СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ КАНЦЕРОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ МЕТИЛНИТРОЗОМОЧЕВИНЫ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2011 года по МПК A61K31/427 A61K31/17 A61P35/00 

Изобретение относится к профилактической медицине, экспериментальной онкологии, фармакологии и служит обоснованием для исследования возможности применения нестероидных противовоспалительных препаратов при профилактике онкологической патологии и, в частности, рака молочной железы, в группах повышенного риска.

Рак молочной железы является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у женщин (32% всех первично выявленных случаев), кумулятивный риск развития которого с возрастом имеет тенденцию к повышению [Чисов В.И., Дарьялова С.Л. Рак молочной железы. // Онкология. Клин. рекомендации. - М., ГЭОТАР-Медиа, 2006. - С.271].

В связи с продолжающимся ростом онкозаболеваемости, в комплексе мер по борьбе с данной патологией особую актуальность приобретают меры профилактики канцерогенеза молочной железы, одной из ключевых позиций которой является, наряду с ранней диагностикой предопухолевых состояний, химиопрофилактика рака молочной железы [Vogel VG. Preventing breast cancer in high-risk women // Oncology. 2008. May; 22(6). - P.666-73]. В настоящее время доказано, что с помощью применения ряда соединений растительного и синтетического происхождения можно предотвратить возникновение и прогрессирование опухолевого процесса на любом из этапов его развития.

В последние годы отмечается повышенный интерес к новым аспектам фармакологической активности нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВС). Возможность применения НПВС в качестве противоопухолевых агентов основана на роли циклооксигеназы и простагландинов в развитии злокачественных новообразований. Согласно данным, полученным из ретроспективных эпидемиологических исследований, применение препаратов данной группы, угнетающих активность ЦОГ, снижает риск возникновения злокачественных новообразовании [Farrow D.C., 1998, Harris., 1999, Davies G, 2002]. Наличие у ряда НПВП отчетливой антиканцерогенной активности подтверждается также и в экспериментальных исследованиях [Harris., 2000, Kazunori Hattori., 2006].

Ввиду того, что химиопрофилактические средства обычно назначаются на длительный период времени, одним из основных требований, предъявляемых к ним, является безопасность для человека. Большие надежды в связи с этим возлагаются на новый класс НПВП-избирательные ингибиторы ЦОГ-2, основными представителями которых к настоящему времени являются целекоксиб и мелоксикам. Предполагается, что применение этих препаратов может обеспечить выраженный антиканцерогенный эффект при меньшем риске возникновения серьезных побочных реакций.

Целью нашего исследования явилось изучение влияния избирательного ингибитора ЦОГ-2 мелоксикама, обладающего лучшим по сравнению с традиционными НПВП и коксибами профилем безопасности, в отношении развития экспериментальных опухолей молочной железы.

Наиболее близким является способ профилактики канцерогенного действия метилнитрозомочевины [Беспалов В.Г., Лидак М.Ю. Антиканцерогенный эффект ортофена и индометацина у крыс и мышей с индуцированными опухолями различных органов // Экспер. онкол. - 1992. - Т.26, №1. - С.36-40.], взятый нами за прототип, заключающийся в подкожном введении метилнитрозомочевины в ткань всех 12 молочных желез, однократно, по 1 мг канцерогена на железу, в сочетании с ортофеном и индометацином в дозе 25 мг/кг корма в качестве антиканцерогенов, которые вводят с кормом в течение всего эксперимента.

Недостатком этого прототипа является неизбирательное ингибирование циклооксигеназы данными препаратами с развитием значительного числа побочных эффектов, наиболее значимым из которых является ульцерогенное действие.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики канцерогенного действия метилнитрозомочевины у экспериментальных животных, включающего применение ингибитора ЦОГ-2 мелоксикама в фазу промоции канцерогенеза.

Решение этой задачи обеспечивает значительное снижение канцерогенного действия метилнитрозомочевины, что выражается в достоверном ингибировании частоты развития опухолей молочной железы при удлинении латентного периода их возникновения в опытной группе по сравнению с контролем, а также снижении темпов роста возникших новообразований и увеличении продолжительности жизни животных.

