СПОСОБ ПОДВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ Yersinia pestis МЕТОДОМ МУЛЬТИЛОКУСНОГО СИКВЕНС-ТИПИРОВАНИЯ Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы.

Согласно существующей в настоящее время внутривидовой классификации возбудителя чумы - Yersinia pestis штаммы чумного микроба делят на подвиды и биовары. Однако фенотипическая экспрессия дифференциальных биохимических признаков может значительно варьировать в зависимости от условий существования возбудителя. Поэтому более надежными являются способы, основанные на генетических свойствах, отличающихся большей стабильностью и поэтому дающих хорошо воспроизводимые результаты.

Циркулирующие в природных очагах чумы на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья штаммы чумного микроба объединены в 5 подвидов: основной и 4 неосновных - кавказский, алтайский, гиссарский и улегейский. Несмотря на то что штаммы всех пяти подвидов очень близки по свойствам, они значительно отличаются по вирулентности и эпидемической значимости, и поэтому разработка эффективных и надежных методов генетической дифференциации подвидов Y.pestis имеет важное значение.

Используемые для дифференциации штаммов Y.pestis способы основаны на секвенировании ряда генов жизнедеятельности и вирулентности возбудителя (Achtman et al., 1999; Kotetishvili et al., 2005), которые отличаются значительным консерватизмом, ограничивающим их применение для проведения внутривидового генотипирования возбудителя чумы. С другой стороны, применение для этих целей высоко изменчивых участков генома, содержащих вариабельные тандемные повторы (VNTR), также не позволяет проводить надежную подвидовую дифференциацию штаммов Y.pestis из-за их высокой вариабельности или расположения в нестабильных областях генома, которые могут утрачиваться в результате протяженных делеций (Брюханов с соавт., 2001; Klevitska et al., 2001; Сучков с соавт., 2006; Булгакова с соавт., 2008).

Известен способ дифференциации иерсиний методом мультилокусного сиквенс-типирования фрагментов генов жизнедеятельности glnA, gyrB, recA, Y-НSР60, полученных в полимеразной цепной реакции (Kotetishwili et al. Multilocus sequence typing for studying genetic relationships among Yersinia species. J. Clin. Microbiol. 2005. Vol.43, N6. P.2674-2684). Однако использование этих генов позволяет дифференцировать возбудителя чумы от других представителей рода Yersinia, но не проводит внутривидовую дифференциацию чумного микроба и не позволяет определять подвидовую принадлежность штамма. В литературе отсутствуют и другие публикации об использовании метода мультилокусного сиквенс-типирования для проведения подвидовой дифференциации возбудителя чумы.

Задачей изобретения является поиск в геноме чумного микроба менее консервативных генов, отличающихся большей вариабельностью нуклеотидных последовательностей, использование которых позволяет проводить подвидовую дифференциацию штаммов Y.pestis методом мультилокусного сиквенс-типирования.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в обеспечении проведения подвидовой дифференциации штаммов чумного микроба методом мультилокусного сиквенс-типирования.

Технический результат достигается способом дифференциации штаммов возбудителя чумы методом мультилокусного сиквенс-типирования, который предусматривает выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции с амплификацией фрагментов генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH, при этом олигонуклеотидные праймеры на эти гены имеют следующие последовательности:

В полученной нуклеотидной последовательности фрагментов генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH по нуклеотидам, находящимся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, 773 гена araC, 988 и 989 гена metB, 1087-1089 гена aspA и 552 гена thiH устанавливают генотип, по определенным аллелям генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH устанавливают сиквенс-тип (ST) штамма Y.pestis с последующей дифференциацией штаммов путем сравнения установленного сиквенс-типа с сиквенс-типами основного и неосновных подвидов. Основной подвид имеет сиквенс-тип 1 ST - rhS1 arC1 mtB1 apA1 tH1; кавказский - 2 ST - rhS2 arC1 mtB2 apA2 tH2; алтайский - 3 ST - rhS3 arC2 mtB2 арА3 tH1; гиссарский - 4 ST - rhS4 arC2 mtB3 арА3 tH1; улегейский - 5 ST - rhS3 arC1 mtB2 apA2 tH1.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма чумного микроба проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности».

