СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КОБАЛЬТОВОЙ НЕФРОПАТИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ОТРАВЛЕНИИ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/48 A61P39/00 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании патогенетических механизмов токсического действия тяжелых и цветных металлов, в частности кобальта, на развитие нефропатий.

Почки являются основным органом, экскретирующим токсины, поглощенные организмом. Большое число нефронов обеспечивает обширную поверхность эндотелиальных клеток клубочков и эпителия канальцев для контактов с ними. Кроме того, в атмосфере кобальт способен образовывать аэрозоли, которые оседают на волосяном и кожном покровах и всасываются непосредственно в кровь (Игнатова М.С., Харина Е.А., Солбирова Т.Н. и др., 2004). Нарушения функции почек при кобальтовой интоксикации могут быть обусловлены непосредственным влиянием кобальта на ферментные системы эпителия почечных канальцев, обеспечивающих активную секрецию и реабсорбцию. Имеются данные, что изменение функции почек может служить индикатором вредных воздействий аномальных концентраций тяжелых металлов на организм, свидетельствующих о том, что кобальт способен инициировать процессы свободнорадикального окисления (Рослая Н.А. 2004 г.). Некоторые авторы конкретно указывают на то, что кобальт как ион с переменной валентностью способен повышать уровень активных радикалов кислорода (Чурилов Г.И. и соавт. 2007 г.).

Наряду с приведенными данными литературы следует отметить, что недостаточно изученным остается вопрос о патогенетической роли перекисного окисления липидов в развитии нарушений водо- и электролитовыделительной функции почек и активности мембранных ферментов, в частности Na, K-АТФ-азы почечной ткани и сосудистых осложнений в микроциркуляторном русле.

Известен способ диагностики токсической нефропатии, основанный на проведении исследования функциональных и метаболических изменений функции почек на фоне интоксикации солями тяжелых и цветных металлов (Ф.С.Дзугкоева, С.Г.Дзугкоев, Е.А.Такоева, А.И.Тедтоева, Ж.Р.Битарова, И.В.Можаева. Влияние солей тяжелых и цветных металлов на водо- и электролитовыделительную функцию почек. // Фундаментальные исследования, №9 2009 г., С.40-42). Данный способ взят нами в качестве прототипа.

Недостатком описываемого способа является то, что, во-первых, отражены только нарушения функционального состояния почек при токсических нефропатиях, во-вторых, не описывается патогенетический механизм, приводящий к повреждению функции почек, в-третьих, не проведен патобиохимический анализ роли сопряженных процессов перекисного окисления липидов и антиокислительной системы клетки в этих нарушениях, в-четвертых, отсутствуют данные о характере гемодинамических изменений в сосудах микроциркуляции на фоне интоксикации хлоридом кобальта.

У заявляемого изобретения имеются следующие существенные признаки: у экспериментальных животных на фоне кобальтовой интоксикации при хроническом отравлении изучают активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по концентрации конечного продукта ПОЛ-малонового диальдегида (МДА) в мембранах эритроцитов и почечной ткани и одновременно активность Na⁺, K⁺-АТФ-азы почечной ткани; при значениях МДА 4,96±0,14 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и мозгового веществ почечной ткани соответственно 2,49±0,12 и 4,56±0,06 нмоль/мг белка и более и значениях активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы коркового и мозгового веществ почечной ткани 2,08±0,03 и 5,28±0,18 мкмоль Р_н/мг белка/час и менее соответственно диагностируют кобальтовую нефропатию. Эритроциты являются универсальными представителями тканевых клеток, поэтому изменение содержания МДА в эритроцитах отражает содержание его в других клетках, в частности в клетках почечной ткани. Т.е. изменение концентрации МДА в эритроцитах и клетках почечной ткани однонаправленное, поэтому этот показатель можно использовать для диагностики кобальтовой нефропатии не только у экспериментальных животных, но и у людей. Патогенетической основой развития кобальтовой нефропатии является изменение структур и эндотелиоцитов сосудистой стенки в результате усиления интенсивности ПОЛ, которое инициируется активными метаболитами кислорода, и, как следствие этого, развитие сосудистых осложнений в микроциркуляторном звене. Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа диагностики кобальтовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении.

