СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НИКЕЛЕВОЙ НЕФРОПАТИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ОТРАВЛЕНИИ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 A61B5/145 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании патогенетических механизмов токсического действия тяжелых и цветных металлов, в частности никеля, на функциональное состояние почек.

Почки являются основным органом, экскретирующим токсины, поглощенные организмом. Большое число нефронов обеспечивает обширную поверхность эндотелиальных клеток клубочков и эпителия канальцев для контактов с ними. (Османов И.М., 1996). Нарушения функций почек при никелевой интоксикации могут быть обусловлены непосредственным влиянием никеля на ферментные системы эпителия почечных канальцев, обеспечивающих активную секрецию и реабсорбцию. Имеются данные, что нарушение функций почек может служить индикатором вредных воздействий аномальных концентраций тяжелых металлов на организм. Имеются данные литературы, свидетельствующие о том, что никель способен инициировать процессы свободно радикального окисления (Антошина Л.И. и соавт. 2001 г.). Некоторые авторы конкретно указывают на то, что никель способен повышать уровень активных радикалов кислорода (Павловская Н.А. и соавт. 2002 г.).

Наряду с приведенными данными литературы следует отметить, что недостаточно изученным остается вопрос о патогенетической роли перекисного окисления липидов в развитии нарушений водо- и электролито-выделительной функции почек и активности мембранных ферментов, в частности, Na, K-АТФ-азы почечной ткани.

Известен способ диагностики никелевой нефропатии, основанный на проведении морфологического исследования почечной ткани животных, в результате чего обнаружена гипотрофия основных элементов почечного тельца - изменение базальной мембраны, расширение сосудов и подподоцитарного пространства, удлинение педикул подоцитов, изменение ультраструктуры эпителиоцитов дистальных канальцев и собирательных почечных трубочек (Гарец В.И., Слесаренко Е.Г. Ультраструктурный анализ влияния хлорида никеля на клетки почек мышей. // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной урологии и нефрологии. - 1989 г. С 63-64). Данная модель взята нами в качестве прототипа.

Недостатком описываемого способа является то, что, во-первых, не отражены нарушения водо- и электролито-выделительной функции почек при никелевой интоксикации, во-вторых, не проведен биохимический анализ, раскрывающий патогенетические механизмы этих нарушений.

У заявляемого изобретения имеются следующие существенные признаки: у экспериментальных животных на фоне никелевой интоксикации при хроническом отравлении изучают активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по концентрации конечного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) в мембранах эритроцитов и почечной ткани и одновременно активность Na+, K+-АТФ-азы почечной ткани, и при значениях МДА 4,88±0,03 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и мозгового веществ почечной ткани соответственно 2,18±0,03 и 3,57±0,06 нмоль/мг белка и более и значениях активности Na+, K+-АТФ-азы коркового и мозгового веществ почечной ткани 2,21±0,08 и 5,39±0,13, мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно диагностируют никелевую нефропатию. Эритроциты являются универсальными представителями тканевых клеток, поэтому изменение содержания МДА в эритроцитах отражает содержание его в других клетках, в частности в клетках почечной ткани. Т.е. изменения концентрации МДА в эритроцитах и клетках почечной ткани однонаправлены, поэтому этот показатель можно использовать для диагностики никелевой нефропатии не только у экспериментальных животных, но и у людей. Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа диагностики никелевой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении.

Решение этой задачи позволяет расширить представление о патогенетических механизмах развития нефропатии на фоне хронической никелевой интоксикации у экспериментальных животных.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение «Способ диагностики никелевой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении» включает следующие существенные признаки: у животных в эритроцитах и почечной ткани определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА) и одновременно активность Na+, K+-АТФ-азы почечной ткани, и при значениях МДА 4,88±0,03 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани соответственно 2, 18±0,03 и 3,57±0,06 нмоль/мг белка и более и значениях активности Na +, K+-АТФ-азы коркового и мозгового вещества почечной ткани 2,21±0,08 и 5,39±0,13 мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно диагностируют никелевую нефропатию.

Между признаками заявляемого изобретения и техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь: при вышеуказанных концентрациях МДА в мембранах эритроцитов и гомогенатах почечной ткани и активности Na+, K+-АТФ-азы коркового и мозгового веществ почечной ткани отмечается нарушение водо- и электролито-выделительной функции почек, т.е. развивается никелевая нефропатия.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанный способ диагностики никелевой нефропатии, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть использована в медицине с получением результата, заключающегося в более точном способе диагностики никелевой нефропатии. Учитывая то, что эритроцит является наиболее доступной моделью для исследования в организме животных и человека и процессы перекисного окисления липидов в нем протекают аналогично тканевым, содержание МДА в эритроцитах можно использовать для диагностики никелевой нефропатии не только у экспериментальных животных, но и у людей. Все это позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Способ осуществляется следующим образом.

