ШТАММ БАКТЕРИЙ CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM - ПРОДУЦЕНТ Н-БУТИЛОВОГО СПИРТА, АЦЕТОНА И ЭТАНОЛА Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 C12P7/00 C12R1/145 

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма Clostridium acetobutylicum, продуцирующего н-бутиловый спирт, ацетон и этанол.

Н-бутиловый спирт (н-бутанол), ацетон и этанол применяются во многих отраслях народного хозяйства. В качестве растворителей используются в лакокрасочной промышленности, в производстве синтетической резины, шелка, при экстрагировании фармацевтических препаратов и других отраслях. Используются также в качестве сырья для синтеза ряда органических продуктов, а также в виде жидкого топлива.

Н-бутанол, ацетон и этанол могут быть получены и химическим способом, однако качество их, получаемых на заводах синтетического каучука, невысокое из-за значительного содержания в них непредельных соединений. В связи с этим такие спирты не находят применения в ряде отраслей промышленности, например в лакокрасочной и фармацевтической и др., потребность которых в высококачественном н-бутиловом спирте покрывается н-бутанолом, полученным способом микробиологического синтеза.

Н-бутиловый спирт, получаемый брожением, представляет собой первичный бутиловый спирт (СН₃-СН₂-СН₂-СНОН).

Известно, что бактерии Clostridium acetobutylicum при сбраживании различных углеводов синтезируют одновременно три целевых продукта: н-бутиловый спирт, ацетон и этанол, получившие общее название органические растворители, процентное соотношение которых колеблется в пределах 60:30:10. Это соотношение не является строго постоянным и может значительно варьировать в сторону увеличения выхода того или иного продукта брожения.

Наиболее ценным из органических растворителей является н-бутиловый спирт.

Существующее промышленное производство микробиологического синтеза н-бутилового спирта, ацетона и этанола основано на использовании ацетоно-бутиловых бактерий, относящихся к роду Clostridium.

Известен штамм Clostridium acetobutylicum, который за 66 часов брожения на мучных средах накапливает в культуральной жидкости 13,5-15,5 г/дм³ органических растворителей, в том числе н-бутилового спирта 9,0-10,0 г/дм³, ацетона 3,5-4,0 г/дм³ и этанола 1,0-1,5 г/дм³ (Промышленный регламент на производство растворителей: ацетона, бутанола и этанола способом брожения. ПР64-35-89, г.Ефремов, 1989) /1/.

Имеются сообщения о штаммах мутантах Clostridium acetobutylicum, накапливающих на мучных средах за 66 часов брожения 9,0-10,0 г/дм³ н-бутанола, 4,3-4,9 г/дм³ ацетона и 1,3-1,9 г/дм³ этанола (Любимова И.К., Великая М.А. и др. Биосинтез растворителей мутантами С.acetobutylicum, устойчивыми к 2-дезокси-Д-глюкозе - «Биотехнология», 1993, №8, сс.10-12) /2/.

Наиболее близким к настоящему изобретению является штамм Clostridium acetobutylicum VKPM-B-4786 (Березина О.В., Синеокий С.П. и др. Внеклеточная гликозилгидролазная активность клостридий, образующих ацетон, бутанол и этанол - «Прикладная биохимия и микробиология», 2008, т.44, с.49-55) /3/.

Недостатком данного известного штамма является недостаточно высокий выход растворителей от используемого углеводного субстрата.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является повышение общего выхода растворителей, в частности н-бутанола.

Указанный технический результат достигается тем, что в качестве продуцента н-бутилового спирта, ацетона и этанола используют вновь выделенный штамм Clostridium acetobutylicum ВКМ В-2512D.

Штамм выделен из растительных остатков силосной ямы и охарактеризован по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.

Морфология клеток

Клетки бактерий палочковидные, попарно или в коротких цепочках. В процессе развития образует длинные цепочки, которые в дальнейшем распадаются на отдельные клетки.

Размер молодых вегетативных клеток:

d 0,6-0,7 мкм, l 3-5 мкм.

Имеет одну субтерминальную овальную спору, неподвижны, окрашиваются по Грамму положительно.

Культурально-морфологические признаки.

На картофельной среде с глюкозой и агаром через 48 часов роста при 37°С в анаэробных условиях образует круглые с ровными краями колонии диаметром 0,8-1,0 мкм. Структура колоний однородная, серовато-белого цвета, непрозрачные, поверхность гладкая, выпуклая, жирно-блестящая.

Физиолого-биохимические признаки

Гетеротрофный облигатный анаэроб, желатину не разжижает, мясо-пептонный агар (по уколу) разрывает выделяющимися газами брожения.

