СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОВАРИАНТОВ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ МЕТОДОМ МУЛЬТИЛОКУСНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ Российский патент 2015 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности, к внутривидовой дифференциации и молекулярному типированию штаммов возбудителя чумы, и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях медицинского профиля и службах Роспотребнадзора.

Бактерия Yersinia pestis является возбудителем чумы - особо опасной инфекционной природно-очаговой болезни, которая и в настоящее время представляет значительную угрозу для населения многих стран. Природные очаги чумы широко распространены на территориях многих континентов и государств, в том числе в Российской Федерации и других странах СНГ. На территории России противочумными учреждениями Роспотребнадзора осуществляется постоянный мониторинг природных очагов чумы, которые проводят профилактические меры по снижению их эпизоотической активности. В то же время во многих странах ближнего и дальнего зарубежья такая работа на должном уровне не ведется, что может привести к заносу в нашу страну этой особо опасной инфекции. Ввиду этого службы здравоохранения должны располагать современными высокоэффективными средствами быстрой индикации и идентификации возбудителя чумы, обеспечивающими определение эпидемической опасности штамма Y.pestis, установление его происхождения и выявление путей заноса инфекции.

В практике противочумных учреждений Российской Федерации и других стран СНГ используется внутривидовая классификация возбудителя чумы, принятая на совещании противочумных учреждений в 1985 г., которая делит штаммы Y.pestis на пять подвидов - основной и четыре неосновных - кавказский, гиссарский, алтайский и улегейский. В основной подвид входят высоковирулентные штаммы, которые могут вызывать эпидемии чумы. К неосновным подвидам относятся штаммы с избирательной вирулентностью, которые могут послужить причиной отдельных случаев болезни, но которые не обладают высоким эпидемическим потенциалом. Штаммы Y.pestis неосновных подвидов циркулируют в основном в очагах России, других стран СНГ, Грузии, Монголии, хотя известно о штаммах «microtus» из Китая с характеристиками неосновного подвида и единственном штамме неосновного подвида Angola из Африки. Кроме того, существует группа штаммов с характеристиками неосновного подвида из Таласского высокогорного очага чумы в Киргизии, систематическое положение которой остается в настоящее время неясным.

По широко используемой зарубежной классификации штаммы основного подвида делят на три биовара - античный, средневековый и восточный. Штаммы неосновных подвидов зарубежные авторы часто объединяют под общим названием пестоиды (pestoides).

Внедрение в практику исследований высокотехнологичной методики полногеномного секвенирования показало, что возбудитель чумы обладает значительно большим генетическим разнообразием, чем это было принято считать ранее. Секвенирование большого числа полных геномов штаммов Y.pestis разного происхождения позволило установить, что в пределах подвидов и биоваров чумного микроба существуют отдельные популяции, которые имеют фенотипические и генетические отличия и которые получили обозначение геновариантов возбудителя чумы [G. Morelli, Y. Song, С.J. Mazzoni et al. Phylo-genetic diversity and historical patterns of pandemic spread of Yersinia pestis II Nat Genet. - 2010. - V. 42 (12). - P. 1140-1143; Y. Cui, C. Yu, Y. Yan et al. Historical variations in mutation rate in an epidemic pathogen, Yersinia pesti sil PNAS. - 2013.- V. 110 (2). - P. 577-582; Г.Н. Одиноков, Г.А. Ерошенко, Я.М. Краснов и др. Анализ полногеномной последовательности штаммов Yersinia pestis на основе ступенчатого 680-SNP алгоритма // Проблемы особо опасных инф. - 2013. - №3. - С. 49-54].

Так, среди штаммов неосновных подвидов или пестоидов выделяют геноварианты 0.РЕ2а, 0.PE2b и 0.РЕ2 с кавказского подвида, 0.PE3 штамма Angola, группу 0.РЕ4 среди которой мы выделили геноварианты 0.РЕ4а - алтайский подвид, 0.PE4h - гиссарский подвид, 0.PE4t - таласские штаммы и 0.РЕ4 - штаммы microtus. Геноварианты штаммов улегейского подвида в литературе не представлены, и поэтому мы обозначили их как 0.РЕ5.

