СПОСОБ НОРМАЛИЗАЦИИ ИЗМЕНЕННОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ НИТРИТОВ В КРОВИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2011 года по МПК A61N5/02 

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиологии, и может быть использовано для восстановления пониженной продукции нитритов в крови у кардиологических больных.

В настоящее время в высокоразвитых странах характерно увеличение продолжительности жизни человека, улучшение питания, снижение доли физического труда в профессиональной деятельности. Одновременно с этим возникают новые социальные и медицинские проблемы, связанные с ростом темпа жизни, необходимостью усваивать больший объем информации, быстро решать сложные задачи, овладевать новыми профессиями, осваивать труднодоступные регионы земного шара.

В связи с этим проблема стресса, адаптации и профилактики стрессорных повреждений выдвинулась в число наиболее актуальных проблем современной биологии и медицины (Судаков К.В. Стресс: постулаты, анализ с позиций общей теории функциональных систем // Патол. физиол. и эксперим. терапия. - 1992. - №4. - С.86-93).

Одним из важнейших факторов, приводящих к развитию заболеваний сердечно-сосудистой системы, является острый или хронический стресс (Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. М.: Наука, 1981. - 425 с.).

Начальным этапом в патогенезе различных заболеваний сердечно-сосудистой системы является эндотелиальная дисфункция (Stokes K.Y., Granger D.N. The microcirculation: a motor for the systemic inflammatory response and large vessel disease induced by hypercholestcrolaemia? // J Physiol. - 2004. - V.562 - №3. - P.647-653). Дисфункция эндотелия сопровождается снижением продукции вазодилататорных, антитромбогенных агентов и преобладанием вазоконстрикторных и прокоагулянтных факторов, что приводит к повышению тонуса сосудов и провоцирует развитие тромбозов.

Одним из важнейших факторов, синтезируемых эндотелием, является оксид азота (Ignarro L.G., Murad F. Nitric oxide: biochemistry, molecular biology and therapeutic implication //Adv. Pharmacol. - 1995. - V.34. - P.1-516). Оксид азота представляет собой уникальный по своей природе и механизмам действия вторичный мессенджер в большинстве клеток организма. Он участвует в реализации многих важных физиологических функций, таких как вазодилатация, нейротрансмиссия, агрегация тромбоцитов, регуляция продукции биологически активных веществ, в частности простациклина, регуляция тонуса гладких мышц, реакциях иммунной системы, состояние памяти и др. (Anggard E. Nitric oxide: mediator, murderer and medicine // Lancet. 1994. №343, p.1199-1206).

Эндогенный оксид азота существует и непрерывно синтезируется в органах, тканях и клетках ферментативным путем при участии NO-синтаз - семейства цитохром Р-450-подобных ферментов, использующих в качестве субстрата аминокислоту L-аргинин. Образующийся в организме оксид азота, окисляясь, переходит в нитриты, а затем в нитраты (Карпюк В.Б., Черняк Ю.С., Шубич М.Г. Лабораторный мониторинг нитроксидергической вазорелаксации при субарахноидальном кровоизлиянии // Клиническая и лабораторная диагностика. - 2000. - №5. - С.16-19).

Доказано, что у больных уже на начальных стадиях развития заболеваний сердечно-сосудистой системы происходит снижение синтеза оксида азота эндотелием, что проявляется снижением концентрации в крови его стабильных метаболитов - нитритов и нитратов (Манухина Е.Б., Лямина Н.П., Долотовская П.В., Лямина С. В. Роль оксида азота и кислородных свободных радикалов в патогенезе артериальной гипертензии // Кардиология. - 2002. - №11. - C.34-7).

Исследование и разработка методов регулирования и поддержания физиологического уровня концентраций эндогенного оксида азота в клетках, органах и в организме в целом представляет несомненный научный и практический интерес.

Существующие в настоящее время медикаментозные методы коррекции функционального состояния системы оксида азота нередко оказываются недостаточно эффективными, требуют тщательный лабораторный и клинический контроль во время применения, имеют широкий спектр противопоказаний и побочных эффектов. Многие авторы отмечают высокую стоимость медикаментозного лечения (Усенко В.А. Фармацевтический маркетинг, ценовая политика фармацевтических фирм // Провизор. - 1999. - №21. - С.34-35) Более того, использование в клинической практике органических нитратов в качестве донаторов оксида азота сопровождается развитием толерантности и перекрестной толерантности, что может усугублять эндотелиальную дисфункцию, еще больше снижая продукцию оксида азота эндотелием (Münzel Т., Daiber A., Mülsch A. Explaining the Phenomenon of Nitrate Tolerance //AHA Circulation Research. - 2005. - V.97. - P.618-645).