Полимеразную цепную реакцию осуществляют по стандартной методике (МУ 1.3.1794-03) с применением вышеуказанных праймеров на гены rhaS, araC, metB, aspA и thiH. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для амплификации в ПЦР фрагментов генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH, рассчитаны на основе нуклеотидных последовательностей этих генов у штаммов чумного микроба CO92, Pestoides F, Angola и 91001, представленных в базе данных NCBI GenBank. С помощью рассчитанных праймеров проводят в ПЦР амплификацию фрагментов генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH и определяют нуклеотидные последовательности полученных фрагментов генов. Олигонуклеотидные праймеры на гены rhaS, araC, metB, aspA и thiH имеют следующий состав:

Полимеразную цепную реакцию с амплификацией фрагментов генов rhaS, araC, metB, as-рА и thiH с применением праймеров RhaS-s и RhaS-as, AraC-s и AraC-as, MetB-s и MetB-as, AspA-s и AspA-as, ThiH-s и ThiH-as осуществляют по следующей программе: 1-й цикл - 95°С, 5 мин; затем 35 циклов - 95°С, 45 сек; 56°С, 45 сек; 72°С, 1 мин и завершающий цикл 72°С - 5 мин.

Определение нуклеотидных последовательностей ПЦР - фрагментов генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH проводят на автоматическом секвенаторе по методу F.Sanger et al. (1977) с использованием прямых и обратных праймеров.

Для установления генотипа исследуемого штамма проводят определение нуклеотидов, находящихся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, 773 гена araC, 988 и 989 гена metB, 1087-1089 гена aspA и 552 гена thiH.

Штаммы основного подвида имеют генотип rhaS: 482-G, 494-Т, 671-А; araC: 773-T; metB: 988-Т, 989-А; aspA: 1087-1089 - TTG; thiH: 552-A,

кавказского подвида имеют генотип rhaS: 482-G, 494-С, 671-G; araC: 773-T; metB: 988-G, 989-Т; aspA: 1087-1089 - TCG; thiH: 552-T,

алтайского подвида имеют генотип rhaS: 482-G, 494-Т, 671-G; araC: 773-G; metB: 988-G, 989-Т; aspA: 1087-1089 - GTG; thiH: 552-A,

гиссарского подвида имеют генотип rhaS: 482-А. 494-Т, 671-G; araC: 773-G; metB: 988-G, 989-G; aspA: 1087-1089 - GTG; thiH: 552-A,

улегейского подвида имеют генотип rhaS: 482-G. 494-Т, 671-G; araC: 773-T; metB: 988-G, 989-Т; aspA: 1087-1089 -TCG; thiH: 552-A.

Аллели генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH у штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов определяют проведением сравнительного анализа нуклеотидов, находящихся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, 773 гена araC, 988 и 989 гена metB, 1087-1089 гена aspA и 552 гена thiH.

Из 4 аллелей гена rhaS

первая rhS1 (482-G, 494-Т, 671-А) - у штаммов основного подвида,

вторая rhS2 (482-G, 494-С, 671-G) - у штаммов кавказского подвида,

третья rhS3 (482-G, 494-Т, 671-G) - у штаммов алтайского и улегейского подвидов,

четвертая rhS4 (482-А 494-Т, 671-G) - у штаммов гиссарского подвида.

Из 2 аллелей гена araC

первая arC1 (773-T) - у штаммов основного, кавказского и улегейского подвидов,

вторая arC2 (773-G) - у штаммов алтайского и гиссарского подвидов.

Из 3 аллелей гена metB

первая mtB1 (988-T, 989-A) - у штаммов основного подвида,

вторая mtB2 (988-G, 989-T) - у штаммов кавказского, алтайского и улегейского подвидов,

третья mtB3 (988-G, 989-G) - у штаммов гиссарского подвида.

Из 3 аллелей гена aspA

первая арА1 (1087-1089 - TTG) - у штаммов основного подвида,

вторая арА2 (1087-1089 - TCG) - у штаммов кавказского и улегейского подвидов,

третья арА3 (1087-1089 - GTG) - у штаммов алтайского и гиссарского подвидов.

Из 2 аллелей гена thiH

первая tH1 (552-А) - у штаммов основного, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов,

вторая tH2 (552-Т) - у штаммов кавказского подвида.

Сиквенс-тип присваивают каждому подвиду с определенным сочетанием аллелей генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH.

штаммы основного подвида имеют 1 ST - rhS1 arC1 mtB1 арА1 tH1;

штаммы кавказского подвида 2 ST - rhS2 arC1 mtB2 арА2 tH2;

штаммы алтайского подвида 3 ST - rhS3 arC2 mtB2 арА3 tH1;

штаммы гиссарского подвида 4 ST - rhS4 arC2 mtB3 арА3 tH1;

штаммы улегейского подвида 5 ST - rhS3 arC1 mtB2 арА2 tH1.