Решение этой задачи позволяет расширить представление о патогенетических механизмах развития нефропатии на фоне хронической кобальтовой интоксикации у экспериментальных животных.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение «Способ диагностики кобальтовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении» включает следующие существенные признаки: у животных в эритроцитах и почечной ткани определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА) и одновременно активность Na⁺, K⁺-АТФ-азы почечной ткани; при значениях МДА 4,96±0,14 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и мозгового веществ почечной ткани соответственно 2,49±0,12 и 4,56±0,06 нмоль/мг белка и более и значениях активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы коркового и мозгового веществ почечной ткани 2,08±0,03 и 5,28±0,18 мкмоль Р_н/мг белка/час и менее соответственно, а также при нарушениях микрогемодинамики диагностируют кобальтовую нефропатию.

Между признаками заявляемого изобретения и техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь. При вышеуказанных концентрациях МДА в мембранах эритроцитов и гомогенатах почечной ткани и активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы коркового и мозгового веществ почечной ткани отмечается нарушение водо- и электролитовыделительной функции почек, а также сдвиги показателей перфузии, т.е. развивается кобальтовая нефропатия.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения неизвестна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанный способ диагностики кобальтовой ангионефропатии, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть использована в медицине с получением результата, заключающегося в более точном способе диагностики кобальтовой нефропатии. Учитывая то, что эритроцит является наиболее доступной моделью для исследования в организме животных и человека и процессы перекисного окисления липидов в нем протекают аналогично тканевым, содержание МДА в эритроцитах можно использовать для диагностики кобальтовой нефропатии не только у экспериментальных животных, но и у людей. Все это позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Способ осуществляется следующим образом. Хлорид кобальта растворяется в дистиллированной воде таким образом, что на 0,1 мл раствора приходится 0,2; 0,4; 0,6 мг для дозировки 2; 4; 6 мг/кг веса соответственно, т.е. 2 мг/кг веса = 0,2/100 г/0,1 мл раствора, 4 мг/кг веса = 0,4/100 г/0,1 мл раствора, 6 мг/кг веса = 0,6/100 г/0,1 мл раствора. На каждые 100 г веса крысы вводится 0,1 мл раствора хлорида кобальта подкожно, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Полученный раствор хлорида кобальта вводится парентерально ежедневно 1 раз в сутки в течение 1 месяца.

По истечении срока эксперимента для изучения активности ПОЛ и Na⁺, К⁺-АТФ-азы крысы забивались под тиопенталовым наркозом; забирали кровь из сердца с использованием в качестве антикоагулянта 2,8% раствора ЭДТ А. Производилось вскрытие брюшной полости, накладывались зажимы на почечные артерии и извлекались почки, которые для изучения активности Na⁺, K⁺-ATФ-азы помещались в ступки со льдом (t=+4°C). Активность перекисного окисления липидов изучалась по концентрации МДА (конечного продукта ПОЛ) по методу Asakava Т., активность Na⁺, K⁺-АТФ-азы - по приросту неорганического фосфора в среде инкубации.

Пример 1. Тридцати крысам-самцам линии Вистар в течение 1 месяца ежедневно 1 раз в сутки парентерально вводили раствор хлорида кобальта подкожно в дозе 2; 4; 6 мг/кг веса животного. По истечении срока эксперимента изучали функциональное состояние почек: диурез, клубочковую фильтрацию, канальцевую реабсорбцию воды, экскрецию натрия и калия, их фильтрационные заряды и относительную канальцевую реабсорбцию натрия; определяли концентрацию МДА в эритроцитах и клетках почечной ткани, изучали активность Na⁺, K⁺-АТФ-азы почечной ткани, показатели гемодинамики в микроциркуляторном русле. Сравнение полученных в ходе эксперимента данных проводили с группой интактных животных (контрольная группа).

Полученные данные показали, что происходит нарушение функциональной способности почек, что проявляется достоверным снижением спонтанного диуреза (p<0,001) (табл.1), обусловленное угнетением клубочковой фильтрации при одновременном снижении канальцевой реабсорбции воды во всех группах животных.