Таким образом, очевидна необходимость совершенствования методов регуляции синтеза оксида азота и поиска новых альтернативных терапевтических и экспериментальных подходов.

Новым перспективным и доступным методом лечения широкого круга заболеваний является терагерцовая терапия. Терагерцовый диапазон частот (100 ГГц - 10 ТГц) интересен тем, что именно в нем, в основном, сосредоточены частотные спектры поглощения и излучения важнейших клеточных метаболитов - NO, O₂, СО₂, СО, ОН- и др. (Бецкий О.В., Креницкий А.П. Биофизические эффекты волн терагерцового диапазона и перспективы развития нового направления в биомедицинской технологии: «Терагерцовая терапия» и «Терагерцовая диагностика» // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. - 2003. - №12. - С.3-6). Фундаментальной основой функционирования сложных биологических систем являются молекулы-метаболиты, стабильные и строго воспроизводимые молекулярные структуры биосреды. Поэтому детерминированное управление их реакционной способностью излучением, совпадающим со спектрами их излучения и поглощения, делает возможным регуляцию их процесса метаболизма в биосреде. Анализ биомедицинских эффектов электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров атмосферных газов-метаболитов показывает прямую связь спектров заданного метаболита и его свойств в биосреде. Это соответствует представлениям о веществе и поле как о единой системе (Бецкий О.В., Креницкий А.П. Биофизические эффекты волн терагерцового диапазона и перспективы развития нового направления в биомедицинской технологии: «Терагерцовая терапия» и «Терагерцовая диагностика» // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. - 2003. - №12. - С.3-6). Так, показано благоприятное влияние электромагнитного излучения терагерцового диапазона на частотах клеточных метаболитов на динамику показателей микрбциркуляции, гемостаза и фибринолиза, что может играть важную роль в профилактике нарушений функционального состояния тромбоцитов и гиперкоагуляции у больных инфарктом миокарда, стенокардией, сосудистыми заболеваниями головного и спинного мозга (Паршина С.С., Киричук В.Ф., Головачева Т.В. и др. Первый опыт клинического применения электромагнитного излучения терагерцового диапазона на частотах молекулярного спектра оксида азота // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника, 2004, №11, с.44-54; Паршина С.С. Клинические особенности использования ТГЧ - терапии - NO у больных стенокардией // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника, 2006, №1-2, с.4-11; Бецкий О.В., Креницкий А.П. Биофизические эффекты волн терагерцового диапазона и перспективы развития нового направления в биомедицинской технологии: «Терагерцовая терапия» и «Терагерцовая диагностика» // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника, 2003, №12, с.3-6). Обнаружено выраженное антистрессорное действие электромагнитного излучения терагерцового диапазона на частотах оксида азота 150,176-150,664 ГГц (Киричук В.Ф., Цымбал А.А. и др. Изменения концентрации кортикостерона - маркера стресс-реакции под влиянием терагерцового излучения на частотах оксида азота 150,176-150,664 ГГц // Рос. Физиологический журнал им. И.М.Сеченова. - 2008. - №11. - С.85-90).

Прототипом настоящего исследования является способ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПОНИЖЕННОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ НИТРИТОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ В УСЛОВИЯХ СТРЕССА, заключающийся в том, что область мечевидного отростка грудины белых крыс, находящихся в состоянии острого иммобилизационного стресса, облучают электромагнитными волнами терагерцового диапазона, при этом используют частоты молекулярного спектра излучения и поглощения оксида азота 150,176-150,664 ГГц плотностью мощности 0,2 мВт/см². Облучение проводят в течение 30 минут.

Недостатком данного метода является то, что для нормализации концентрации нитритов у животных требуется очень длительное время облучения - 30 минут терагерцовыми волнами на частотах молекулярного спектра излучения и поглощения оксида азота 150,176-150,664 ГГц.

Авторами впервые предложен способ нормализации измененной концентрации нитритов в крови в эксперименте путем воздействия на организм животного терагерцовыми волнами на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мкВт/см² в течение 15 минут.

Также следует отметить, что, с одной стороны, авторами впервые установлено, что именно терагерцовые волны на частоте атмосферного кислорода 129,0 ГГц способны нормализовывать измененную концентрацию нитритов в крови, а с другой, благодаря указанному излучению значительно сокращено (в 2 и более раз) время терапевтического воздействия на организм животного, что, несомненно, является инновационным (восстановление концентрации нитритов начинается уже при 5 минутах воздействия и своего максимума (физиологически оптимального) достигает при 15 минутах воздействия). Предлагаемый способ позволяет нормализовать продукцию оксида азота, а также функцию эндотелия при постстрессорных состояниях.

