СПОСОБ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ СПЕРМАТОГЕНЕЗА, ВЫЗВАННЫХ ЦИТОСТАТИЧЕСКИМ ВОЗДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2010 года по МПК A61K38/18 A61P15/08 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и касается способа коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием.

Цитостатические препараты, независимо от механизма их противоопухолевого действия, обладают выраженным токсическим действием на активно делящиеся нормальные (не поврежденные опухолью) ткани организма. К числу последних принадлежит сперматогенный эпителий мужских половых желез [1], в котором, благодаря постоянным клеточным делениям (сперматогониев и сперматоцитов), происходит созревание мужских половых клеток - сперматогенез. Нарушение сперматогенеза, наблюдаемое на фоне цитостатического воздействия, по этиологии, патогенезу отличается от других видов патологических процессов, которые сопровождаются угнетением сперматогенеза (травмы, воспаление, эндокринные расстройства, генетические заболевания).

Учитывая, что химиотерапевтический метод лечения злокачественных новообразований позволяет добиться сегодня в ряде случаев не только длительных полных ремиссий, но даже излечения [2], актуальной становиться проблема необратимого мужского бесплодия как возможного последствия цитостатической химиотерапии [3]. В основе необратимых изменений лежит повреждающее действие на источник пролиферативного пула сперматогенеза - стволовые сперматогонии. Необратимые изменения в мужских половых железах могут существенно снизить качество жизни пациентов молодого возраста, поскольку состояние их репродуктивной функции, с учетом его биологического, социального, психологического значения, является важным фактором их жизни.

Одним из способов решения проблемы отцовства пациентов, перенесших цитостатическую терапию и находящихся в длительной полной ремиссии, является криоконсервация семенной жидкости до начала лечения [4]. Однако в силу ограниченной доступности этого способа для большинства пациентов криоконсервация не нашла широкого применения. Поиски способов борьбы с мужским бесплодием, вызванным цитостатическим воздействием, продолжаются. Возлагаются большие надежды на трансплантацию зародышевых клеток [5], но необходимо доказать, что их введение не приведет к снижению лечебного эффекта цитостатика.

Известен способ снижения повреждающего действия цитостатических препаратов на мужские половые железы с помощью средств фармакотерапии: антиоксиданты (левзея софлоровидная) [6]; гормоны (тестостерон) [7]; препарат фосфолицин, который ослабляет токсическое действие на семенники платиновых цитостатических препаратов за счет снижения их нефротоксичности [8].

Этот способ, заключающийся в использовании средств фармакотерапии, является наиболее близким к заявленному и выбран в качестве прототипа.

Недостатками данного способа являются низкая эффективность, ограниченность использования, возможность появления побочных эффектов и противопоказаний для пациентов, имеющих в анамнезе онкологическое заболевание. По данным фармакологическим средствам коррекции отсутствует информация о состоянии сперматогенеза в отдаленные сроки после введения препаратов (3 и 6 мес), что наиболее актуально для пациентов, находящихся в длительной полной ремиссии после перенесенного лечения. Отсутствуют также данные о влиянии на стволовые сперматогенные клетки, сохранение которых препятствует развитию необратимого мужского бесплодия.

Задачей, решаемой данным изобретением, является коррекция нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием.

Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой способ коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием, заключающийся в подкожном введении лабораторным животным (крысы) препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 100 мкг/кг 1 раз в день в течение 5 дней через 1 мес после введения цитостатика.

Новым в предлагаемом изобретении является использование препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 100 мкг/кг 1 раз в день в течение 5 дней через 1 мес после введения цитостатика.