Таблица 1 Показатели водовыделительной функции почек у крыс с введением хлорида кобальта подкожно в дозе 2; 4; 6 мг/кг веса в условиях спонтанного диуреза (M±m). Группы животных Диурез Клубочковая фильтрация Канальцевая реабсорбция воды мл/ч/100 г мл/ч/100 г % Контрольная группа 0,091±0,003 14,69±0,40 99,37±0,037 Co - 2 мг/кг веса
1 мес 0,075±0,001
p<0.001 11,2±0,14
p<0.001 99,27±0,11
p<0.001 Co - 4 мг/кг веса
1 мес 0,071±0,001
p<0.02 10,84±0,11
p<0.001 99,07±0,02
p<0.01 Co - 6 мг/кг веса
1 мес 0,015±0,0003
p<0.001 10,23±0,02
p<0.001 99,03±0,15
p<0.001 p - достоверность результатов опытных групп относительно контроля

Экспозиция кобальтом в дозе 2-6 мг/кг веса животного сопровождается снижением экскреции натрия в результате падения канальцевой реабсорбции данного катиона при подкожном введении хлорида кобальта (табл.2).

Таблица 2 Изменение электролитовыделительной функции почек у крыс с введением хлорида кобальта подкожно в дозе 2; 4; 6 мг/кг веса в условиях спонтанного диуреза (M±m). Группы животных Экскреция Na Фильтрацион
ный заряд Na Реабсорбция Na Экскреция K Фильтраци
онный заряд K мкмоль/ч/100 г % мкмоль/ч/100 г Контрольная группа 9,38±0,26 1658±52,93 99,49±0,092 6,32±0,36 53,85±1,47 Co - 2 мг/кг веса
1 мес 10,21±0,18
p<0.001 1481,55±21,56
p<0.001 99,28±0,01
p<0.01 7,02±0,13
p<0.001 48,88±4,48
p<0.02 Co - 4 мг/кг веса
1 мес 10,41±0,09
p<0.01 1551,76±13,3
p<0.05 99,16±0,02
p<0.001 7,5±0,14
p<0.02 45,43±0,87
p<0.01 Co - 6 мг/кг веса
1 мес 10,16±0,08 ρ<0.001 1349,08±2,36 ρ<0.001 91,58±0,05 ρ<0.001 6,84±0,12 ρ<0.001 41,59±0,49 ρ<0.001 p - достоверность результатов опытных групп относительно контроля

Экскреция калия снижена (p<0,001) за счет снижения его фильтрационного заряда. Что касается данных при введении хлорида кобальта в дозе 6 мг/кг, то отмечается задержка Na и K в организме, т.е. снижение натрий-калийуреза.

Ответственным за процессы реабсорбции натрия является биомеханизм, функционирующий в тонком восходящем колене петли Генли и дистальных канальцах и представлен Na⁺, K⁺-АТФ-азой. Поэтому нами исследовалась активность Na⁺, K⁺-АТФ-азы в гомогенатах коркового и мозгового веществ почечной ткани. Данные показали, что активность Na⁺, K⁺-АТФ-азы снижается как в корковом (p<0,01), так и в мозговом веществе почечной ткани (p<0,001) (табл.3), причем при более высоких дозах хлорида кобальта отмечаются более выраженные изменения.

Таблица №3 Показатели активности Na⁺K⁺-ATФ-азы в гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани при интоксикации, вызванной хлоридом кобальта (M±m).   Корковое вещество Мозговое вещество Группы животных мкмоль Р_н/мг белка/час мкмоль P_н/мг белка/час Контрольная группа 3,12±0,33 6,68±0,29 Co - 2 мг/кг веса
1 мес 2,08±0,03 5,28±0,18 p<0.01 p<0.001 Co - 4 мг/кг веса
1 мес 1,83±0,12 4,82±0,03 p<0.01 p<0.001 Co - 6 мг/кг веса
1 мес 1,31±0,14 3,92±0,02 p<0.001 p<0.001 p - достоверность результатов опытных групп относительно контроля

Одним из факторов, от которых зависит активность данного фермента, является состояние липидного микроокружения. Чтобы оценить роль ПОЛ в снижении активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы в наших экспериментах, проводилось изучение системы свободнорадикального окисления в мембранах эритроцитов, как аналогах тканевых клеток, и в гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани. Было выяснено, что у крыс развивается оксидативный стресс, активируются процессы ПОЛ и наблюдается статистически достоверное увеличение концентрации МДА в эритроцитах (<0,001), а также в клетках коркового (p<0,001) и мозгового (p<0,001) слоев почечной ткани (табл.4).