В отличие от заявленного прототипа наш метод основан на определении концентрации нитритов именно в сыворотке крови, а не плазме, как указано в прототипе. Метод определения концентрации нитритов в сыворотке крови является более точным, физиологичным и химически чистым экспериментом, так как плазма крови содержит белки (именно фибриноген), которые оказывают существенное влияние на показатели концентрации нитритов и в большинстве случаев нитриты в плазме вообще не определяют.

Изучали образцы крови 60 белых беспородных крыс-самцов массой 180-220 г. В качестве модели, имитирующей нарушения продукции оксида азота, применяли острый иммобилизационный стресс - фиксация крыс в положении на спине в течение 3 часов (Киричук В.Ф., Антипова О.Н., Креницкий А.П., Тупикин В.Д., Майбородин А.В., Бецкий О.В., Иванов А.Н., Цымбал А.А., Помошникова О.И. Способ профилактики и коррекции стрессорных повреждений организма. Патент РФ №2284827 от 10 октября 2006 года).

Исследование проводилось в 5 группах животных по 12 особей в каждой: 1 группа - контрольная - интактные животные; 2 группа - группа сравнения, животные в состоянии острого иммобилизационного стресса; 3, 4 и 5 группы - опытные, в которых животные подвергались однократному облучению в течение 5, 15 и 30 минут соответственно на фоне иммобилизации. Для устранения влияния сезонной и циркадной зависимости на продукцию оксида азота эксперименты проводились в зимний период календарного года в первой половине дня, в одно и то же время. Все животные при проведении эксперимента находились в одинаковых условиях.

Однократное облучение области мечевидного отростка грудины животных, находящихся в состоянии острого иммобилизационного стресса, проводилось электромагнитными волнами терагерцового диапазона на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мВт/см², заданной генератором «КВЧ-О₂», разработанным впервые в ОАО «Центральный научно-исследовательский институт измерительной аппаратуры» (г.Саратов) совместно с ФГУП «НПП-Исток» г.Фрязино и Медико-технической ассоциацией КВЧ г.Москва (Патент на полезную модель №66961 «Аппарат для воздействия электромагнитными волнами крайне высокой частоты» 10 октября 2007 г.). Структура молекулярного терагерцового спектра электромагнитного излучения атмосферного кислорода формируется в нем в соответствии с методами, предложенными и реализованными в квазиоптическом КВЧ генераторном комплексе моделирования детерминированных шумов для биофизических исследований, разработанным в ОАО «Центральный научно-исследовательский институт измерительной аппаратуры» (г.Саратов) (Патент на полезную модель №66961 «Аппарат для воздействия электромагнитными волнами крайне высокой частоты» от 10 октября 2007 г.).

Забор крови для исследования концентрации нитритов осуществляли в пластиковые пробирки путем пункции сердца.

Определение концентрации нитритов в сыворотке крови проводилось с использованием реактива Грисса по методу Карпюка В.Б. и соавторов (Карпюк В.Б., Черняк Ю.С., Шубич М.Г. Лабораторный мониторинг нитроксидергической вазорелаксации при субарахноидальном кровоизлиянии // Клиническая и лабораторная диагностика. - 2000. - №5. - С.16-19).

При анализе результатов исследования показано, что у крыс, находящихся в состоянии острого иммобилизационного стресса, наблюдалось статистически достоверное по сравнению с группой интактных животных снижение нитритов в сыворотке крови, что свидетельствует об угнетении продукции оксида азота (таблица).

Таким образом, при остром иммобилизационном стрессе происходит нарушение продукции оксида азота, что требует, несомненно, коррекции (таблица).

Воздействие терагерцовым излучением на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мВт/см² в течение 5 минут на животных, находящихся в состоянии острого иммобилизационного стресса, приводило к частичному увеличению концентрации нитритов в сыворотке крови.

Следовательно, представленные данные свидетельствуют о том, что терагерцовое излучение на частоте атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности -100 мкВт/см² уже в течение 5 минут способствует незначительному (частичному), но восстановлению нарушенной продукции оксида азота.

Применение электромагнитных волн терагерцового диапазона на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мВт/см² в течение 15 минут вызывает полную статистически достоверную нормализацию концентрации нитритов в сыворотке крови у экспериментальных животных (таблица).

