СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ КАНЦЕРОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ДИЭТИЛНИТРОЗАМИНА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2009 года по МПК A61K31/13 A61K31/685 A61P35/00 

Изобретение относится к экологии, медицине, токсикологии, экспериментальной биологии, ветеринарии и может быть использовано при гепатоканцерогенезе с профилактической целью в группах повышенного риска по заболеваемости раком печени.

В связи с ростом заболеваемости раком печени, наблюдаемым во многих странах (рак печени занимает 5 место в структуре онкозаболеваний), особенно актуальным становится поиск гепатопротекторов с антиканцерогенной активностью с целью профилактики рака печени. Практически у всех видов экспериментальных животных удается индуцировать опухоли печени при помощи канцерогенных нитрозосоединений. Они признаны потенциально опасными и для человека [Боговский П.А., 1985; Bellander B.T.D., Osterdahl B.G., Hadmar L., 1984; Mirvisch S.S., 1975].

Установлено, что в процессе гепатоканцерогенеза происходит интенсификация процессов перекисного окисления, протекающих в частности в липидах, и образование свободных радикалов [Туровецкий В.Б., Ситковский М.В. и соавт., 1974]. Доказано, что нарушение равновесия в системе перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита, приводящее к накоплению свободных радикалов, является одной из причин запуска злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии [Якубовская Р.И., 2000]. Исходя из представлений об участии свободных радикалов в механизме канцерогенеза, ряд исследователей пытались использовать антиоксиданты в качестве ингибиторов бластомогенеза [Джиоев Ф.К, 1984; Эмануэль Н.М., 1974; Sporn M.B. Suh N., 2000; Wattenberg L.W., 1972]. В связи с этим возникла насущная необходимость способов профилактики канцерогенного действия нитрозосоединений на организм человека.

К числу наиболее широко употребляемых гепатопротекторов относятся эссенциальные фосфолипиды (EPL) - экстракт из бобов сои и содержит преимущественно молекулы фосфатидилхолина (ФХ) с высокой концентрацией полиненасыщенных жирных кислот. Мембраностабилизирующее и гепатопротективное действие ЭФЛ достигается путем непосредственного встраивания молекул ЭФЛ в фосфолипидную структуру поврежденных печеночных клеток, замещения дефектов и восстановления барьерной функции липидного бислоя мембран. Ненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов способствуют повышению активности и текучести мембран, уменьшают плотность фосфолипидных структур, нормализуют проницаемость. Экзогенные ЭФЛ способствуют активации расположенных в мембране фосфолипидзависимых ферментов и транспортных белков, что, в свою очередь, оказывает поддерживающее влияние на обменные процессы в клетках печени, способствует повышению ее детоксикационного и экскреторного потенциала.

Наиболее близким является способ [Джиоев Ф.К. Влияние селена, фенобарбитала, тетурама и четыреххлористого углерода на канцерогенное действие диэтилнитрозамина и 1,2-диметилгидрозина // Материалы III-го симп.: «Канцерогенные N-нитрозосоединения - действие, синтез, определение». Таллин. - 1978. - С.51-53] химиопрофилактики рака в эксперименте, предупреждая возникновение опухолей и супрессии печеночного канцерогенеза, индуцированного диэтилнитрозамином, дачу которого осуществляли с питьем в дозе 100 мг/л в течение первых 4 месяцев, с профилактической целью использовали селенисто-кислый натрий (селенит натрия) в дозе 6 ппм/л воды в течение 6 месяцев, который был взят нами за прототип.

Недостатком прототипа является то, что селенисто-кислый натрий токсичен в высоких дозах, нецелесообразно его применение в регионах с высоким содержанием селена в воде, почве и пищевых продуктах, сроки введения были сокращены.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики канцерогенного действия диэтилнитрозамина у экспериментальных животных.