Таблица 4 Показатели ПОЛ в эритроцитах и почечной ткани (по концентрации МДА) (M±m). Группы животных Концентрация МДА в эритроцитах Концентрация МДА в клетках корк. в-ва почечной ткани Концентрация МДА в клетках мозг, в-ва почечной ткани нмоль/мл нмоль/мг белка нмоль/мг белка Контрольная группа 4,54±0,16 1,26±0,06 2,73±0,1 Co - 2 мг/кг веса 4,96±0,14 2,49±0,12 4,56±0,06 1 мес p<0.02 p<0.01 p<0.001 Co - 4 мг/кг веса 5,16±0,03 2,69±0,02 4,79±0,04 1 мес p<0.01 p<0.001 p<0.001 Co - 6 мг/кг веса 5,32±0,06 2,87±0,06 5,25±0,08 1 мес p<0.001 p<0.001 p<0.001 p - достоверность результатов опытных групп относительно контроля

Изменения процессов СРО в эритроцитах и почечной ткани однонаправленные, что позволяет использовать показатель активности ПОЛ в эритроцитах для диагностики кобальтовой нефропатии у людей.

Таким образом, отмечается активация ПОЛ в эритроцитах и гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани, свидетельством чему является повышение концентрации МДА. В результате активации ПОЛ меняется липидное микроокружение фермента Na⁺, K⁺-АТФ-азы. Это приводит к падению его активности, следствием чего и является нарушение электролитовыделительной функции почек. Т.е. использование в качестве диагностического критерия кобальтовой нефропатии концентрации МДА в эритроцитах и в почечной ткани и активности Na⁺, K⁺-АТФ-азы вполне обоснованно.

Одним из факторов нарушения микроциркуляции в нефроне и периферических кровеносных сосудах является ПОЛ, продукты которого изменяют эндотелийзависимую регуляцию сосудистого тонуса. Патогенетической основой развития кобальтовой нефропатии и является изменение структур и эндотелиоцитов сосудистой стенки в результате усиления интенсивности ПОЛ, которое инициируется активными метаболитами кислорода (O₂ ^-. - супероксиданионрадикал, радикал гидроксила OH^-, H₂O₂ - перекись водорода и др.).

Гемодинамику определяли методом ультразвуковой высокочастотной доплерографии. Согласно формуле Доплера, величина доплеровского сдвига, т.е. разница между частотами передаваемого и принятого от движущегося объекта сигналов, пропорциональна скорости движения объекта, она представляется на дисплее прибора в виде частот доплеровского спектра. Поэтому мы исследовали кровоток в микроциркуляторном звене:

изучали кровоток в различных точках локации тканей - микроциркуляторном русле - прозвучиванием датчиком 10 МГц, работающим по принципу «слепого» доплера ультразвукового портативного доплерографа ММ-Д-Ф фирмы «Минимакс» СП(б) у наркотизированных животных. В качестве точек локации автора использовали 6 основных:

- ткани слева и справа от основания хвоста - ХЛ и ХП;

- область передних лап (правая передняя - ПП и левая передняя - ЛП);

- область задних лап (правая задняя - ПЗ и левая задняя - ЛЗ).

Кроме того, мы оценивали среднее значение для показателей МЦ по всем точкам перфузии, т.к. во всех интактных тканях должны происходить однонаправленные изменения.

Мы также оценивали среднее значение для показателей МЦ по артериям.

Показатели МЦ:

М - средняя скорость кровотока в см/с;

S - систолическая скорость кровотока в см/с;

D - диастолическая скорость кровотока в см/с;

Pi - пульсаторный индекс (индекс Гослинга) - индекс пульсации, отражает упругоэластические свойства сосудов и меняется с возрастом в см/с;

GD - градиент давления в мм рт.ст.;

Рассчитывали по формуле реографический индекс (Ri) в у.ед.

