СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СВИНЦОВОЙ НЕФРОПАТИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ОТРАВЛЕНИИ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании патогенетических механизмов токсического действия тяжелых металлов, в частности свинца, на функциональное состояние почек.

Почки являются основным органом, экскретирующим токсины, поглощенные организмом. Большое число нефронов обеспечивает обширную поверхность эндотелиальных клеток клубочков и эпителия канальцев для контактов с ними (Османов И.М., 1996). Нарушения функций почек при свинцовой интоксикации могут быть обусловлены непосредственным влиянием свинца на ферментные системы эпителия почечных канальцев, обеспечивающих активную секрецию и реабсорбцию. Тиоловый яд - свинец блокирует сульфгидрильные группы мембранных белков клеток почечных канальцев, что влияет на их функциональную способность. Имеются данные, что нарушение функций почек может служить индикатором вредных воздействий аномальных концентраций тяжелых металлов на организм.

Имеются данные литературы, свидетельствующие о том, что свинец как металл с переменной валентностью способен инициировать процессы свободно радикального окисления (Ежкова Т.С. и соавт., 1987). Некоторые авторы конкретно указывают на то, что свинец способен повышать уровень активных радикалов кислорода (Adonaylo V.N., Oteiza P.I., 1999; Stohs S.J., Bagchi D., 1995). Более того, проникая в эритроциты и нарушая синтез гема, свинец вызывает свинцовую анемию с последующей гемической гипоксией тканевых клеток, что также способствует образованию свободных радикалов кислорода и развитию оксидативного стресса.

Наряду с приведенными данными литературы следует отметить, что недостаточно изученным остается вопрос о патогенетической роли перекисного окисления липидов в развитии нарушений водо- и электролитовыделительной функции почек и активности мембранных ферментов, в частности Na, К-АТФ-азы почечной ткани.

Известен способ диагностики свинцовой нефропатии, основанный на проведении морфологического исследования почечной ткани животных, в результате чего обнаружена гипотрофия и вакуолизация артерий среднего и малого калибра, слизистый отек и мышечная гипертрофия в артериолах, гибель щеточной каймы клеток, внутриядерные включения в проксимальных канальцах (Sanchez-Fructuoso A.I. et al. Experimental lead nephropathy: treatment with calcium disodium ethylenediamine-tetraacetate. // Am. J. kidney Dis. - 2002. - Vol.40 (1). - P.202-204). Данная модель взята нами в качестве прототипа.

Недостатком описываемого способа является то, что, во-первых, не отражены нарушения водо- и электролитовыделительной функции почек при свинцовой интоксикации, во-вторых, не проведен биохимический анализ, раскрывающий патогенетические механизмы этих нарушений.

У заявляемого изобретения имеются следующие существенные признаки: у экспериментальных животных на фоне свинцовой интоксикации при хроническом отравлении изучают активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по концентрации конечного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) в мембранах эритроцитов и почечной ткани и одновременно активность Na⁺, K⁺-АТФ-азы почечной ткани, и при значениях МДА 5,28±0,26 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и мозгового веществ почечной ткани соответственно 2,79±0,27 и 3,69±0,33 нмоль/мг белка и более и значениях активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы коркового и мозгового веществ почечной ткани 2,12±0,29 и 5,49±0,52 мкмоль Р_н/мг белка/час и менее соответственно диагностируют свинцовую нефропатию. Эритроциты являются универсальными представителями тканевых клеток, поэтому изменение содержания МДА в эритроцитах отражает содержание его в других клетках, в частности в клетках почечной ткани. Т.е. изменения концентрации МДА в эритроцитах и клетках почечной ткани однонаправлены, поэтому этот показатель можно использовать для диагностики свинцовой нефропатии не только у экспериментальных животных, но и у людей.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа диагностики свинцовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении.

Решение этой задачи позволяет расширить представление о патогенетических механизмах развития нефропатии на фоне хронической свинцовой интоксикации у экспериментальных животных.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение "Способ диагностики свинцовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении" включает следующие существенные признаки: у животных в эритроцитах и почечной ткани определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА) и одновременно активность Na⁺, K⁺-АТФ-азы почечной ткани, и при значениях МДА 5,28±0,26 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и мозгового веществах почечной ткани соответственно 2,79±0,27 и 3,69±0,33 нмоль/мг белка и более и значениях активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы коркового и мозгового веществах почечной ткани 2,12±0,29 и 5,49±0,52 мкмоль Р_н/мг белка/час и менее соответственно диагностируют свинцовую нефропатию.

Между признаками заявляемого изобретения и техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь: при вышеуказанных концентрациях МДА в мембранах эритроцитов и гомогенатах почечной ткани и активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы коркового и мозгового веществ почечной ткани отмечается нарушение водо- и электролитовыделительной функции почек, т.е. развивается свинцовая нефропатия.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию "новизна".