Решение этой задачи обеспечивает значительное снижение токсического действия диэтилнитрозамина, что выражалось в достоверном снижении частоты возникновения неопластических изменений в ткани печени, множественности новообразований пищевода, более поздней малигнизации в печени и пищеводе в опытной группе по сравнению с контрольной, увеличении продолжительности жизни и выживаемости животных, снижении уровня перекисного окисления липидов, увеличении активности антиоксидантных ферментов - каталазы и церулоплазмина (см. фиг.1-4).

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение - способ профилактики канцерогенного действия диэтилнитрозамина у экспериментальных животных, имеет следующие существенные признаки: животным ежедневно вводят в течение 4 месяцев с питьем диэтилнитрозамин в дозе 100 мг/л в сочетании с антиканцерогеном, который начинают вводить с кормом за 5 дней до введения диэтилнитрозамина, в качестве антиканцерогена вводят «Эссенциале Н» в дозе 75 мг/кг в течение 9 месяцев

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что в качестве антиканцерогена используется препарат эссенциальных фосфолипидов - «Эссенциале Н», который ведет к торможению бластомогенного процесса в печени и пищеводе, увеличению продолжительности жизни и выживаемости животных, снижению уровня перекисного окисления липидов, увеличению активности антиоксидантных ферментов - каталазы и церулоплазмина.

Гепатозащитное действие ЭФЛ, очевидно, основывается также на ингибировании процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), которые рассматриваются как один из ведущих патогенетических механизмов развития поражений печени. Однако, очевидно, не стоит переоценивать собственные антиоксидантные свойства ЭФЛ, так как они сами могут вовлекаться в процессы липопероксидации.

Заявляемый способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики канцерогенного действия диэтилнитрозамина у экспериментальных животных, включающего ежедневное введение в течение 4 месяцев с питьем диэтилнитрозамина в дозе 100 мг/л в сочетании с антиканцерогеном, который начинают вводить с кормом за 5 дней до введения диэтилнитрозамина, отличающегося тем, что в качестве антиканцерогена вводят «Эссенциале Н» в дозе 75 мг/кг в течение 9 месяцев, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики токсического действия диэтилнитрозамина, путем приема препарата «Эссенциале Н», что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом. Опухоли пищевода и печени индуцировали добавлением к питьевой воде диэтилнитрозамина (ДЭНА) в концентрации 100 мг/кг в течение первых 4 месяцев. Раствор ДЭНА давали контрольной и подопытной группам. За пять дней до начала дачи канцерогена, животным подопытной группы начинали вводить с кормом препарат «Эссенциале Н» в дозе 75 мг/кг массы тела. По истечении времени эксперимента (9 месяцев) проводили макроскопическое исследование внутренних органов, гистологическое исследование тканей пищевода и печени. Полученные результаты в контрольной и подопытной группах сравнивали. По истечении второй серии эксперимента (4 месяца) оценивали интенсивность процессов ПОЛ по накоплению вторичных продуктов липидной пероксидации, основным из которых является малоновый диальдегид (МДА), а также определяли состояние антиоксидантной защиты (АОЗ) по уровню активности ключевого антиоксидантного фермента - каталазы и основного антиоксидантного белка плазмы крови - церулоплазмина (ЦП), изменение которого свидетельствует о проявлении адаптивной реакции.

Для гистологических исследований образцы тканей (печень, почка, сердце) фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 мкм. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80×120×600.

Интенсивность процессов ПОЛ исследовали по накоплению вторичных продуктов липидной пероксидации, основным из которых является малоновый диальдегид (МДА) [Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль Л.М. Анализ методов определения ПОЛ в сыворотке крови по тесту тиобарбитуровой кислоты // Вопросы мед. химии. 1981. №1. С.118-122]. Содержание МДА определяли спектрофотометрически в тесте с тиобарбитуровой кислотой с образованием триметинового комплекса с максимумом поглощения при 532 нм по методу Hunter E.A. (1963), M.Uchiyama, M.Mihara (1978) в модификации Л.И.Андреевой и соавт. [Андреева Л.И., Кожемякина Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобаритуровой кислотой // Лабораторное дело. 1988. №11. С.41-43]. Состояние антиоксидантной защиты (АОЗ) изучали по уровню активности ключевого антиоксидантного фермента - каталазы и основного антиоксидантного белка плазмы крови - церулоплазмина (ЦП), изменение которого свидетельствует о проявлении адаптивной реакции. Активность каталазы крови определяли фотометрически методом по Баху и Зубковой [Королюк М.А., Майорова И.Г. и соавт. Метод определения активности каталазы // Лаборатное дело. №1. С.16-19]. Содержание ЦП определяли простым колометрическим методом, разработанным Равиным (1956) и основанным на реакции окисления р-фенилендиамина [Колб В.Т., Камышников В.С. Справочник по клинической химии. Минск: Буларусь, 1982. 366 С.].