При анализе перфузии тканей при интоксикации хлоридом кобальта в дозе 2-6 мг/кг в течение 1 месяца во всех точках локации выявлено снижение средней скорости кровотока (M) преимущественно за счет снижения систолической (S) и диастолической (D) скоростей кровотока (табл.5).

Таблица 5 Динамика изменения показателей гемодинамики в микроциркуляторном русле при хронической интоксикации хлоридом кобальта в эксперименте у крыс (M±m). показатели статистика контроль 2 мг/кг
1 мес 4 мг/кг
1 мес 6 мг/кг
1 мес M M 2,86 2,8 2,58 2,01 ±m ±0,54 ±0,1* ±0,05*** ±0,14**** S M 11,71 11,53 11,38 10,88 ±m ±1,08 ±0,19*** ±0,07** ±0,06**** D M 5,36 3,23 2,56 2,15 ±m ±0,807 ±0,23*** ±0,11*** ±0,07**** Pi M 6,36 7,06 7,7 8,46 ±m ±1,204 0,08** 0,05*** 0,05**** GD M 0,04 0,03 0,021 0,013 ±m ±0,01 0,002** 0,001*** 0,002**** Ri M 0,53 0,71 0,77 0,8 ±m ±0,02 0,01*** 0,009*** 0,006**** **** - p<0,001 *** - p<0,01 ** - p<0,02 * - p<0,05 достоверность относительно нормы

Реографические показатели характеризуются повышением Индекса Гослинга (Pi), отражающего повышение упругоэластических свойств (плотности) сосудистой стенки и снижением градиента давления в сосудах микроциркуляторного русла. Индекс Пурсело (реографический индекс - Ri), который отражает общее периферическое сосудистое сопротивление, повышается через 1 месяц при хронической кобальтовой интоксикации.

Таким образом, в динамике развития хронической интоксикации хлоридом кобальта у экспериментальных животных в дозе 2-6 мг/кг веса в течение 1 месяца развились разнонаправленные сдвиги показателей перфузии. Снижение средней и систолической скоростей кровотока в сосудах микроциркуляторного русла отражает уменьшение скорости тканевого обмена (перфузии), что соответствует данным ряда авторов (Козлов В.И., 2003, Поленов С.А., 2007, Knotzer Н., 2007), объясняется утолщением базальных мембран сосудов, пролиферацией и набуханием эндотелиальных клеток. Все эти изменения микрогемодинамики направлены на улучшение доставки кислорода и метаболитов в микроциркуляторное русло периферических тканей.

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании патогенетических механизмов токсического действия кобальта на функциональное состояние почек. Способ диагностики кобальтовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении включает определение у животных в эритроцитах и почечной ткани концентрации малонового диальдегида (МДА) и одновременно активности Na⁺, К⁺-АТФ-азы почечной ткани; при значениях МДА от 4,96±0,03 до 5,32±0,06 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, а в клетках коркового и мозгового веществ почечной ткани соответственно от 2,49±0,12 до 2,87±0,06 и от 4,56±0,06 до 5,25±0,08 нмоль/мг белка и более и значениях активности Na+, К+-АТФ-азы коркового и мозгового веществ почечной ткани от 2,08±0,03 до 1,31±0,14 и от 5,28±0,18 до 3,92±0,02 мкмоль Р_н/мг белка/час и менее соответственно диагностируют кобальтовую нефропатию. Способ позволяет расширить представление о патогенетических механизмах развития нефропатии на фоне хронической кобальтовой интоксикации у экспериментальных животных. 5 табл.

Способ диагностики кобальтовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении, включающий проведение лабораторных исследований, отличающийся тем, что у животных в эритроцитарной и почечной ткани определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА) и одновременно активность Na, К-АТФ-азы почечной ткани, и при значениях МДА от 4,96±0,03 до 5,32±0,06 нмоль/мл эритроцитарной массы, а в клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани соответственно от 2,49±0,12 до 2,87±0,06 и от 4,56±0,06 до 5,25±0,08 нмоль/мл белка и более и значениях активности Na, К-АТФ-азы коркового и мозгового вещества почечной ткани от 2,08±0,03 до 1,31±0,14 и от 5,28±0,18 до 3,92±0,02 мкмоль P_H/мг белка/ч соответственно диагностируют кобальтовую нефропатию.