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанный способ диагностики свинцовой нефропатии, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию "изобретательский уровень".

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть использована в медицине с получением результата, заключающегося в более точном способе диагностики свинцовой нефропатии. Учитывая то, что эритроцит является наиболее доступной моделью для исследования в организме животных и человека, и процессы перекисного окисления липидов в нем протекают аналогично тканевым, содержание МДА в эритроцитах можно использовать для диагностики свинцовой нефропатии не только у экспериментальных животных, но и у людей. Все это позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию "промышленная применимость".

Способ осуществляется следующим образом. Ацетат свинца растворяется в дистиллированной воде таким образом, что на 0,2 мл раствора приходится 1,0 мг свинца для введения через зонд дозы 10 мг/кг веса (10,0 мг/кг веса =1,0/100 г/0,2), и на 0,1 мл раствора приходится 1,0 мг для подкожного введения этой же дозировки (10,0 мг/кг веса =1,0/100 г/0,1 мл). На каждые 100 г веса крысы вводится 0,2 мл раствора ацетата свинца через зонд и 0,1 мл раствора подкожно, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Полученный раствор ацетата свинца вводится ежедневно 1 раз в сутки в течение 16-18 дней.

По истечении срока эксперимента для изучения активности ПОЛ и Na⁺, K⁺-АТФ-азы крысы забивались под тиопенталовым наркозом; забирали кровь из сердца с использованием в качестве антикоагулянта 2,8% раствора ЭДТА. Производилось вскрытие брюшной полости, накладывались зажимы на почечные артерии и извлекались почки, которые для изучения активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы помещались в ступки со льдом (t=+4°С). Активность перекисного окисления липидов изучалась по концентрации МДА (конечного продукта ПОЛ) по методу Osacawa Т., активность Na⁺, K⁺-АТФ-азы - по приросту неорганического фосфора в среде инкубации.

Пример 1. Крысам-самцам линии Вистар в течение 16-18 дней ежедневно 1 раз в сутки вводили раствор ацетата свинца через зонд в желудок и подкожно в дозе 10 мг/кг веса животного. По истечении срока эксперимента изучали функциональное состояние почек: диурез, клубочковую фильтрацию, канальцевую реабсорбцию воды, экскрецию натрия и калия, их фильтрационные заряды и относительную канальцевую реабсорбцию натрия; определяли концентрацию МДА в эритроцитах и клетках почечной ткани, изучали активность Na⁺, K⁺-АТФ-азы почечной ткани. Сравнение полученных в ходе эксперимента данных проводили с группой интактных животных (контрольная группа).

Полученные данные показали, что происходит нарушение функциональной способности почек, что проявляется увеличением спонтанного диуреза (р<0,001) (табл.1), обусловленного снижением канальцевой реабсорбции воды (р<0,05 при пероральном введении, р<0,001 при подкожном). При подкожном введении данной дозировки повышению диуреза способствует также достоверное падение клубочковой фильтрации (р<0,05).

Таблица 1.
Показатели водовыделительной функции почек у крыс с введением ацетата свинца per os в дозе 10 мг/кг веса в условиях спонтанного диуреза (М±m).Группы животныхДиурезКлубочковая фильтрацияКанальцевая реабсорбция воды мл/ч/100 гмл/ч/100 г%Контрольная группа 0,085±0,00312,18±0,4299,41±0,038Pb - 10 мг/кг веса, ч-з зонд0,11±0,005*)12,1±0,2499,2±0,088*)Pb - 10 мг/кг веса, п/к0,12±0,009*)10,94±0,47*)98,83±0,083*)*) - достоверность результатов опытной группы относительно контроля.

Экспозиция свинцом в дозе 10 мг/кг веса животного сопровождается повышением экскреции натрия (р<0,001) в результате падения канальцевой реабсорбции данного катиона (р<0,02 при пероральное введении ацетата свинца, р<0,02 при подкожном) (табл.2). Экскреция калия повышена при подкожном введении данной дозировки (р<0,05) за счет увеличения его фильтрационного заряда.

Таблица 2.
Изменение электролитовыделительной функции почек у крыс с введением ацетата свинца per os в дозе 10 мг/кг веса в условиях спонтанного диуреза (М±m).Группы животныхЭкскреция NaФильтрационный заряд NaРеабсорбция NaЭкскреция КФильтрационный заряд К мкмоль/ч/100 г%мкмоль/ч/100 гКонтрольная группа9,38±0,261658,16±52,9399,49±0,0926,32±0,3653,85±1,47Pb - 10 мг/кг веса, ч-з зонд12,14±0,66*)1677,94±71,9699,16±0,1*)6,7±0,3448,81±3,67Pb - 10 мг/кг веса, п/к12,82±0,57*)1500,28±48,94*)99,14±0,094 *)7,64±0,33 *)64,87±2,65*)*) - достоверность результатов опытной группы относительно контроля.