Сущность заявляемого способа подтверждается макроскопически и морфологически (для наглядности изменений в органах макро- и микрофотографии см. в цветном виде в приложении):

Фиг.5. Опухоль печени, индуцированная диэтилнитрозамином (ДЭНА) у крысы; 9 месяцев после начала введения препарата. Макропрепарат.

Фиг.6. Множественные папилломы пищевода. Макропрепарат.

Фиг.7. Гепатоцеллюлярный рак низкодифференцированный трабекулярный. Гематоксилин-эозин. х120.

Фиг.8. Гепатохолангиома. Гематоксилин-эозин. х120.

На крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 130-140 г были проведены две серии опытов.

Пример 1. Первая серия - опыты по изучению влияния препарата эссенциальных фосфолипидов - «Эссенциале Н» на возникновение опухолей печени и пищевода, индуцированных при помощи диэтилнитрозамина (ДЭНА). Опыты проводились на крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 130-140 г, полученных из вивария Пятигорской фармацевтической академии. Животные содержались на пищевом рационе вивария. В качестве канцерогенного агента использовано вещество - N-диэтилнитрозамин (ДЭНА), синтезированное в НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова МЗ РФ. Опухоли печени и пищевода индуцировали по описанной методике (Ф.К.Джиоев, 1973) [Джиоев Ф.К. О влиянии некоторых адаптогенов на экспериментальный канцерогенез // Автореферат на соискание ученой степени канд. мед. наук. - Л., 1966] добавлением к питьевой воде ДЭНА в концентрации 100 мг/л воды в течение 4 месяцев. Животные были разделены на 2 группы - контрольную (30 крыс) и подопытную (23 крысы). Животные контрольной группы получали только гепатоканцероген. Животные подопытной группы, наряду с канцерогеном, получали «Эссенциале Н» в дозе 75 мг/кг ежедневно с кормом на протяжении всего эксперимента. Продолжительность опыта составила 36 недель. Животных по окончании эксперимента умерщвляли парами фторотана, вскрывали и проводили макроскопическое исследование внутренних органов.

При анализе микроскопических изменений в печени и пищеводе крыс основывались на классификации опухолей лабораторных животных, предложенной Международным агентством по изучению рака [Pathology of tumors in laboratory animals. Vol.1. Tumors of rat. Sekond adetion. Edited by V.S.Turusov and U.Mohr. - Lyon: IARC Scientific Publicaitions №99. - 1990. - 754 p.]. Об эффективности модифицирующего воздействия на канцерогенез судили по изменению количества крыс с неопластическими процессами, среднего латентного периода возникновения новообразований, индекса множественности в опытной группе по сравнению с контролем.