Сбраживает: крахмал, глюкозу, целлобиозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, манозу, сахарозу, глицерин и пируват.

Усваивает азот в форме солей аммония и суперфосфата.

Требует присутствия углекислого кальция для поддержания оптимальных значений рН среды в процессе роста.

Необходимым фактором роста являются биотин и р-аминобензойная кислота.

Растет при температуре от 15 до 45°С, оптимальная температура 37°С.

Растет на средах с рН 4,0-8,0, оптимальное значение рН 5,5-6,0.

В анаэробных условиях при культивировании на мучных средах образует н-бутиловый спирт, ацетон, этанол и выделяет газы.

Штамм хранится в лиофильно-высушенном виде в запаянных стеклянных пробирках при температуре от +4°С до комнатных условий. Срок хранения не ограничен.

На основании проведенного изучения культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков культура определена как Clostridium acetobutylicum (по Определителю бактерий Берджи. Москва. Мир, 1997). Культура депонирована во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН под номером ВКМ В-2512D.

Штамм Clostridium acetobutylicum ВКМ В-2512D не является генетически модифицированным штаммом.

Штамм Clostridium acetobutylicum ВКМ В-2512D относится к микроорганизмам, не патогенным для человека, согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.2.731-99. Работа со штаммом Clostridium acetobutylicum ВКМ В-2512D не требует специальных мер предосторожности.

Ниже приводится пример реализации изобретения.

Пример 1

Получение н-бутанола, ацетона и этанола с использованием нового штамма продуцента осуществляют следующим образом.

Клетки штамма Clostridium acetobutylicum ВКМ В-2512D, хранящиеся в лиофильно-высушенном состоянии в запаянных пробирках, подвергаются оживлению.

Питательная среда для оживления имеет следующий состав, г/дм³: КН₂РО₄ - 0,7; K₂HPO₄ - 0,7; MgSO₄·7H₂O - 0,1; MnSO₄·4H₂O - 0,02; FeSO₄·7H₂O - 0,015; NaCl - 0,01; глюкоза - 20,0; аммонийный ацетат - 3,0; дрожжевой экстракт - 1,0; пептон - 1,0; цистеин - 0,5; агар - 15,0; р-аминобензойная кислота - 0,001; тиамин - 0,001; биотин - 1,0 мкг; крахмал - 1,0; вода дистиллированная - 1 дм³. Температура 37°С, анаэробные условия, продолжительность роста 24 часа.

Приготовленные таким образом клетки переносят в стерильную питательную среду, содержащую в г/дм³: пшеничная мука - 40,0; углекислый кальций - 2,0; водопроводная вода - 1 дм³. Процесс брожения ведут анаэробно при температуре 37°С в течение 20 часов до получения культуры, клетки которой находятся в экспоненциальной фазе роста.

Затем вегетативным посевным материалом засевают стерильную ферментационную среду следующего состава г/дм³: пшеничная мука - 80,0; углекислый кальций - 2,0; водопроводная вода - 1 дм³. Количество посевного материала 20% от объема питательной среды. Культивирование ведут при температуре 37°С анаэробно в течение 72 часов до окончания процесса брожения.

На выходе общее содержание растворителей в культуральной жидкости составляет 30,0 г/дм³, в том числе 23,0 г/дм³ н-бутанола, 4,0 г/дм³ ацетона и 3,0 г/дм³ этанола. Конверсия углеводов крахмала в образовавшиеся растворители составляет 55,5%. Таким образом, штамм Clostridium acetobutylicum ВКМ B-2512D синтезирует н-бутанола в 6,22 раза, ацетона в 2,22 раза и этанола в 6 раз больше, чем штамм прототип Clostridium acetobutylicum VKPM-B-4786, и позволяет считать его перспективным для получения н-бутанола, ацетона и этанола в промышленных масштабах (таблица).

Сравнительные результаты выхода н-бутанола, ацетона и этанола заявленным штаммом и прототипом Штамм Продуктивность, г/дм³ Clostridium acetobutylicum н-бутанол ацетон этанол сумма VKPM-B-4786 3,7 1,8 0,5 6,0 ВКМ B-2512D 23,0 4,0 3,0 30,0

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для синтеза н-бутилового спирта, ацетона и этанола, а также производства растворителей. Штамм Clostridium acetobutylicum BKM B-2512D депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН и является продуцентом н-бутилового спирта, ацетона и этанола. Изобретение позволяет повысить выход н-бутилового спирта, ацетона и этанола и расширить сырьевую базу для их получения. 1 табл.

Штамм бактерий Clostridium acetobutylicum BKM B-2512D - продуцент н-бутилового спирта, ацетона и этанола.