СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ КАНЦЕРОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ДИЭТИЛНИТРОЗАМИНА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2009 года по МПК A61K31/197 A61K31/355 A61K31/13 A61P35/00 

Изобретение относится к экологии, медицине, токсикологии, экспериментальной биологии, ветеринарии и может быть использовано при гепатоканцерогенезе с профилактической целью в группах повышенного риска по заболеваемости раком печени.

Неуклонный рост заболеваемости злокачественными новообразованиями делает все более актуальной проблему их профилактики, т.е. проблему разработки и применения средств, препятствующих неопластической трансформации клеток и дальнейшему развитию опухолей [Sporn M.B. Suh N., 2000]. Причиной злокачественного роста могут быть канцерогенные нитрозосоединения [N-Nitroso Compounds: Occurrence and Biological Effects and Relevance to Human Cancer. - Eds. I.K. O'Nei, R.C. von Borstel, C.T.Miller, J.Long and H.Bartsch, 1988]. В связи с этим возникла насущная необходимость способов профилактики канцерогенного действия нитрозосоединений на организм человека.

Известны способы предупреждения возникновения доброкачественных и злокачественных опухолей, индуцируемых канцерогенными нитрозосоединениями, при помощи веществ, влияющих на разные этапы бластомогенного процесса: эндогенное образование канцерогенов, в частности нитрозосоединений, из неканцерогенных предшественников в организме, процессы метаболизма химических канцерогенов в организме, взаимодействие химических канцерогенов с ДНК, опухолевую трансформацию поврежденных канцерогеном клеток и дальнейшее развитие бластомогенного процесса.

Значительное количество работ посвящено изучению антиканцерогенных свойств антиоксидантов естественных (витамины Е, С, Р, бета-каротин) и синтетических (бутилгидрокситолуол и др.). Установлено, что в процессе гепатоканцерогенеза происходит интенсификация процессов перекисного окисления, протекающих в частности в липидах, и образование свободных радикалов [Туровецкий В.Б., Ситковский М.В. и соавт., 1974]. Доказано, что нарушение равновесия в системе перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита, приводящее к накоплению свободных радикалов, является одной из причин запуска злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии [Якубовская Р.И., 2000]. Исходя из представлений об участии свободных радикалов в механизме канцерогенеза, ряд исследователей пытались использовать антиоксиданты в качестве ингибиторов бластомогенеза [Джиоев Ф.К., 1984; Эмануэль Н.М, 1974; Sporn М.В. Suh N., 2000; Wattenberg L.W., 1972].

Наиболее близким является способ [Джиоев Ф.К. Влияние селена, фенобарбитала, тетурама и четыреххлористого углерода на канцерогенное действие диэтилнитрозамина и 1,2-диметилгидрозина. // Материалы III-го симп.: «Канцерогенные N-нитрозосоединения - действие, синтез, определение». Таллин. - 1978. - С.51-53] химиопрофилактики рака в эксперименте, предупреждая возникновение опухолей и супрессии печеночного канцерогенеза, индуцированного диэтилнитрозамином, дачу которого осуществляли с питьем в дозе 100 мг/л в течение первых 4 месяцев, с профилактической целью использовали селенисто-кислый натрий (селенит натрия) в дозе 6 ppm/л воды в течение 6 месяцев, который был взят нами за прототип.

Недостатком прототипа является то, что селенисто-кислый натрий токсичен в высоких дозах, нецелесообразно его применение в регионах с высоким содержанием селена в воде, почве и пищевых продуктах, сроки введения были сокращены.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики канцерогенного действия диэтилнитрозамина у экспериментальных животных.

Решение этой задачи обеспечивает значительное снижение канцерогенного действия диэтилнитрозамина, что выражается в достоверном снижении частоты возникновения неопластических изменений в ткани печени, множественности новообразований пищевода, более поздней малигнизации в печени и пищеводе в опытной группе по сравнению с контрольной, увеличении продолжительности жизни и выживаемости животных, снижении уровня перекисного окисления липидов, увеличении активности антиоксидантных ферментов - каталазы и церулоплазмина.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение - способ профилактики канцерогенного действия диэтилнитрозамина у экспериментальных животных - имеет следующие существенные признаки: животным 4 раза в неделю вводят с кормом антиканцероген - поливитаминный препарат «Каскорутол» в дозе 0,4 г/кг в течение 9 месяцев, а диэтилнитрозамин в дозе 100 мг/кг через 5 дней от начала введения «Каскорутола» в течение 4 месяцев.