Результаты: в контрольной группе неопластические изменения в ткани печени обнаружены у 89,7% от эффективного числа животных (29 крыс) (см. Фиг.5). Первая крыса с предопухолевыми изменениями в печени пала на 12-й неделе эксперимента. Микроскопическое изучение ткани печени показало наличие гиперплазии протоков и очагов эозинофильно- и базофильноклеточной гиперплазии гепатоцитов (см. Фиг.7, 8). Злокачественные новообразования впервые были идентифицированы у трех крыс контрольной группы, павших на 21 неделе опыта: высокодифференцированный гепатоцеллюлярный рак и холангиоцеллюлярный рак, развившийся на фоне цирроза и гиперплазии протоков и/или гепатоцитов. Суммарно при морфологическом анализе неопластических изменений у 16 крыс контрольной группы идентифицирован высоко-, умеренно- или низкодифференцированный гепатоцеллюлярный рак, у 8 крыс - гепатоцеллюлярная аденома, у 3 - холангиоцеллюлярный рак, у 5 - холангиомы, у 6 - кавернозная гемангиоэндотелиома. Эти процессы развивались на фоне диффузных и очаговых гиперплазий гепатоцитов и/или протоков, а также цирротических процессов разной степени выраженности (Табл.1).

В группе животных, получавших «Эссенциале Н», неопластические изменения ткани печени обнаружены у 63,6% от эффективного числа животных (22 крысы). Микроскопический анализ гистологического материала показал, что в данной группе в 9 случаях имел место гепатоцеллюлярный рак, у 3 - гепатоцеладенома, у 1 - кавернозная гемангиоэндотелиома, у 10 животных идентифицирована гиперплазия протоков, в том числе кистозная.

Таблица 1 Влияние препарата эссенциальных фосфолипидов - «Эссенциале Н» на канцерогенное действие диэтилнитрозамина (ДЭНА). Исходное число животных Воздействия Число крыс, переживших срок обнаруж ения 1-й опухоли (9 месяцев) Число крыс с опухолями печени Гистологический тип опухоли Число крыс с опухолями почек Общее число животных с опухолями Гепатоцел. рак Гепатоцеладенома Холанг иокарцинома Холангиома Кавернозная гемангиоэндотелиома                       30 ДЭНА 29 26 (89,7%) 16 8 3 5 5 1 27 (93,1%) 23 «Эссенциале Н» + ДЭНА 22 14 (63,6%) 9 3 - - 1 - 14 (63,6%)

Опухоли пищевода (табл.2) развились у 82,8% крыс контрольной группы от эффективного числа животных (29 крыс), индекс множественности составил 5,3±0,55 опухоли на крысу. Во всех случаях опухоли располагались на слизистой оболочке пищевода и имели вид округлых образований диаметром 0,2-0,6 см (см. Фиг.2) Гистологически новообразования классифицированы как папилломы с дисплазией и малигнизацией базальноклеточного типа, высокодифференцированный и низкодифференцированный плоскоклеточный рак.

В группе животных, получавших «Эссенциале Н», новообразования пищевода развились у 54,5% крыс от эффективного числа животных (22 крысы) при индексе множественности 3,1±0,77, т.е. индекс множественности снижался в 1,7 раза, процент торможения составил - 41,5%.

Таблица 2 Влияние препарата «Эссенциале Н» на возникновение опухолей пищевода, индуцированных у крыс диэтилнитрозамином (ДЭНА). Группа Воздействия Количество учтенных животных Количество животных с опухолями (%) Среднее кол-во опухолей на 1 животное (M±m) Торможение возникновения опухолей в % Р Контроль ДЭНА 29 24 (82,8%) 5,3±0,55     Опыт ДЭНА + «Эссенциале» 22 12 (54,5%) 3,1±0,77 -41,5% <0,05

В условиях проведенного эксперимента применение препарата «Эссенциале Н» приводило к достоверному снижению частоты возникновения неопластических изменений в ткани печени, множественности новообразований пищевода, более поздней малигнизации в печени и пищеводе в опытной группе по сравнению с контрольной.

Пример 2. Вторая серия - опыты по изучению влияния препарата «Эссенциале Н» на активность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и эффективность антиоксидантной защиты (АОЗ) - путем оценки изменения каталазной активности и основного антиоксидантного белка плазмы крови - церулоплазмина (ЦП).

Животные были разделены на две группы - контрольную (30 крыс) и подопытную (23 крысы). Животные первой группы получали только ДЭНА по описанной выше методике. Животные подопытной группы наряду с канцерогеном получали препарат «Эссенциале Н» с кормом в дозе 75 мг/кг на протяжении всего эксперимента. Продолжительность опыта составила 16 недель. Животных убивали путем декапитирования в сроки спустя 2 недели, 4 нед., 8 нед., 12 нед., 16 нед.