В проанализированной литературе способа коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием с помощью колониестимулирующего фактора, не найдено, и предлагаемый способ соответствует критерию изобретения «Новизна». Данные клинических наблюдений свидетельствуют о том, что нарушение сперматогенеза после использования ряда химиотерапевтических схем носит необратимый характер [1, 3]. Необратимые изменения в извитом семенном канальце при воздействии на делящиеся клетки могут быть связаны с истощением пролиферативного пула мужских половых клеток, источником которого является популяция сперматогониев [9], а именно стволовых (резервных) сперматогониев или сперматогониев типа А [10]. Это клетки родоначальники, делятся только при повреждении и являются основой пролиферативного пула сперматогенеза. Для образования стволовых сперматогониев необходимо наличие ниш, которые формируют клетки Сертоли (клетки микроокружения) [5]. Последние утрачивают способность к делению в зрелых извитых семенных канальцах [11]. Регенерация семенных канальцев в целом возможна только одним путем - путем формирования семенных канальцев незрелого типа из регенерационной зоны [11]. Последняя содержит клетки Сертоли и первичные половые детерминанты, дающие начало новым сперматогониям. Недостаточность регенераторного потенциала семенника приводит к атрофии ткани в целом и служит причиной бесплодия.

В последние годы получены новые сведения о свойствах мультипотентных клеток предшественников организма, которые позволяют развить новую стратегию лечения многих заболеваний с помощью стволовых клеток [12]. Показана возможность мобилизации собственных механизмов «глубокого резерва» - стволовых клеток костного мозга и активации региональных стволовых клеток с помощью различных цитокинов, в том числе гранулоцитарного колониестимулирующего фактора [13].

Вместе с тем способов медикаментозной коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием с эффективным восстановлением количества сперматогониев, а следовательно, и структуры семенника за счет стимуляции образования новых семенных канальцев в мировой литературе не найдено. Увеличение количества сперматогониев при данной патологии является практической задачей и способно существенно повысить уровень эффективности способа. Следует отметить, что препарат не противопоказан для онкологических больных [14].

Факт применения препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора для коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием с достижением нового результата: коррекции нарушений сперматогенеза при цитостатическом воздействии для специалиста является не очевидным.

Совокупность отличительных признаков не является очевидной для специалиста и не вытекает явным образом из уровня техники данной области, что позволяет считать предлагаемое изобретение соответствующим критерию «Изобретательский уровень». Предлагаемое изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении и соответствует критерию «Промышленно применимо».

Способ осуществляют следующим образом.

Лабораторному животному (крысе-самцу) после моделирования повреждения половых желез цитостатическим препаратом, повреждающим стволовые сперматогонии, в течение 5 дней 1 раз в день через 1 мес после введения цитостатика подкожно вводят в дозе 100 мкг/кг препарат рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ).

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на крысах-самцах популяции Вистар в количестве 30 штук, массой 250-300 г. Все животные были получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ Фармакологии СО РАМН (сертификат имеется). Повреждение половых желез моделировалось однократным внутривенным введением противоопухолевого препарата, принадлежащего к группе таксанов - паклитаксела (митотакс, Dr. Reddy's, Индия). Выбор препарата обусловлен, с одной стороны, тем, что паклитаксел относится к числу наиболее востребованных в онкологической практике цитостатических препаратов [2, 15], с другой стороны, показано, что таксаны оказывают токсическое действие на стволовые сперматогонии [16]. Следует отметить, что избирательность повреждения стволовых сперматогоний (типа А) характерна для ряда других широко используемых в онкологической практике препаратов - бисульфана, доксорубицина. Истощение пролиферативного пула сперматогенной ткани за счет повреждающего действия на клетки родоначальники может быть причиной развития необратимого бесплодия в отдаленные сроки после цитостатического воздействия.