Для достижения этого технического результата заявляемый способ профилактики канцерогенного действия метилнитрозомочевины у экспериментальных животных имеет следующие существенные признаки: подкожное введение метилнитрозомочевины в сочетании с антиканцерогеном, который начинают вводить с первого дня эксперимента с кормом одновременно с метилнитрозомочевиной, метилнитрозомочевину в дозе 2,5 мг на крысу в 0,2 мл воды для инъекций вводят пятикратно с интервалом в одну неделю в течение 1,5 месяцев в ткань одной и той же молочной железы у основания левой передней лапки, а в качестве антиканцерогена дают с кормом мелоксикам в дозе 1,8 мг/кг массы тела 2 раза в неделю в течение 9 месяцев.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что метилнитрозомочевину в дозе 2,5 мг на железу вводят пятикратно, а в качестве антиканцерогена дают с кормом избирательный ингибитор циклооксигеназы -2 мелоксикам, применение которого по сравнению с неизбирательными ингибиторами фермента более эффективно снижает частоту развития и объем возникающих опухолей за счет активного подавления циклооксигеназы в опухолевой ткани по сравнению со здоровой, подавления опухолевого ангиогенезе, а также реже вызывает побочные эффекты со стороны желудочно-кишечного тракта.

Заявляемый способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям, совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию "новизна".

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики канцерогенного воздействия метилнитрозомочевины у экспериментальных животных, включающего введение в качестве антиканцерогена препарата группы нестероидных противовоспалительных средств мелоксикама в дозе 1,8 мг/кг массы тела с кормом два раза в неделю с первого дня на протяжении всего эксперимента (в течение 9 месяцев) одновременно с подкожными инъекциями метилнитрозомочевины в ткань молочной железы пятикратно с интервалом в одну неделю (в течение 1,5 месяцев), что позволяет сделать вывод о соответствии критерию "изобретательский уровень".

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики канцерогенного воздействия метилнитрозомочевины путем применения препарата мелоксикам, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию "промышленная применимость".

Данный способ осуществляется следующим образом.

Опухоли молочной железы индуцировали путем пятикратного с интервалом в одну неделю подкожного введения метилнитрозомочевины в область одной и той же молочной железы у основания левой передней лапки в дозе 2,5 мг на крысу в 0,2 мл воды для инъекций (суммарная доза канцерогена составила 12,5 мг на крысу).

Всех павших и забитых в конце эксперимента животных подвергали полной аутопсии. После вскрытия внимательно изучали внутренние органы на предмет наличия метастазов. В протоколе вскрытия отмечались локализация, размеры, консистенция, границы, цвет и внешний вид опухоли на разрезе. Гистологическую верификацию опухолей осуществляли после фиксации материала в 10% растворе нейтрального формалина и окраски срезов толщиной 5-6 мкм гематоксилином и эозином. При морфологическом анализе опухолей молочной железы основывались на классификации опухолей лабораторных животных, предложенной Международным агентством по изучению рака.

Влияние препаратов на динамику канцерогенеза оценивали с помощью хронометрии латентного периода развития опухолей от момента введения канцерогена до выявления опухолевого узелка, по изменению частоты возникновения опухолей, темпов роста опухолей, а также продолжительности жизни и выживаемости животных в опытной группе по сравнению с контролем. Выявление опухолевых узлов определялось пальпацией, и по мере их роста каждые 2 недели производилось измерение и вычисление объема по формуле V=a × b × c × π/6.

Темпы роста оценивали по проценту торможения индексу эффективности и коэффициенту активности.

Процент торможения рассчитывали по формуле

T%=Vk-V/Vk × 100%,

где Vk - средний объем опухолей в контрольной группе; V - средний объем опухолей в опытной группе.

Индекс эффективности определяли как Vk/V.

Коэффициент активности рассчитывали по формуле

K=1-lnF(t₁)-lnF(t₀)/lnF₁(t₁)-lnF₁(t₀),

где t₀ - время до воздействия модифицирующего фактора; t₁ - время определения эффекта;

F₁ - показатель роста опухолей в опытной группе; F - показатель роста опухолей в контрольной группе.

Результаты исследований обрабатывали статистически. Для оценки степени достоверности полученных различий в сравниваемых группах пользовались критериями t Стьюдента, Манна-Уитни и χ².

Сущность заявляемого способа подтверждена графически.

Фиг.1. Опухоль молочной железы, индуцированная у крыс N-метил-N-нитрозомочевиной.

Фиг.2. Низкодифференцированная аденокарцинома долькового типа.

Фиг.3. Умереннодифференцированная солидно-криброзная аденокарцинома.

Фиг.4. График влияния мелоксикама на возникновение опухолей молочной железы, индуцированных у крыс N-метил-N-нитрозомочевиной.

Пример. Опыты проведены на 50 крысах - самках линии Вистар массой 100-120 г. Животные были разделены на 2 группы: 25 крыс первой группы служили контролем и получали только канцероген; 25 крыс второй опытной группы получали с первого дня эксперимента одновременно с канцерогеном мелоксикам по 1,8 мг/кг массы тела 2 раза в неделю. Продолжительность опыта составила 36 недель.