Каскорутол представляет собой поливитаминный комплексный препарат, содержащий в 1 драже бета-каротина 2,5 мг, аскорбиновой кислоты 25 мг, альфа-токоферола 12,5 мг, рутина 12,5 мг. Его можно рассматривать как своеобразную взаиморегенерируемую АОС. В этой системе бета-каротин улавливает и обезвреживает синглетный кислород, переводя его в триплетное состояние и другие свободные радикалы, совместно с α-токоферолом, который регенерирует бета-каротин. Аскорбиновая кислота переводит α-токоферол из окисленной формы в восстановленную, а рутин, в свою очередь, регенерирует аскорбиновую кислоту. Синергизм действия компонентов комплекса позволяет получать высокий эффект при использовании их в физиологических дозах.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что в качестве антиканцерогена используется поливитаминный комплексный препарат «Каскорутол», который ведет к торможению бластомогенного процесса в печени и пищеводе, увеличению продолжительности жизни и выживаемости животных, снижению уровня перекисного окисления липидов, увеличению активности антиоксидантных ферментов - каталазы и церулоплазмина.

Заявляемый способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики канцерогенного действия диэтилнитрозамина у экспериментальных животных, включающий введение диэтилнитрозамина с питьем и антиканцерогена с кормом, отличающийся тем, что в качестве антиканцерогена вводят «Каскорутол» в дозе 0,4 г/кг в течение 9 месяцев, а диэтилнитрозамин в дозе 100 мг/кг через 5 дней от начала введения «Каскорутола» в течение 4 месяцев, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики токсического действия диэтилнитрозамина путем приема препарата «Каскорутол», что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом. Опухоли пищевода и печени индуцировали добавлением к питьевой воде диэтилнитрозамина (ДЭНА) в концентрации 100 мг/кг в течение первых 4 месяцев. Раствор ДЭНА давали контрольной и подопытной группам. За пять дней до начала дачи канцерогена животным подопытной группы начинали вводить с кормом 4 раза в неделю препарат «Каскорутол» в дозе 0,4 г/кг массы тела. По истечении времени эксперимента (9 месяцев) проводили макроскопическое исследование внутренних органов, гистологическое исследование тканей пищевода и печени. Полученные результаты в контрольной и подопытной группах сравнивали. По истечении второй серии эксперимента (4 месяца) оценивали интенсивность процессов ПОЛ по накоплению вторичных продуктов липидной пероксидации, основным из которых является малоновый диальдегид (МДА), а также определяли состояние антиоксидантной защиты (АОЗ) по уровню активности ключевого антиоксидантного фермента - каталазы и основного антиоксидантного белка плазмы крови - церулоплазмина (ЦП), изменение которого свидетельствует о проявлении адаптивной реакции.

Для гистологических исследований образцы тканей (печень, почка, сердце) фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80×120×600.

Интенсивность процессов ПОЛ исследовали по накоплению вторичных продуктов липидной пероксидации, основным из которых является малоновый диальдегид (МДА) [Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль Л.М. Анализ методов определения ПОЛ в сыворотке крови по тесту тиобарбитуровой кислоты. // Вопросы мед. химии. 1981. №1. С.118-122]. Содержание МДА определяли спектрофотометрически в тесте с тиобарбитуровой кислотой с образованием триметинового комплекса с максимумом поглощения при 532 нм по методу Hunter Е.А. (1963), M.Uchiyama, M.Mihara (1978) в модификации Л.И.Андреевой и соавт. [Андреева Л.И., Кожемякина Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобаритуровой кислотой. // Лабораторной дело. 1988. №11. С.41-43]. Состояние антиоксидантной защиты (АОЗ) изучали по уровню активности ключевого антиоксидантного фермента -каталазы и основного антиоксидантного белка плазмы крови - церулоплазмина (ЦП), изменение которого свидетельствует о проявлении адаптивной реакции. Активность каталазы крови определяли фотометрически методом по Баху и Зубковой [Королюк М.А., Майорова И.Г. и соавт. Метод определения активности каталазы. // Лаборатное дело. №1. С.16-19]. Содержание ЦП определяли простым колориметрическим методом, разработанным Равиным (1956) и основанным на реакции окисления р-фенилендиамина [Колб В.Т., Камышников B.C. Справочник по клинической химии. Минск: Буларусь, 1982. 366 С.].

Сущность заявляемого способа подтверждается макроскопически и морфологически (для наглядности изменений в органах макро- и микрофотографии см. в цветном виде.