Для оценки эффективности использования рчГ-КСФ в качестве средства коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных введением паклитаксела, была проведена оценка морфологических и функциональных показателей сперматогенеза в срок, соответствующий по времени проявлению воздействия цитостатика на сперматогонии. Этот срок составляет для крыс - 3 мес после введения повреждающего фактора [17]. Морфологическое исследование мужских половых желез проводили с изучением количественных показателей, характеризующих степень выраженности структурных повреждений и процессов репаративной регенерации. Для этого на гистологических парафиновых срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, определяли: численность клеточной популяции сперматогонии, количество канальцев с 12-й стадией мейоза [17], количество клеток Сертоли [9]. Определяли степень зрелости сперматогенного пласта (на основании подсчета числа клеток Сертоли) [9]. Продуктивность сперматогенеза оценивали по общему количеству зрелых мужских половых клеток, приходящихся на эпидидимис [17].

Обработку полученных результатов проводили методом вариационной статистики с использованием непараметрического критерия U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1

Недостаточность сперматогенеза в отдаленные сроки после цитостатического воздействия моделировали однократным внутривенным введением в максимально переносимой дозе цитостатического препарата паклитаксела, который оказывает повреждающее действие на стволовые сперматогонии [16]. Учитывая длительность сперматогенеза у крыс [18], последствия повреждения сперматогонии должны проявиться через 3 мес после введения цитостатического препарата. Животным экспериментальной группы для стимуляции регенераторных процессов на 30-е сут после введения паклитаксела вводили подкожно 1 раз в день в течение 5 дней 100 мкг/кг препарат - рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (НИКТИ БАВ «Вектор», г.Новосибирск) - растворенный в 0,5 мл растворителя. Животным контрольной группы (паклитаксел) вводили по той же схеме физиологический раствор по 0,5 мл. В эксперименте были использованы также интактные животные (фон).

Проведенные эксперименты показали (табл.1), что через 3 мес после введения паклитаксела численность клеточной популяции сперматогонии оказалась достоверно сниженной и составила 74% от фоновых значений, что свидетельствует о том, что за весь цикл сперматогенеза на фоне введения паклитаксела не произошло восстановление изначального пролиферативного пула. Восстановление пролиферативного пула сперматогенного эпителия при повреждении происходит за счет стволовых (резервных) сперматогоний [10]. Полученные данные могут свидетельствовать о частичной гибели стволовых сперматогониев. По данным Сухачевой Т.В. и соавт. паклитаксел относиться к числу препаратов, повреждающих стволовые сперматогонии [16]. Количество канальцев с 12-й стадией мейоза на фоне введения цитостатика оказалось повышенным, что свидетельствует о стимуляции процессов репаративной регенерации внутри отдельных канальцев. При подсчете количества клеток Сертоли через 3 мес после введения паклитаксела различия с фоновыми значениями не выявлялись. При определении степени зрелости сперматогенного пласта оказалось, что в семенниках крыс, получавших цитостатик, идет обновление ткани семенника за счет образования новых канальцев. Об этом свидетельствует достоверно более низкий, чем у фона, показатель степени зрелости пласта. Продуктивность сперматогенеза, судя по общему количеству зрелых половых клеток, приходящихся на эпидидимис, на фоне введения паклитаксела оказалась сниженной. Их число составило 59% от фона. Учитывая, что общее количество половых клеток является одним из лабораторных показателей фертильности эякулята [10], то отмеченное выше снижение их числа (на 40%) может приводить к снижению плодовитости животных. Таким образом, в отдаленные сроки после введения паклитаксела наблюдаются, судя по числу сперматогоний, дефицит пролиферативного пула, недостаточность продуктивности сперматогенеза, судя по ОКС. В то же время имеет место реакция ткани на повреждение - идут процессы репаративной регенерации как внутри канальцев (увеличение числа канальцев с 12-й стадией мейоза), так и на уровне ткани в целом (снижение степени зрелости сперматогенного пласта). Однако регенераторных возможностей семенника очевидно недостаточно, о чем свидетельствует сниженное количество клеток - источников пополнения сперматогоний, что, видимо, и является причиной недостаточной продуктивности сперматогенеза в целом.