Хлорид никеля растворяется в дистиллированной воде таким образом, что на 0,1 мл раствора приходится 0,03 мг никеля для введения подкожно дозы 0,3 мг/кг веса и 0,05 мг для дозировки 0,5 мг/кг веса и 0,08 мг для дозировки 0,8 мг/кг веса. Т.е. 0,3 мг/кг веса = 0,03/100 г/0,1 мл раствора; 0,5 мг/кг веса = 0,05/100 г/0,1 мл раствора; 0,8 мг/кг веса = 0,08/100 г/0,1 мл раствора. На каждые 100 г веса крысы вводится 0,1 мл раствора хлорида никеля подкожно, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Полученный раствор хлорида никеля вводится ежедневно 1 раз в сутки в течение 2 недель.

По истечении срока эксперимента для изучения активности ПОЛ и Na+, К+-АТФ-азы крысы забивались под тиопенталовым наркозом; забирали кровь из сердца с использованием в качестве антикоагулянта 2,8% раствора ЭДТ А. Производилось вскрытие брюшной полости, накладывались зажимы на почечные артерии и извлекались почки, которые для изучения активности Na+, К+-АТФ-азы помещались в ступки со льдом (t = +4°С). Активность перекисного окисления липидов изучалась по концентрации МДА (конечного продукта ПОЛ) по методу Osakava Т., активность Na+, К+АТФ-азы - по приросту неорганического фосфора в среде инкубации.

Пример 1. Крысам-самцам линии Вистар в течение 2 недель ежедневно 1 раз в сутки вводили раствор хлорида никеля подкожно в дозе 0,3; 0,5 и 0,8 мг/кг веса животного. По истечении срока эксперимента изучали функциональное состояние почек: диурез, клубочковую фильтрацию, канальцевую реабсорбцию воды, экскрецию натрия и калия, их фильтрационные заряды и относительную канальцевую реабсорбцию натрия; определяли концентрацию МДА в эритроцитах и клетках почечной ткани, изучали активность Na+, K+АТФ-азы почечной ткани. Сравнение полученных в ходе эксперимента данных проводили с группой интактных животных (контрольная группа).

Полученные данные показали, что происходит нарушение функциональной способности почек, что проявляется достоверным снижением спонтанного диуреза (р<0,001) (табл.1), обусловленным угнетением клубочковой фильтрации при одновременном снижении канальцевой реабсорбции воды во всех группах животных.

Таблица 1 Показатели водо-выделительной функции почек у крыс с введением хлорида никеля подкожно в дозе 0,3 мг/кг; 0,5 мг/кг и 0,8 мг/кг веса в условия спонтанного диуреза (М±m). Группы животных Диурез Клубочковая фильтрация Канальцевая реабсорбция воды мл/ч/100 г мл/ч/100 г % Контрольная группа 0,085±0,003 12,18±0,42 99,41±0,038 Ni - 0,3 мг/кг веса
2 нед. 0,073±0,005 *) 11,21±0,24 *) 99,319±0,016 *) Ni - 0,5 мг/кг веса
2 нед. 0,070±0,004 *) 10,929±0,135 *) 99,302±0,045 Ni - 0,8 мг/кг веса
2 нед. 0,071±0,003 *) 10,012±0,156 *) 99,282±0,032 *) *) - достоверность результатов опытных групп относительно контроля.

Экспозиция никелем в дозе 0,3; 0,5 и 0,8 мг/кг веса животного сопровождается повышением экскреции натрия в результате падения канальцевой реабсорбции данного катиона при подкожном введении хлорида никеля (табл.2). Экскреция калия повышена (р<0,05) за счет увеличения его фильтрационного заряда.

Таблица 2
Изменение электролито-выделительной функции почек у крыс с введением хлорида никеля подкожно в дозе 0,3; 0,5 и 0,8 мг/кг веса в условия спонтанного диуреза (М±m). Группы животных Экскреция Na Фильтрационный заряд Na Реабсорбция Na Экскреция К Фильтрационный заряд К мкмоль/ч/100 г % мкмоль/ч/100 г Контрольная группа 9,38±0,26 1658,16±52,93 99,49±0,092 6,32±0,36 53,85±1,47 Ni - 0,3 мг/кг веса
2 нед. 9,935±0,08 *) 1490,61±33,65 *) 99,29±0,016 *) 6,49±0,073 45,02±0,89 *) Ni - 0,5 мг/кг веса
2 нед. 10,096±0,054 *) 1443,59±17,05 *) 99,30±0,0085 *) 6,578±0,1 70,786±1,676 *) Ni - 0,8 мг/кг веса
2 нед. 10,202±0,18 *) 1519,82±20,43 *) 99,33±0,016 *) 6,961±0,106 71,133±1,013 *) *) - достоверность результатов опытных групп относительно контроля.