Результаты сравнения нуклеотидных последовательностей фрагментов генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH у штаммов различных подвидов Y.pestis представлены в таблице 1. Интерпретацию полученных результатов осуществляют в соответствии с таблицей 2.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Подвидовая дифференциация штамма Y.pestis A-161 (Модельный эксперимент).

Выделение ДНК штамма Y.pestis (№ 1) проводят стандартным методом с помощью лизирующего раствора на основе 6М гуанидинизотиоцианата с предварительным обеззараживанием культуры путем добавления мертиолята натрия до концентрации 1:10000 с последующим прогреванием при температуре 56°С в течение 30 мин (Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности (МУ 1.3.1794-03)).

Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме 25 мкл; реакционная смесь содержит: 1×буфер (10×ПЦР-буфер - 2,5 мкл), MgCl₂ - 2,0 мМ, смесь dNTP - 0,3 мМ, олигонуклеотидные праймеры - 2 пмол, Taq DNA полимераза - 0,1 ед., исследуемой ДНК - 10 мкл. Продукты амплификации анализируют в 1-2% агарозном геле с добавлением этидиум бромида и просматриваются в УФ свете.

Нуклеотидные последовательности образованных в ПЦР фрагментов генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH определяют на автоматическом секвенаторе по методу F.Sanger et al. (1977) с использованием прямых и обратных праймеров. В определенных нуклеотидных последовательностях генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH устанавливают нуклеотиды, находящиеся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, 773 гена araC, 988 и 989 гена metB, 1087-1089 гена aspA, 552 гена thiH и определяют генотип штамма. Штамм Y.pestis (№1) имеет генотип rhaS: 482-G, 494-Т, 671-А; araC: 773-Т; metB: 988-Т, 989-А; aspA: 1087-1089 - TTG; thiH: 552-A. По данным таблицы 2 устанавливают, что такому генотипу штамма соответствует ST 1: rhS1 arC1 mtB1 apA1 tH1, характерный для штаммов основного подвида чумного микроба, из чего делают вывод о принадлежности штамма Y.pestis (№ 1) к основному подвиду Y.pestis.

Пример 2. Дифференциацию штамма Y.pestis (№ 2) проводят аналогично примеру 1. В полученных нуклеотидных последовательностях генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH устанавливают нуклеотиды, находящиеся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, 773 гена araC, 988 и 989 гена metB, 1087-1089 гена aspA, 552 гена thiH и определяют генотип штамма. Штамм Y.pestis (№ 2) имеет генотип rhaS: 482-G, 494-С, 671-G; araC: 773-Т; metB: 988-G, 989-Т; aspA: 1087-1089 - TCG; thiH: 552-T. По данным таблицы 2 устанавливают, что такому генотипу штамма соответствует ST 2: rhS2 arC1 mtB2 apA2 tH2, характерный для штаммов кавказского подвида чумного микроба. Делают вывод о принадлежности штамма Y.pestis (№ 2) к кавказскому подвиду возбудителя чумы. Штаммы этого подвида характеризуются избирательной вирулентностью и низким эпидемическим потенциалом.

Пример 3. Дифференциацию штамма Y.pestis (№3) проводят аналогично примеру 1. В полученных нуклеотидных последовательностях генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH устанавливают нуклеотиды, находящиеся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, 773 гена araC, 988 и 989 гена metB, 1087-1089 гена aspA, 552 гена thiH и определяют генотип штамма. Штамм Y.pestis (№ 3) имеет генотип rhaS: 482-G, 494-Т, 671-G; araC: 773-G; metB: 988-G, 989-Т; aspA: 1087-1089 - GTG; thiH: 552-A. По данным таблицы 2 устанавливают, что такому генотипу штамма соответствует ST 3: rhS3 arC2 mtB2 арА3 tH1, характерный для штаммов алтайского подвида чумного микроба. Из чего делают вывод о принадлежности штамма Y.pestis (№ 3) к алтайскому подвиду возбудителя чумы. Штаммы этого подвида характеризуются избирательной вирулентностью и низким эпидемическим потенциалом.