При морфологическом изучении мужских половых желез крыс, получавших на фоне введения паклитаксела рчГ-КСФ (табл.1), было выявлено, что количество сперматогоний статистически значимо превышает таковое при введении одного цитостатика на 74%. Более того, значение этого показателя достоверно выше по сравнению с таковыми у крыс, не получавших цитостатик (фон). Полученные данные свидетельствуют о способности рчГ-КСФ поддерживать источник пролиферативного пула сперматогенеза при цитостатическом воздействии. Количество канальцев с 12-й стадией мейоза, клеток Сертоли, в опыте не отличалось от таковых в других группах. Однако, судя по степени зрелости сперматогенного пласта в семенниках крыс экспериментальной группы, идут процессы обновления тестикулярной ткани в целом. Общее количество половых клеток, приходящихся на эпидидимис, достоверно превышало таковое в семенниках крыс, получавших один цитостатик, и практически не отличалось от фоновых значений. Таким образом, в отдаленные сроки после сочетанного введения паклитаксела и рчГ-КСФ, соответствующие по времени проявлению воздействия цитостатика на сперматогонии, продуктивность сперматогенеза соответствовала таковой у интактных крыс (фон), что, очевидно, связано с отсутствием дефицита пролиферативного пула.

Полученные данные свидетельствуют о том, что введение рчГ-КСФ оказывает коррегирующее влияние на семенники при цитостатическом повреждении в сроки, соответствующие по времени проявления на стволовые сперматогонии. Можно предположить, что это происходит за счет стимуляции процессов репаративной регенерации ткани в целом на более ранних этапах.

В связи с этим дальнейшим этапом исследований с целью изучения механизма корректорных свойств рчГ-КСФ на сперматогенез, при цитостатическом повреждении, были изучены все перечисленные выше показатели через 2 мес после введения паклитаксела. Полученные данные представлены в таблице 2.

Установлено, что количество сперматогоний в семенниках крыс, получавших один цитостатик, достоверно снижено и составляет 72% от фона. Количество канальцев с 12-й стадией мейоза повышено (почти в 2 раза) по сравнению с фоном. Количество клеток Сертоли достоверно снижено по сравнению с фоновыми показателями. Степень зрелости сперматогенного пласта снижена всего на 5% по сравнению с фоном. Судя по количеству ОКС, продуктивность сперматогенеза составляет 60% от фона. Полученные данные свидетельствуют о том, что через 2 мес после введения повреждающего фактора (паклитаксела) в семенниках снижена продуктивность сперматогенеза и выявляется дефицит пролиферативного пула. Сперматогенная ткань реагирует на повреждение за счет включения механизмов физиологической регенерации семенника. Об этом свидетельствуют стимуляция регенерации внутри канальца (увеличение количества канальцев с 12-й стадией мейоза), стимуляция, хотя и незначительная, регенерации на уровне ткани (сперматогенный пласт обновляется, он менее зрелый). Регенераторных возможностей ткани недостаточно для восполнения количества сперматогоний и дефицита сперматогенеза на этот период наблюдения, а низкая численность популяции сперматогоний приводит к дальнейшему дефициту сперматогенеза. Это подтвердили данные, полученные при изучении семенников крыс через 3 мес после введения паклитаксела.

При подсчете количества сперматогоний в семенниках крыс, получавших паклитаксел и рчГ-КСФ, было выявлено, что через 2 мес после начала эксперимента этот показатель превышает (на 40%) таковой в группе животных, получавших один цитостатик, практически не отличается от фоновых значений (табл.2). Количество канальцев с 12-й стадией мейоза превышало фоновые значения, что свидетельствует о процессах внутриканальцевой репаративной регенерации. При подсчете количества клеток Сертоли оказалось, что их число достоверно выше (более чем в 2 раза), чем при введении одного паклитаксела, и превышает фоновые значения. Степень зрелости сперматогенного пласта оказалась сниженной как по сравнению с фоном, так и по сравнению с таковой у животных, получавших один цитостатик. Эти данные свидетельствуют о том, что в семенниках на фоне введения рчГ-КСФ идет более интенсивное, чем при введении одного цитостатика, обновление сперматогенной ткани в целом, путем образования новых семенных канальцев. Это утверждение основывается на том, что по мере дифференцировки популяции мужских половых клеток количество поддерживающих клеток (Сертоли) снижается [9], т.е. менее дифференцированный пласт содержит большее число клеток Сертоли. Определение ОКС показало, что их число в группе комбинированной терапии статистически значимо не отличается от фоновых значений.