Ответственным за процессы реабсорбции натрия является биомеханизм, функционирующий в тонком восходящем колене петли Генле и дистальных канальцах и представленный Na⁺, K⁺-АТФ-азой. Поэтому нами исследовалась активность Na⁺, K⁺-АТФазы в гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани. Данные показали, что активность Na⁺, K⁺-АТФ-азы снижается как в корковом (р<0,05 при пероральной затравке, р<0,01 при подкожной), так и в мозговом веществе почечной ткани (р<0,001 при обоих путях введения ацетата свинца) (табл.3), причем при подкожном введении ацетата свинца отмечаются более выраженные изменения.

Таблица №3.
Показатели активности Na⁺K⁺-АТФ-азы в гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани при свинцовой интоксикации (М±м).Группы животныхКорковое веществоМозговое вещество мкмоль Р_н/мг белка/часмкмоль Р_н/мг белка/часКонтрольная группа3,0±0,336,72±0,35Pb - 10 мг/кг веса, ч-з зонд2,12±0,29*)4,82±0,32*)Pb - 10 мг/кг веса, п/к1,93±0,17*)4,42±0,26*)*) - достоверность результатов опытной группы относительно контроля.

Одним из факторов, от которых зависит активность данного фермента, является состояние липидного микроокружения. Чтобы оценить роль ПОЛ в снижении активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы в наших экспериментах, проводилось изучение системы свободнорадикального окисления в мембранах эритроцитов, как аналогах тканевых клеток, и в гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани. Было выяснено, что у крыс развивается оксидативный стресс, активируются процессы ПОЛ и наблюдается статистически достоверное увеличение концентрации МДА в эритроцитах (р<0,01 при подкожном введении ацетата свинца, р<0,001 при пероральном), а также в клетках коркового (р<0,001) и мозгового (р<0,001) слоев почечной ткани (табл.4).

Таблица 4.
Показатели ПОЛ в эритроцитах и почечной ткани (по концентрации МДА) (М±m).Группы животныхКонцентрация МДА в эритроцитахКонцентрация МДА в клетках корк. в-ва почечной тканиКонцентрация МДА в клетках мозг. в-ва почечной ткани нмоль/млнмоль/мг белканмоль/мг белкаКонтрольная группа4,54±0,161,26±0,062,73±0,1Pb - 10 мг/кг веса, ч-з зонд5,32±0,18*)2,79±0,27*)4,08±0,2*)Pb - 10 мг/кг веса, п/к6,09±0,23*)2,82±0,046*)4,21±0,1*)*) - достоверность результатов опытной группы относительно контроля.

Изменения процессов СРО в эритроцитах и почечной ткани однонаправлены, что позволяет использовать показатель активности ПОЛ в эритроцитах для диагностики свинцовой нефропатии у людей.

Таким образом, отмечается активация ПОЛ в эритроцитах и гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани, свидетельством чему является повышение концентрации МДА. В результате активации ПОЛ меняется липидное микроокружение фермента Na⁺, K⁺-АТФ-азы. Это приводит к падению его активности, следствием чего и является нарушение электролитовыделительной функции почек. Т.е. использование в качестве диагностического критерия свинцовой нефропатии концентрации МДА в эритроцитах и в почечной ткани и активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы вполне обоснованно.

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании патогенетических механизмов токсического действия тяжелых металлов, в частности свинца, на функциональное состояние почек и касается способа диагностики свинцовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении. Согласно способу у животных в эритроцитах и почечной ткани определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА) и одновременно активность Na⁺, K⁺-АТФ-азы почечной ткани, и при значениях МДА 5,28±0,26 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и мозгового веществах почечной ткани соответственно 2,79±0,27 и 3,69±0,33 нмоль/мг белка и более и значениях активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы коркового и мозгового веществах почечной ткани 2,12±0,29 и 5,49±0,52 мкмоль Р_н/мг белка/час и менее соответственно диагностируют свинцовую нефропатию. Технический результат: диагностика свинцовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении, учитывающая нарушения водо- и электролитовыделительной функции почек при свинцовой интоксикации и патогенетические механизмы этих нарушений. 4 табл.

Способ диагностики свинцовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении, включающий проведение лабораторных исследований, отличающийся тем, что у животных в эритроцитах и почечной ткани определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА) и одновременно активность Na⁺, К⁺-АТФ-азы почечной ткани и при значениях МДА (5,28±0,26) нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани соответственно (2,79±0,27) и (3,69±0,33) нмоль/мг белка и более и значениях активности Na⁺, К⁺-АТФ-азы коркового и мозгового вещества почечной ткани (2,12±0,29) и (5,49±0,52) мкмоль Р_н/мг белка/ч и менее соответственно диагностируют свинцовую нефропатию.