные клетки штамма Lactobacillus helveticus DSM 14998 или его мутанта.