Фиг.1. Опухоль печени, индуцированная диэтилнитрозамином (ДЭНА) у крысы; 9 месяцев после начала введения препарата.

Фиг.2. Множественные папилломы пищевода.

Фиг.3. Гепатоцеллюлярный рак низкодифференцированный. Гематоксилин-эозин. х120.

Фиг.4. Гепатохолангиома. Гематоксилин-эозин. х120.

На крысах-самцам линии Вистар с исходной массой тела 130-140 грамм были проведены две серии опытов.

Пример 1. Первая серия - опыты по изучению влияния поливитаминного препарата «Каскорутол» на возникновение опухолей печени и пищевода, индуцированных при помощи диэтилнитрозамина (ДЭНА). Опыты проводились на крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 130-140 грамм, полученных из вивария Пятигорской фармацевтической академии. Животные содержались на пищевом рационе вивария. В качестве канцерогенного агента использовано вещество - N-диэтилнитрозамин (ДЭНА), синтезированное в НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова МЗ РФ. Опухоли печени и пищевода индуцировали по описанной методике (Ф.К.Джиоев, 1973) [Джиоев Ф.К. О влиянии некоторых адаптогенов на экспериментальный канцерогенез. // Автореферат на соискание ученой степени канд. мед. наук. - Л., 1966] добавлением к питьевой воде ДЭНА в концентрации 100 мг/л воды в течение 4 месяцев. Животные были разделены на 2 группы -контрольную (30 крыс) и подопытную (23 крысы). Животные контрольной группы получали только гепатоканцероген. Животные подопытной группы, наряду с канцерогеном, получали поливитаминный препарат «Каскорутол» в дозе 0,4 г/кг (разовая доза 4 драже/кг) 4 раза в неделю с кормом на протяжении всего эксперимента. Продолжительность опыта составила 36 недель. Животных по окончании эксперимента умерщвляли парами фторотана, вскрывали и проводили макроскопическое исследование внутренних органов.

При анализе микроскопических изменений в печени и пищеводе крыс основывались на классификации опухолей лабораторных животных, предложенной Международным агентством по изучению рака [Pathology of tumors in laboratory animals. Vol.1. Tumors of rat. Sekond adetion. Edited by V.S.Turusov and U.Mohr.-Lyon: IARC Scientific Publicaitions №99. - 1990. - 754 р.]. Об эффективности модифицирующего воздействия на канцерогенез судили по изменению количества крыс с неопластическими процессами, среднего латентного периода возникновения новообразований, индекса множественности в опытной группе по сравнению с контролем.

Результаты: в контрольной группе неопластические изменения в ткани печени обнаружены у 89,7% от эффективного числа животных (29 крыс) (см. Фиг.1). Первая крыса с предопухолевыми изменениями в печени пала на 12-й неделе эксперимента. Микроскопическое изучение ткани печени показало наличие гиперплазии протоков и очагов эозинофильно- и базофильноклеточной гиперплазии гепатоцитов (см. Фиг.3, 4). Злокачественные новообразования впервые были идентифицированы у трех крыс контрольной группы, павших на 21 неделе опыта: высокодифференцированный гепатоцеллюлярный рак и холангиоцеллюлярный рак, развившийся на фоне цирроза и гиперплазии протоков и/или гепатоцитов. Суммарно при морфологическом анализе неопластических изменений у 16 крыс контрольной группы идентифицирован высоко-, умеренно- или низкодифференцированный гепатоцеллюлярный рак, у 8 крыс - гепатоцеллюлярная аденома, у 3 - холангиоцеллюлярный рак, у 5 - холангиомы, у 6 - кавернозная гемангиоэндотелиома. Эти процессы развивались на фоне диффузных и очаговых гиперплазий гепатоцитов и/или протоков, а также цирротических процессов разной степени выраженности (Табл.1).

В группе животных, получавших «Каскорутол», неопластические изменения ткани печени обнаружены у 77,3% от эффективного числа животных (22 крысы). Микроскопический анализ гистологического материала показал, что в данной группе в 13 случаях имел место гепатоцеллюлярный рак, у 5 - гепатоцеладенома, у 1 - холангиокарцинома, у 2 - холангиома, у 1 - кавернозная гемангиоэндотелиома, у 11 животных идентифицирована гиперплазия протоков, в том числе кистозная (Фиг.5).