Применение мелоксикама не отразилось на общем состоянии животных, их поведении, потреблении корма и воды. Изменение показателей массы тела подопытных животных практически не отличалось от изменений показателей в группе контроля на протяжении всего срока опыта. В ходе проведенного исследования у животных обеих групп развивались новообразования молочной железы (фиг.1), морфологически классифицированные как умеренно- или низкодифференцированные аденокарциномы (см. фиг.2 и 3). Метастазирования развившихся опухолей нами обнаружено не было. Ко времени обнаружения первой опухоли в контрольной группе дожило 22 крысы (88%), из них опухоли молочной железы развились у 20 крыс, что составило 90,9% от эффективного числа животных в группе. В опытной группе, получавшей мелоксикам, из 23 животных опухоли развились у 11, что составило 47,8% (p<0,05) (фиг.4). Средний латентный период развития опухолей в контрольной группе составил 155,8±9,1 дней и 201,7±10,6 дней в группе с мелоксикамом (p<0,001). Средняя продолжительность жизни животных с опухолями молочной железы в контрольной группе была равна 31,8±2,5 дня и уступала аналогичным показателям в опытной группе - 43,3±7,9 дня (табл.1). Ко времени завершения опыта в контрольной группе дожило 10% животных и 72,2% животных в группе с мелоксикамом.

При регулярном измерении объемов новообразований в условиях данного эксперимента нами было выявлено достоверное снижение темпов роста опухолей молочной железы в группе животных, получавших мелоксикам. Средний размер опухолей в данной группе через два месяца после выявления был равен 4,54±1,02 см³, в контрольной группе - 12±3,06 см³ (p<0,05). При этом индекс эффективности и коэффициент активности в опытной группе, являющиеся показателями опухолевого роста в данной группе относительно соответствующего показателя в контрольной группе, свидетельствовали об отчетливом онкосупрессивном действии изучаемого препарата (табл.2).

Табл. 2. Оценка противоопухолевой активности мелоксикама по отношению к индуцированным ОМЖ у крыс, на основании определения процента торможения (Т/%), индекса эффективности (ИЭ) и коэффициента активности (Ка). Группа Критерий Недели после появления опухоли 2 4 8 МНМ + мелоксикам Т% 44,6% 62,2% 62,2% ИЭ 1,8 2,6 2,6 Ка 0,43 0,63 0,62

При изучении гастротоксичности мелоксикама у животных опытной группы изменений слизистой оболочки желудка не зарегистрировано, только у 5 (21%) из 23 крыс обнаружены поверхностные эрозии слизистой.

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о наличии у мелоксикама профилактической активности в отношении индуцированного канцерогенеза молочной железы, которая проявилась в достоверном снижении частоты возникновения опухолей у животных опытной группы практически вдвое, значительном увеличении латентного периода их развития (на 31%) и замедлении темпов роста опухолей в 2,6 раза при повышенной выживаемости животных данной группы по сравнению с контролем.

Дальнейшее изучение противоопухолевых свойств мелоксикама как препарата, обладающего высокой специфической активностью по отношению к ЦОГ-2 и минимальной токсичностью по сравнению с другими НПВП, является интересным с точки зрения возможного применения его в химиопрофилактике злокачественных новообразований.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для профилактики канцерогенного действия метилнитрозомочевины у экспериментальных животных. Способ включает пятикратное введение метилнитрозомочевины в дозе 2,5 мг на крысу в 0,2 мл воды для инъекций с интервалом в одну неделю в течение 1,5 месяцев в ткань одной и той же молочной железы у основания левой передней лапки. В качестве антиканцерогена с кормом вводят мелоксикам в дозе 1.8 мг/кг массы тела 2 раза в неделю в течение 9 месяцев. Использование изобретения позволяет снизить канцерогенный эффект метилнитрозомочевины за счет подавления циклооксигеназы-2 в опухолевой ткани, опухолевого ангиогенеза, уменьшить количество побочных эффектов. 2 табл., 4 ил.

Способ профилактики канцерогенного действия метилнитрозомочевины у экспериментальных животных, включающий подкожное введение метилнитрозомочевины в сочетании с антиканцерогеном, который начинают вводить с первого дня эксперимента с кормом одновременно с метилнитрозомочевиной, отличающийся тем, что метилнитрозомочевину в дозе 2,5 мг на крысу в 0,2 мл воды для инъекций вводят пятикратно с интервалом в одну неделю в течение 1,5 месяцев в ткань одной и той же молочной железы у основания левой передней лапки, а в качестве антиканцерогена дают с кормом мелоксикам в дозе 1,8 мг/кг массы тела 2 раза в неделю в течение 9 месяцев.