Полученные результаты свидетельствуют о достоверном увеличении активности антиоксидантных ферментов в эритроцитах крыс опытных групп по сравнению с этими показателями у животных из группы "без воздействия". Таким образом, воздействие препаратов восстанавливает интенсивность реакций свободнорадикального окисления до значений, соответствующих здоровому организму.

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод о том, что использование препарата «Эссенциале Н» привело к улучшению общего состояния животных, которое проявляется в снижении перекисного окисления липидов и увеличении антиоксидантной активности, уменьшении степени интоксикации. Полученные данные подтверждают высказанное целым штатом исследователей мнение о том, что нарушение баланса в системе ПОЛ-АОЗ является одним из основных механизмов, способствующих прогрессированию злокачественного процесса. Вследствие этого, следует признать патогенетически обоснованным применение препаратов с антиоксидантной активностью при гепатоканцерогенезе [Александров В.А., Беспалов В.Г. Принципы и перспективы химиопрофилактики рака // Вопросы онкологии. 1991. №4. С.387-393; 8. Sporn M.B. Suh N. Chemoprevention of cancer. Carcinogenesis. 2000; 3: 525-530]. В условиях проведенного эксперимента применение вышеуказанных препаратов приводило к восстановлению нарушенного баланса в системе ПОЛ-АОЗ, перспективно с целью возможного снижения риска развития первичного рака печени в группах повышенного риска.

В эксперименте действие эссенциальных фосфолипидов оценивалось на 30 различных моделях у 7 видов животных при химической и лекарственной интоксикации. Отмечался благоприятный эффект EPL - улучшались биохимические показатели: окисление липидов, активность трансаминаз, метаболизм гепатоцитов [Гундерманн К.Й., 2002]. EPL были изучены в 186 клинических исследованиях, с участием 11 тыс.пациентов [Минушкин О.Н., 2002]. Их эффективность и безопасность продемонстрированы не только у взрослых пациентов, но и у детей, включая новорожденных. Соевый протеин оказывал ингибирующее влияние на возникновение опухолей молочной железы в эксперименте на крысах [Киреев Г.В., Навзуров С.Н., 2004; Чочиева А.Р., 2000]. Препарат «Эссенциале Н» содержит "чистую" субстанцию EPL без добавочных компонентов, что и обуславливает его терапевтический эффект, а не витаминами, как например в препарате «Эссенциале» (там содержатся помимо EPL еще альфа-токоферол, никотинамид, пиридоксин, рибофлавин, тиамин, цианкобаламин), на которые нередко развивается гипервитаминоз.

Положительные результаты, полученные в эксперименте по применению препарата эссенциальных фосфолипидов - «Эссенциале Н» и некоторых других антиоксидантов, необходимо шире внедрять в клиническую практику.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной онкологии, и касается профилактики канцерогенного действия диэтилнитрозамина у экспериментальных животных. Для этого ежедневно в течение 4 месяцев вводят с питьем диэтилнитрозамин в дозе 100 мг/л в сочетании с антиканцерогеном, который начинают вводить с кормом за 5 дней до введения диэтилнитрозамина. В качестве антиканцерогена вводят «Эссенциале Н» в дозе 75 мг/кг в течение 9 месяцев. Способ обеспечивает эффективную профилактику канцерогенеза в специфических условиях эксперимента. 8 ил., 2 табл.

Способ профилактики канцерогенного действия диэтилнитрозамина, включающий ежедневное введение в течение 4 месяцев с питьем диэтилнитрозамина в дозе 100 мг/л в сочетании с антиканцерогеном, который начинают вводить с кормом за 5 дней до введения диэтилнитрозамина, отличающийся тем, что в качестве антиканцерогена вводят «Эссенциале Н» в дозе 75 мг/кг в течение 9 месяцев.