Опухоли пищевода (табл.2) развились у 82,8% крыс контрольной группы от эффективного числа животных (29 крыс), индекс множественности составил 5,3±0,55 опухоли на крысу (см. Фиг.2). Во всех случаях опухоли располагались на слизистой оболочке пищевода и имели вид округлых образований диаметром 0,2-0,6 см. Гистологически новообразования классифицированы как папилломы с дисплазией и малигнизацией базальноклеточного типа, высокодифференцированный и низкодифференцированный плоскоклеточный рак. В группе животных, получавших «Каскорутол», новообразования пищевода развились у 50% крыс от эффективного числа животных (22 крысы) при индексе множественности 3,0±0,81, т.е. индекс множественности снижался в 1,8 раза, процент торможения составил -43,4%.

В условиях проведенного эксперимента применение комплексного поливитаминного препарата «Каскорутол» приводило к достоверному снижению частоты возникновения неопластических изменений в ткани печени, множественности новообразований пищевода, более поздней малигнизации в печени и пищеводе в опытной группе по сравнению с контрольной.

Вторая серия - опыты по изучению влияния препарата «Каскорутол» на активность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и эффективность антиоксидантной защиты (АОЗ) - путем оценки изменения каталазной активности и основного антиоксидантного белка плазмы крови - церулоплазмина (ЦП).

Животные были разделены на две группы - контрольную (30 крыс) и подопытную (23 крысы). Животные первой группы получали только ДЭНА по описанной выше методике. Животные подопытной группы наряду с канцерогеном получали препарат «Каскорутол» с кормом в дозе 0,4 г/кг (разовая доза 4 драже/кг) 4 раза в неделю на протяжении всего эксперимента. Продолжительность опыта составила 16 недель. Животных убивали путем декапитирования в сроки спустя 2, 4, 8, 12, 16 недель.

Полученные результаты свидетельствуют о достоверном увеличении активности антиоксидантных ферментов в эритроцитах крыс опытных групп по сравнению с этими показателями у животных из группы "без воздействия". Таким образом, воздействие препаратов восстанавливает интенсивность реакций свободнорадикального окисления до значений, соответствующих здоровому организму (фиг.6 - 8).

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод о том, что использование препарата «Каскорутол» привело к улучшению общего состояния животных, которое проявляется в снижении перекисного окисления липидов и увеличении антиоксидантной активности, уменьшении степени интоксикации. Полученные данные подтверждают высказанное целым рядом исследователей мнение о том, что нарушение баланса в системе ПОЛ-АОЗ является одним из основных механизмов, способствующих прогрессированию злокачественного процесса. Вследствие этого следует признать патогенетически обоснованным применение препаратов с антиоксидантной активностью при гепатоканцерогенезе [Александров В.А., Беспалов В.Г. Принципы и перспективы химиопрофилактики рака. // Вопросы онкологии. 1991. №4. С.387-393.; 8.Sporn М.В. Suh N. Chemoprevention of cancer. Carcinogenesis. 2000; 3: 525-530]. В условиях проведенного эксперимента применение вышеуказанных препаратов приводило к восстановлению нарушенного баланса в системе ПОЛ-АОЗ, перспективно с целью возможного снижения риска развития первичного рака печени в группах повышенного риска.

Антиканцерогенная активность комплексного препарата «Каскорутол» обусловлена, прежде всего, синергизмом антиоксидантных свойств входящих в него витаминов, обеспечивающих защиту клетки от повреждающего действия свободных радикалов, и определенной иммуномодулирующей активностью компонентов препарата.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для профилактики канцерогенного действия диэтилнитрозамина у экспериментальных животных. Способ осуществляется следующим образом. В качестве антиканцерогена вводят каскорутол в дозе 0,4 г/кг в течение 9 месяцев, а диэтилнитрозамин вводят в дозе 100 мг/л через 5 дней от начала введения каскорутола в течение 4 месяцев. Изобретение обеспечивает значительное снижение канцерогенного действия диэтилнитрозамина за счет торможения бластомогенного процесса, снижения уровня перекисного окисления липидов, увеличения активности антиоксидантных ферментов. 8 ил., 2 табл.

Способ профилактики канцерогенного действия диэтилнитрозамина у экспериментальных животных, включающий введение диэтилнитрозамина с питьем и антиканцерогена с кормом, отличающийся тем, что в качестве антиканцерогена вводят каскорутол в дозе 0,4 г/кг в течение 9 месяцев, а диэтилнитрозамин вводят в дозе 100 мг/л через 5 дней от начала введения каскорутола в течение 4 месяцев.