Пример 4. Дифференциацию штамма Y.pestis (№ 4) проводят аналогично примеру 1. В полученных нуклеотидных последовательностях генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH устанавливают нуклеотиды, находящиеся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, 773 гена araC, 988 и 989 гена metB, 1087-1089 гена aspA, 552 гена thiH и определяют генотип штамма. Штамм Y.pestis (№ 4) имеет генотип rhaS: 482-A, 494-T, 671-G; araC: 773-G; metB: 988-G, 989-G; aspA: 1087-1089 - GTG; thiH: 552-A. По данным таблицы 2 устанавливают, что такому генотипу штамма соответствует ST 4: rhS4 arC2 mtB3 арА3 tH1, характерный для штаммов гиссарского подвида чумного микроба. Из чего делают вывод о принадлежности штамма Y.pestis (№ 4) к гиссарскому подвиду возбудителя чумы. Штаммы этого подвида характеризуются избирательной вирулентностью и низким эпидемическим потенциалом.

Пример 5. Дифференциацию штамма Y.pestis (№ 5) проводят аналогично примеру 1. В полученных нуклеотидных последовательностях генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH устанавливают нуклеотиды, находящиеся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, 773 гена araC, 988 и 989 гена metB, 1087-1089 гена aspA, 552 гена thiH и определяют генотип штамма. Штамм Y.pestis (№ 5) имеет генотип rhaS: 482-G, 494-T, 671-G; araC: 773-Т; metB: 988-G, 989-Т; aspA: 1087-1089 - TCG; thiH: 552-A. По данным таблицы 2 устанавливают, что такому генотипу штамма соответствует ST 5: rhS3 arC1 mtB2 apA2 tH1, характерный для штаммов улегейского подвида чумного микроба. Из чего делают вывод о принадлежности штамма Y.pestis (№ 5) к улегейскому подвиду возбудителя чумы. Штаммы этого подвида характеризуются избирательной вирулентностью и низким эпидемическим потенциалом.

Таким образом, заявленный способ мультилокусного сиквенс-типирования штаммов чумного микроба, основанный на определении нуклеотидной последовательности фрагментов генов жизнеобеспечения rhaS, araC, metB, aspA и thiH, позволяет быстро, эффективно и надежно проводить дифференциацию подвидов Y.pestis.

Дифференциацию штаммов Yersinia pestis проводят методом сиквенс-типирования. Метод предусматривает выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) с амплификацией фрагментов генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH с последующим определением их нуклеотидных последовательностей. Генотип исследуемого штамма устанавливают по нуклеотидам, находящимся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, в позиции 773 гена araC, в 988 и 989 гена metB, в 1087-1089 гена aspA и 552 гена thiH. По аллелям генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH определяют сиквенс-тип (ST) штамма Y. pestis с его последующей подвидовой дифференциацией путем сравнения с сиквенс-типами основного и неосновных подвидов. Сиквенс-тип (ST) устанавливают для каждого подвида. Использование способа по изобретению позволяет быстро, надежно и эффективно проводить дифференциацию подвидов Yersinia pestis. 2 табл.

Способ подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis методом мультилокусного сиквенс-типирования, включающий выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции с амплификацией фрагментов генов, анализ результатов, отличающийся тем, что при проведении ПЦР используют олигонуклеотидные праймеры на гены rhaS, araC, metB, aspA и thiH, имеющие следующие последовательности:
RhaS s - CAA ATA AAG TGC TTG ATT GCT TGT CTG
RhaS as - GCT ATT GTC GCT GTA ACA CAG TTG ATG
AraC s - GAT TGT TGG TAT CAC CGC T
AraC as - ACT GGC ATA ACC GTA GCC,
MetB s - ACT CTG ATG TGG TGG CTG
MetB as - CGG AAA TAC GCA ACA AAC
AspA s - GAA GCG ACC TCT GAT TGC
AspA as - AAG TGA CGA TGC CTA TGG
ThiH s - GCA TCA AAC GCA AGA CAT
ThiH as - CCA ATC AAG GCA CCT AAT
в полученной нуклеотидной последовательности фрагментов генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH по нуклеотидам, находящимся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, в позиции 773 гена araC, в 988 и 989 гена metB, в 1087-1089 гена aspA и 552 гена thiH, определяют генотип штамма, по аллелям генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH устанавливают сиквенс-тип (ST) штамма Y.pestis с последующей дифференциацией штаммов путем сравнения установленного сиквенс-типа с сиквенс-типами основного и неосновных подвидов, при этом основной подвид имеет сиквенс-тип 1 ST - rhS1 arC1 mtB1 apA1 tH1; кавказский - 2ST - rhS2 arC1 mtB2 apA2 tH2; алтайский - 3 ST - rhS3 arC2 mtB2 арА3 tH1; гассарский - 4 ST - rhS4 arC2 mtB3 арА3 tH1; улегейский - 5 ST - rhS3 arC1 mtB2 apA2 tH1.