СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ Российский патент 2010 года по МПК C12P7/16 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения органических растворителей - бутанола, ацетона и этанола путем биосинтеза углеводсодержащих материалов.

Микробиологическим путем указанные растворители начали производить в 10-х годах XX века с использованием бактерии вида Clostridium acetobutylicum в основном из пищевого сырья (глюкозы сахарного тростника, свеклы, кукурузы, пшеницы, маниоки).

При сбраживании глюкозы бактерии этого рода синтезируют одновременно бутанол, ацетон и этанол, с процентным соотношением примерно 60:30:10 (соответственно). Это соотношение не является строго постоянным и может незначительно изменяться в сторону увеличения выхода того или иного продукта брожения.

Представляется интересным иметь возможность влиять на соотношение растворителей для целей преимущественного получения того или иного из них, в частности бутанола или ацетона. Доля этанола в процессе незначительна, тем более что существуют иные способы его получения.

При этом известно, что на соотношение целевых продуктов оказывают влияние различные факторы. В значительной степени на соотношение растворителей влияет состав исходного сырья, используемого для брожения. Так, при культивировании на мучных средах различные штаммы Clostridium acetobutylicum синтезируют бутанол, ацетон, этанол в соотношении 63:26:11 соответственно. (Корнеева О.С., Жеребцов Н.А. и др. Роль амилолитических ферментов Clostridium acetobutylicum в биосинтезе растворителей. Биотехнология, 1986 г., №3, стр.133-136).

Известно также, что снижение температуры брожения с 30°С до 24°С в течение 16 часов приводит к следующему соотношению растворителей: бутанол 77,6%, ацетон 19,1% и этанол 3,3% (US 2198104). Однако указанное снижение температуры значительно замедляет скорость реакции брожения, приводит к образованию побочных продуктов и уменьшает общий выход растворителей.

Описан (CN 101250496, 27.08.2008) штамм Clostridium acetobutylicum SB-1 CGMCC No. 2287, полученный методами генной инженерии, при использовании которого соотношение органических растворителей в процессе биосинтеза может смещаться в сторону увеличения содержание бутанола до 68-75%. Однако известно, что относительный недостаток генетических инструментов для манипуляций с метаболизмом Clostridium acetobutylicum и ее медленный рост не позволяют добиться ощутимых результатов при практическом использовании. (Eric J. Steen, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial Cell Factories, 7:36, 03.12.2008).

Таким образом, авторами не были обнаружены технические решения, позволяющие в значительной степени регулировать соотношение растворителей в процессе биосинтеза углеводсодержащих материалов, тем более изменять его во время самого процесса.

Технической задачей настоящего изобретения является создание способа, который позволил бы изменять соотношение органических растворителей - бутанола, ацетона и этанола в процессе биосинтеза углеводсодержащих материалов для преимущественного получения того или иного органического растворителя.

Для решения этой задачи предложен способ получения органических растворителей, предусматривающий биосинтез углеводсодержащего сырья с помощью бактерий вида Clostridium acetobutylicum, в котором осуществляют изменение соотношения получаемых органических растворителей путем воздействия на продуцирующую культуру понижением давления.

При этом предпочтительно указанное воздействие осуществлять на всю культуру в ферментере в процессе биосинтеза углеводсодержащего сырья, но возможно воздействие осуществлять на часть культуры вне процесса биосинтеза углеводсодержащего сырья, отводя часть культуральной жидкости в отдельную емкость, с последующим возвращением ее в процесс.

Предпочтительно понижать давление в ферментере периодически.

Оптимальным является в процессе понижения давления осуществлять отгонку образующихся растворителей, при этом, что понижение давления и отгонку начинают при достижении уровня концентрации растворителей в культуральной среде, приближающейся к ингибирующей для продуцирующей культуры, оптимально - по достижению уровня концентрации растворителей в культуральной среде - 0,6-1,2%, и продолжают до достижения уровня концентрации растворителей в культуральной среде - 0,5-0,2%.

Во время экспериментальных исследований авторами неожиданно было обнаружено, что при создании отрицательного (относительно атмосферного) давления над поверхностью культуральной среды в ферментере классическое соотношение растворителей 60:30:10 (бутанол, ацетон, этанол) изменяется. Возможным объяснением этого является действие переменного давления на биологические системы, что влечет за собой изменение микроокружения клеточных мембран, приводящее к нарушению процессов переноса веществ через мембраны, изменению скоростей ферментативных процессов в клетке, возникновению и развитию репаративных реакций, сопровождаемых новыми синтезами (Акопян В.Б., Коржевенко Г.Н., Шангин-Березовский Г.Н. Скрытый резерв роста и развития живых систем. Вестник сельскохозяйственной науки, 1988, №4, (380), с.96-105).

С практической точки зрения предлагаемый способ позволяет вести процесс биосинтеза с преимущественным синтезом бутанола, как наиболее ценного из органических растворителей, а при необходимости решить задачу получения ацетона для нужд собственного производства. Важным является тот факт, что соотношение растворителей возможно изменять в процессе сбраживания.