При воздействии на животных на фоне острого иммобилизационного стресса электромагнитными волнами терагерцового диапазона на указанной частоте в течение 30 минут также наблюдается полное статистически достоверное восстановление нарушенной продукции оксида азота (таблица). Следует отметить, что диапазон вариабельности концентраций нитритов в сыворотке крови у животных, подвергнутых облучению в течение 30 минут терагерцовыми волнами на частоте атмосферного кислорода 129,0 ГГц на фоне острого иммобилизационного стресса, значительно шире вариабельности данного показателя у животных группы контроля (таблица). В некоторых случаях установлено также увеличение концентрации нитритов в сыворотке крови по сравнению с группой интактных животных.

Следовательно, 30-минутное воздействие терагерцовыми волнами на частоте молекулярного спектра атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мкВт/см² обладает свойством не только восстанавливать измененную концентрацию нитритов в сыворотке крови, но даже и в некоторых случаях незначительно увеличивать ее относительно контрольной группы животных - 0,82 (0,61-0,90) мкг/мл.

Таким образом, терагерцовое излучение на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мВт/см² в течение 15 минут является оптимальным режимом для восстановления измененной концентрации нитритов в сыворотке крови в эксперименте, так как при минимально возможном времени экспозиции терагерцового излучения (15 минут) достигается максимальный физиологический эффект, не превышающий оптимальных физиологических показателей, зафиксированных у животных контрольной группы.

Пример 1.

У интактной крысы 1 была определена концентрация нитритов в сыворотке крови, она составила 0,75 мкг/мл.

Затем животное было подвергнуто трехчасовому острому иммобилизационному стрессу. В ходе развития стресс-реакции зарегистрировано угнетение продукции оксида азота, что выражается в снижении концентрации стабильных метаболитов оксида азота - нитритов в сыворотке крови до уровня 0,22 мкг/мл.

Далее животное облучалось электромагнитными волнами терагерцового диапазона на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мВт/см² в течение 15 минут. В образце крови крысы, подвергнутой облучению, обнаружена статистически достоверная нормализация концентрации нитритов до уровня интактных животных, и она составила 0,71 мкг/мл.

Указанные факты свидетельствуют о восстановлении продукции оксида азота.

Таким образом, способ нормализации измененной концентрации нитритов в крови в эксперименте под влиянием электромагнитного излучения терагерцового диапазона на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мВт/см² в течение 15 минут может быть использован в экспериментальной и клинической кардиологии как новый метод эффективной коррекции и нормализации продукции оксида азота и как один из методов, нормализующих функции эндотелия сосудов.

Таблица
Концентрация нитритов в сыворотке крови у животных в состоянии иммобилизационного стресса и подвергнутых терагерцовому облучению на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц Показатели Интактные животные (n=12) Стресс (n=12) Облучение на фоне стресса в течение 5 минут (n=12) 15 минут (n=12) 30 минут (n=12) Концентрация нитритов, мкг/мл 0,76 (0,66; 0,81) 0,21 (0,20; 0,24) P₁<0,01 0,35 (0,25; 0,45) P₁<0,05; P₂<0,05 0,62 (0,50; 0,72) P₂>0,05; P₂<0,01 P₃<0,05 0,82 (0,61; 0,90) P₁>0,05; P₂<0,01; P₃<0,05; P₄>0,05 Примечание: В каждом случае приведены средняя величина (медиана), нижний и верхний квартили (25%,75%) из соответствующего числа измерений. P₁ - по сравнению с группой интактных животных; Р₂ - по сравнению с группой животных, подвергнутых острому иммобилизационному стрессу; P₃ - по сравнению с группой животных, подвергнутых 5-минутному облучению на фоне стресса; P₄- по сравнению с группой животных, подвергнутых 15-минутному облучению на фоне стресса.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к кардиологии, и может быть использовано для восстановления пониженной продукции нитритов в крови. Для этого проводят облучение электромагнитными волнами терагерцового диапазона области мечевидного отростка грудины белых крыс в состоянии острого иммобилизационного стресса. При этом частота излучения - 129,0 ГГц, плотность мощности - 100 мкВт/см². Облучение проводят в течение 15 минут. Предлагаемый способ позволяет нормализовать продукцию оксида азота, а также функцию эндотелия при постстрессорных состояниях. 1 табл.

Способ нормализации измененной концентрации нитритов в крови в эксперименте, включающий облучение электромагнитными волнами терагерцового диапазона области мечевидного отростка грудины белых крыс в состоянии острого иммобилизационного стресса, отличающийся тем, что облучают животных электромагнитными волнами терагерцового диапазона на частоте 129,0 ГГц при плотности мощности 100 мкВт/см² в течение 15 мин.