Ответственным за процессы реабсорбции натрия является биомеханизм, функционирующий в тонком восходящем колене петли Генле и дистальных канальцах и представленный Na+, К+АТФ-азой. Поэтому нами исследовалась активность Na+, K+АТФ-азы в гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани. Данные показали, что активность Na+, K+АТФ-азы снижается как в корковом (р<0,01), так и в мозговом веществе почечной ткани (р<0,001) (табл.3), причем при более высоких дозах хлорида никеля отмечаются более выраженные изменения.

Таблица №3 Показатели активности Na⁺K⁺-АТФ-азы в гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани при интоксикации, вызванной хлоридом никеля (М±m). Группы животных Корковое вещество Мозговое вещество мкмоль рн/мг белка/ч мкмоль рн/мг белка/ч Контрольная группа 3,0±0,33 6,72±0,35 Ni - 0,3 мг/кг веса
2 нед. 2,21±0,08 *) 5,39±0,13 *) Ni - 0,5 мг/кг веса
2 нед. 2,13±0,08 *) 4,86±0,17 *) Ni - 0,8 мг/кг веса
2 нед. 2,067±0,05 *) 4,35±0,21 *) *) - достоверность результатов опытных групп относительно контроля.

Одним из факторов, от которых зависит активность данного фермента, является состояние липидного микроокружения. Чтобы оценить роль ПОЛ в снижении активности Na+, К+-АТФ-азы в наших экспериментах, проводилось изучение системы свободнорадикального окисления в мембранах эритроцитов, как аналогах тканевых клеток, и в гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани. Было выяснено, что у крыс развивается оксидативный стресс, активируются процессы ПОЛ и наблюдается статистически достоверное увеличение концентрации МДА в эритроцитах (<0,01), а также в клетках коркового (р<0,001) и мозгового (р<0,001) слоев почечной ткани (табл.4).

Таблица 4 Показатели ПОЛ в эритроцитах и почечной ткани (по концентрации МДА) (М±m). Группы животных Концентрация МДА в эритроцитах Концентрация МДА в клетках корк. в-ва почечной ткани Концентрация МДА в клетках мозг. в-ва почечной ткани нмоль/мл нмоль/мг белка нмоль/мг белка Контрольная группа 4,54±0,16 1,26±0,06 2,73±0,1 Ni - 0,3 мг/кг веса
2 нед. 4,88±0,03 *) 2,18±0,03 *) 3,57±0,06 *) Ni - 0,5 мг/кг веса
2 нед. 4,89±0,06 *) 2,58±0,05 *) 4,75±0,04 *) Ni - 0,8 мг/кг веса
2 нед. 5,69±0,06 *) 2,79±0,11 *) 4,95±0,05 *) *) - достоверность результатов опытных групп относительно контроля.

Изменения процессов СРО в эритроцитах и почечной ткани однонаправлены, что позволяет использовать показатель активности ПОЛ в эритроцитах для диагностики никелевой нефропатии у людей.

Таким образом, отмечается активация ПОЛ в эритроцитах и гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани, свидетельством чему является повышение концентрации МДА. В результате активации ПОЛ меняется липидное микроокружение фермента Na+, K+-АТФ-азы. Это приводит к падению его активности, следствием чего и является нарушение электролито-выделительной функции почек. Т.е. использование в качестве диагностического критерия никелевой нефропатии концентрации МДА в эритроцитах и в почечной ткани и активности Na+, K+-АТФ-азы вполне обоснованно.

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании патогенетических механизмов токсического действия тяжелых и цветных металлов, в частности никеля, на функциональное состояние почек. Способ заключается в том, что у животных в эритроцитах и почечной ткани определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА) и одновременно активность Na+, К+-АТФ-азы почечной ткани. При значениях МДА 4,88±0,03 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани соответственно 2,18±0,03 и 3,57±0,06 нмоль/мг белка и более и значениях активности Na+, K+-АТФ-азы коркового и мозгового вещества почечной ткани 2,21±0,08 и 5,39±0,13 мкмоль Рн/мг белка/час и менее соответственно диагностируют нефропатию. При диагностике никелевой нефропатии данным способом учитывают нарушения водо- и электролитовыделительной функции почек, а также патогенетические механизмы этих нарушений. 4 табл.

Способ диагностики никелевой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении, включающий проведение лабораторных исследований, отличающийся тем, что у животных в эритроцитах и почечной ткани определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА) и одновременно активность Na+, K+-АТФ-азы почечной ткани, и при значениях МДА 4,88±0,03 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани соответственно 2,18±0,03 и 3,57±0,06 нмоль/мг белка и более и значениях активности Na+, K+-АТФ-азы коркового и мозгового вещества почечной ткани 2,21±0,08 и 5,39±0,13 мкмоль Рн/мг белка/ч и менее соответственно диагностируют никелевую нефропатию.