Полученные данные показывают, что в экспериментальной группе идет более усиленная, чем на фоне введения одного паклитаксела, репаративная регенерация ткани семенника. Это является причиной отсутствия дефицита числа сперматогоний, а следовательно, пролиферативного пула сперматогенеза, поэтому его продуктивность находится на уровне контрольных значений. Учитывая, что гранулоцитарный колониестимулирующий фактор обладает способностью к мобилизации собственных механизмов «глубокого резерва» - стволовых клеток [13], то отмеченный защитный эффект в группе животных, получавших его на фоне введения паклитаксела, обусловлен действием рчГ-КСФ.

Таким образом, защитное действие рчГ-КСФ на мужские половые железы при цитостатическом повреждении обусловлено стимуляцией механизмов репаративной регенерации ткани семенника в целом, приводящей к образованию новых семенных канальцев, содержащих необходимое количество сперматогоний для обеспечения нормального уровня сперматогенеза.

Предлагаемый способ позволяет провести эффективную коррекцию нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием с помощью рчГ-КСФ за счет стимуляции репаративных процессов тестикулярной ткани в целом, приводящих к образованию новых источников пролиферативного пула сперматогенеза.

Цитируемая литература

1. Гершанович М.Л. Осложнение при химио- и гормонотерапии злокачественных опухолей. - М. Медицина, 1982. - С.51-80.

2. Противоопухолевая химиотерапия. / Под ред. Н.И.Переводчиковой. - М.: Медицина, 2005. - С.27-51.

3. Резниченко А.Г. Влияние химио- и радиотерапии на сперматогенез у онкологических больных. // Проблемы репродукции. - 2007. - №4. - С.70-75.

4. Auger J., Kuntsmann J., Czuglik F. et al. Coservation du sperme avant traitement anticancerenx. Une mesure efficce pour preserverles chances de conception future. // Contacept.-fertil.-sex. - 1993. - Vol.21, №10. - P.749-752.

5. Meachem S., Schonfeldt V., Schlatt S. Spermatogonia: stem cells with a great perspective. // Reprod. - 2001. - Vol.121, №6. - P.825-834.

6. Щемерова Ю.А. Влияние ингибиторов топоизомеразной активности вепезида и иринотекана на репродуктивную систему крыс-самцов: Автореф. дисс.… кан-та биол. наук. - Томск, 2006. - 23 с.

7. Delic J., Harwood J., Stanly J. Time dependence for the protective effect of androgen from procarbazine - induced damage to rat spermatogenesis. // Cancer. - 1987. - №5. - P.1344-1347.

8. Yoshi S., Monabe F., Hiroshi T. et al. Huxon ragary pexo tarray dsasel. // Chemotherapy. - 1990. - Vol.38, №7. - P.670-675.

9. Сухоруков B.C., Шамшад Д.С. Определение степени зрелости сперматогенного пласта крысы при его регенерации и в процессе созревания интактного семенника. // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1989. - Т.97. - №9. - С.89.

10. Липатова Н.А. Лабораторные критерии фертильности эякулята. // Клиническая лабораторная диагностика. - 1998. - Т.5. - С.11-15.

11. Курносова Т.Р., Вербицкий М.Ш., Сухих Г.Т., Молнар Е.М. Современные представления о структурных основах репаративной регенерации семенника млекопитающих животных и человека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1994. - №4. - С.396-999.

12. Holtzer H. Cell lineages, stem cells and the quantal cell cycle concert. / Stem cells and tissue homeostasis. End: B.I.Lord, C.S.Porten, R.J.Cole. - New York, Cambrige Unyversity Press. - 1978. - P.1-28.