Важно также отметить, что, как показали исследования авторов, соотношение образующихся растворителей, зафиксированное во время понижения давления, сохраняется таковым примерно и в течение последующих 20 часов после предыдущего понижения давления.

В данной связи возможным становится вариант осуществления изобретения, при котором воздействие понижением давления осуществляют на часть культуры вне процесса биосинтеза углеводсодержащего сырья с возвращением ее в процесс, что значительно упрощает процесс и его конструктивное оформление.

В этом случае часть культуральной жидкости из ферментера направляют в отдельную емкость, где осуществляют понижение давления, затем культуральную жидкость возвращают обратно в ферментер, при этом в ферментере вся культура будет продуцировать растворители с соотношением, зафиксированным в отдельной емкости во время понижения давления.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

В ферментер вносят подготовленную стандартным способом углеводо-минеральную смесь (раствор минеральных солей, необходимый набор витаминов и один из возможных источников углерода: глюкозу, маннозу, ксилозу, ферментолизат не пищевых полисахаридов растений в концентрации 2-4%; затем вносят инокулят бактерий Clostridium acetobutylicum, например, с плотностью клеток 1-2 млрд/мл. Через 30 мин после засева начинается интенсивное выделение газов брожения, через 5-6 часов - синтез органических кислот и на 10-12 часах - интенсивный синтез органических растворителей, скорость которого достигает максимума к 28-36 часу. На тот момент концентрация клеток бактерий в ферментере также максимальна - 3·10⁹ клеток/мл суспензии.

При концентрации органических растворителей в среде 0,6-1,2% снижают давление в ферментере на 0,3-1,0 часа до 0,80-0,95 кг/см², что приводит к изменению соотношения растворителей 60:30:10 на соотношение 70:21:9. Через 6-8 часов осуществляют повторное понижение давления на 0,3-1,0 часа до 0,80-0,95 кг/см², что приводит к дальнейшему изменению соотношения растворителей до 90:9:1.

После удаления образующихся газов вводят в ферментер питательную среду, с содержанием 50 г глюкозы. Раз в три дня в питательную среду добавляют 28 г дрожжевого автолизата.

Изобретение поясняется примерами, которые не носят ограничивающего характера.

Пример 1. В предварительно стерилизованный ферментер с рабочим объемом 3 л вводят 2,5 л 4%-ного раствора глюкозы, 120 г муки, 300 мл инокулята, состоящего из муки (40 г/л), воды и бактерий Clostridium acetobutylicum CK 425, регистрационный номер ВКПМ В-4786 с плотностью 1-2 млрд/мл. Осуществляют ацетон-бутанол-этаноловое брожение при температуре 37°С. Ферментацию продолжают в течение 72 часов. После 72 часов процесс ферментации прекращают и конденсацией отогнанных паров получают в среднем 250 мл раствора (органические растворители 17,5 мл), содержащего 5% бутанола, 1,5% ацетона и 0,5% этанола с соотношением растворителей 60:30:10.

После удаления бутанола и сопутствующих газов вводят в ферментер питательную среду, с содержанием 50 г глюкозы. Раз в три дня в питательную среду добавляют 28 г дрожжевого автолизата.

Пример 2. 120 г предварительно измельченного зерна (обойная мука) смешивают с 2,4 л воды, стерилизуют и вносят в предварительно стерилизованный ферментер с рабочим объемом 3 л. Туда же вносят 300 мл инокулята, содержащего бактерии Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D с плотностью 1-2 млрд/мл. Осуществляют ацетон-бутанол-этаноловое брожение при температуре 37°С.

При концентрации органических растворителей в среде 0,6% снижают давление в ферментере на 0,5 часа до -0,94 кг/см², что приводит к изменению классического соотношения бутанол-ацетон-этанол 60:30:10 (соотношение растворителей 80:15:5). Как только концентрация бутанола в среде достигает 0,5%, давление в ферментере повышают до атмосферного. Через 8 часов осуществляют повторное понижение давления на 0,5 часа до -0,94 кг/см², что приводит к изменению соотношения бутанол-ацетон-этанол 90:9:1.

Конденсацией отогнанных паров во время всей ферментации получают в среднем 250 мл раствора (органические растворители 19,9 мл), содержащего 6,5% бутанола, 1,2% ацетона и 0,25% этанола (соотношение растворителей 81:16:3).

После удаления бутанола и сопутствующих газов вводят в ферментер питательную среду, с содержанием 50 г глюкозы. Раз в три дня в питательную среду добавляют 28 г дрожжевого автолизата.

Пример 3. В предварительно стерилизованный ферментер с рабочим объемом 3 л вводят 2,5 л 4%-ного раствора сахаров древесины и 300 мл инокулята, состоящего из муки (40 г/л), воды и бактерий Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D с плотностью 1-2 млрд/мл. Осуществляют непрерывное ацетон-бутанол-этаноловое брожение при температуре 37°С.