13. Haas R., Murea S. The role of granulocyte colony - stimulating factor in mobilization and transplantation of peripheral blood progenitor and stem cells. // Mol. Ther. - 1996. - Vol.2, №1. - P.136.

14. Справочник. Видаль специалист. Онкология. 2005. - С.365.

15. Хидоятова З.Ш., Султонова Г.А., Достходжаева Р.И. Изучение потребности лекарственных средств, применяемых при онкологических заболеваниях. // Материалы XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (тезисы докладов). 16-20 апреля 2007 г. С.237.

16. Сухачева Т.В., Богуш Т.А., Коломиец О.Л. Повреждающее действие таксола на сперматогенез мыши. // Бюл. экпер. биол. и мед. - 2001. - Т.123, №11. - С.554-560.

17. Саноцкий И.В., Фоменко В.И. Отдаленные последствия влияния химических соединений на организм. - М.: Наука, 1979. - С.73-78.

18. Лепехин Н.П., Палыга Г.Ф. Последствия для внутриутробного развития потомства облучения половых клеток самцов на разных стадиях сперматогенеза. // Радиационная биология, радиоэкология. - 1994. - Т.34, №.4-5. - С.645-649.

Таблица 1 Морфологические и функциональные показатели семенников крыс через 3 мес после сочетанного введения паклитаксела и Г-КСФ Группа Количество сперматогоний, абс. ед. Количество канальцев с 12-й стадией мейоза, абс. ед. Количество клеток Сертоли, абс. ед. Степень зрелости пласта, усл. ед. ОКС, млн Фон 16,58±0,44 2,00±0,41 2,98±0,30 6,02±0,07 41,03±2,94 Контроль (Паклитаксел) 12,25±0,35# 4,50±0,65# 3,36±0,20 5,35±0,03# 24,28±4,53# Паклитаксел + Г-КСФ 21,29±0,66#* 3,75±0,85 3,15±0,24 5,38±0,04# 38,58±2,43* Примечание:
# - статистическая значимость различий по сравнению с фоном,
* - статистическая значимость различий по сравнению с контролем (паклитакселом).

Таблица 2 Морфологические и функциональные показатели семенников крыс через 2 мес после сочетанного введения паклитаксела и Г-КСФ Группа Количество сперматогоний, абс. ед. Количество канальцев с 12-й стадией мейоза, абс. ед. Количество клеток Сертоли, абс. ед. Степень зрелости пласта, усл. ед. ОКС, млн Фон 17,74±1,07 1,75±0,25 3,60±0,33 5,87±0,08 56,55±2,47 Контроль (Паклитаксел) 12,80±0,35# 3,50±0,65# 2,05±0,16# 5,58±0,03# 34,50±6,79# Паклитаксел + Г-КСФ 18,08±1,73* 4,50±0,29# 5,28±0,61#* 5,00±0,11#* 39,28±2,08 Примечание:
# - статистическая значимость различий по сравнению с фоном,
* - статистическая значимость различий по сравнению с контролем (паклитакселом).

Изобретение относится к медицине, в частности к андрологии, и может быть использовано для коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием. Для этого лабораторным животным (крысам) вводят препарат рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 100 мкг/кг 1 раз в день в течение 5 дней через 1 месяц после цитостатического воздействия. Способ позволяет провести эффективную коррекцию нарушений сперматогенеза от цитостатического повреждения за счет стимуляции репаративных процессов тестикулярной ткани в целом, приводящих к образованию новых источников пролиферативного пула сперматогенеза. 2 табл.

Способ коррекции нарушений сперматогенеза от цитостатического воздействия, заключающийся в назначении фармакотерапии, отличающийся тем, что через 1 мес после цитостатического воздействия назначают рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, который вводят подкожно в дозе 100 мкг/кг 1 раз в день в течение 5 дней.