При концентрации бутанола в среде 1,0% снижают давление в ферментере на 1,0 час до -0,90 кг/см², что приводит к изменению соотношения ацетон-бутанол-этанол

30:60:10 на соотношение растворителей 70:21:9. Как только концентрация бутанола в среде достигает 0,4%, давление в ферментере повышают до атмосферного. Через 6 часов осуществляют повторное понижение давления на 1,0 часа до -0,92 кг/см², что приводит к повторному изменению соотношения ацетон-бутанол-этанол. Конденсацией отогнанных паров во время всей ферментации получают в среднем 250 мл раствора (органические растворители 19,9 мл), содержащего 7,5% бутанола, 0,7% ацетона и 0,25% этанола (соотношение растворителей 89:8:3).

После удаления бутанола и сопутствующих газов вводят в ферментер питательную среду, с содержанием 50 г глюкозы. Раз в три дня в питательную среду добавляют 28 г дрожжевого автолизата.

Пример 4

В предварительно стерилизованный ферментер с рабочим объемом 3 л вводят 2,5 л 4%-ного раствора глюкозы, добавляют 120 г муки, 300 мл инокулята, состоящего из муки (40 г/л), воды и бактерий Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D с плотностью 1-2 млрд/мл. Осуществляют ацетон-бутанол-этаноловое брожение при температуре 37°С. При концентрации бутанола в среде 0,9% осуществляют отвод 0,5 литра культуральной жидкости в отдельную емкость. Давление в отдельной емкости снижают до 0,94 кг/см². Конденсацией отогнанных паров получают 50 мл раствора (органические растворители 4,2 мл), который содержит 3,75 мл бутанола, 0,35 мл ацетона и 0,125 мл этанола, соотношение растворителей бутанол:ацетон:этанол равно 89:8:3. Обедненную культуральную жидкость из отдельной емкости (концентрация бутанола 0,2%) возвращают обратно в ферментер. В ферментер вводят питательную среду, содержащую 50 г глюкозы, процесс брожения продолжается. При концентрации бутанола в среде 1,0% вновь осуществляют отвод 0,5 литра культуральной жидкости в отдельную емкость. Давление в отдельной емкости снижают до 0,92 кг/см². Конденсацией отогнанных паров получают 60 мл раствора (органические растворители 5,1 мл), который содержит 4,62 мл бутанола, 0,42 мл ацетона и 0,15 мл этанола, соотношение растворителей бутанол:ацетон:этанол равно 91:6:3. Обедненную культуральную жидкость из отдельной емкости возвращают обратно в ферментер. Затем цикл повторяют вновь. Конденсацией отогнанных паров во время всей ферментации получают в среднем 250 мл раствора (органические растворители 19,9 мл), содержащего 6,5% бутанола, 1,2% ацетона и 0,25% этанола (соотношение растворителей 81:16:3).

Преимущества предложенного способа состоят в возможности целенаправленного изменения соотношения органических растворителей, получаемых биосинтезом углеводсодержащего сырья, непосредственно в процессе сбраживания. Способ позволяет увеличить долевой выход определенного растворителя в зависимости от текущих потребностей в том или ином растворителе в данный момент.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Способ получения органических растворителей предусматривает биосинтез углеводсодержащего сырья с помощью бактерий вида Clostridium acetobutylicum. При этом осуществляют изменение соотношения получаемых органических растворителей путем воздействия на продуцирующую культуру понижением давления. Способ обеспечивает возможность изменения соотношения органических растворителей непосредственно в процессе сбраживания. Выход органических растворителей составляет 6,5-7,5% бутанола, 0,7-1,2% ацетона, 0,25% этанола. 7 з.п. ф-лы.

1. Способ получения органических растворителей, предусматривающий биосинтез углеводсодержащего сырья с помощью бактерии вида Clostridium acetobutylicum, характеризующийся тем, что осуществляют изменение соотношения получаемых органических растворителей путем воздействия на продуцирующую культуру понижением давления.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что воздействие осуществляют на всю культуру в процессе биосинтеза углеводсодержащего сырья.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что воздействие осуществляют на часть культуры вне процесса биосинтеза углеводсодержащего сырья с возвращением ее в процесс.

4. Способ по пп.1, 2 или 3, отличающийся тем, что давление понижают периодически.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в процессе понижения давления осуществляют отгонку растворителей.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что понижение давления и отгонку начинают при достижении уровня концентрации растворителей в культуральной среде, приближающейся к токсической для продуцирующей культуры.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что понижение давления и отгонку начинают по достижению уровня концентрации растворителей в культуральной среде 0,6-1,2%.

8. Способ по п.5, отличающийся тем, что понижение давления и отгонку продолжают до достижения уровня концентрации растворителей в культуральной среде 0,5-0,2%.