У античного биовара известны геноварианты 0.ANT1, 0.ANT2, 0.ANT3, 4.ANT, 3.ANT1, 3.ANT2, 1.ANT, 2.ANT1, 2.ANT2, 2.ANT3, штаммы которых распространены в различных регионах Азии и Африки. У средневекового биовара, циркулирующего в большинстве очагов России, других стран СНГ и в очагах Центральной Азии выделяют геноварианты 2.MED0, 2 MED1, 2.MED2, 2MED3. Штаммы восточного биовара распространены в Северной и Южной Америках, в Юго-Восточной Азии, в Африке и включают три геноварианта 1.0RI1, 1.0RI2, 1.0RI3.

Таким образом, определение геноварианта штамма Y.pestis, вызвавшего вспышку или единичный случай чумы, важно для установления происхождения штамма (местный или завозной случай) и выявление вероятных путей заноса инфекции. Определение геновариантов штаммов, циркулирующих в различных природных очагах имеет и фундаментальное значение для реконструкции основных путей формирования современных границ ареала чумного микроба в период образования вида Y.pestis.

Все известные геноварианты возбудителя чумы выделены с помощью полногеномного секвенирования штаммов Y.pestis на основе анализа полиморфизма единичных нуклеотидов по всему геному этих штаммов. Однако секвенирование полного генома штамма бактерии является затратным методом и требует наличия дорогостоящего оборудования, реактивов, а также длительного времени на проведение этой процедуры. В то же время в результате анализа полиморфизма единичных нуклеотидов в секвенированных геномах штаммов Y.pestis был сделан вывод о том, что каждая мутация, вызвавшая замену единичного нуклеотида, произошла в истории эволюции возбудителя чумы лишь однажды, за исключением 28 из них, представляющих известные гомоплазии генома. Из этого следует, что каждая из этих точечных мутаций, возникших в отдельной популяции штаммов Y.pestis, является характерной генетической меткой (маркером) отдельного геноварианта. Ввиду этого очевидно, что дорогостоящая процедура определения геноварианта с помощью полногеномного секвенирования может быть на практике заменена гораздо более простым и экономичным способом определения геновариантов на основе выявления в их геноме генетической метки - замены единичного нуклеотида, маркерного для конкретного геноварианта. Таким образом, на основе мультилокусного секвенирования выбранных полиморфных участков генома с применением сконструированных на них праймеров можно быстро и надежно определить принадлежность исследуемого штамма Y.pestis к одному из геновариантов возбудителя чумы.

Ранее метод мультилокусного секвенирования применялся для определения видовой и внутривидовой принадлежности штаммов Y.pestis.

Известен способ дифференциации иерсиний методом мультилокусного сиквенс-типирования фрагментов генов жизнедеятельности glnA, gyrB, recA, F-HSP60, полученных в полимеразной цепной реакции [Kotetishvili M., Kreger Α., Wauters G. et al. Multilocus sequence typing for studying genetic relationships among Yersinia species // J. Clin. Microbiol. - 2005. - V. 43, N6 - Р. 2674-2684]. Использование этих генов позволяет проводить дифференциацию Y.pestis и других видов рода Yersinia, но не позволяет проводить внутривидовую дифференциацию возбудителя чумы и определять подвидовую принадлежность штамма Y.pestis.

Известен способ определения подвидовой принадлежности штаммов Y.pestis на основе секвенирования вариабельных последовательностей генов rhaS и araC [Патент №RU 2404256, опубликован 20.11.2010]. Способ обеспечивает определение подвидовой принадлежности штаммов возбудителя чумы, но он не может быть использован для определения геновариантов штаммов Y.pestis.

Известен способ подвидовой дифференциации штаммов Y.pestis методом мультилокусного сиквенс-типирования [Патент RU №2415948, опубликован 10.04.2011]. Способ основан на использовании вариабельности генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH и позволяет быстро и надежно устанавливать подвидовую принадлежность штамма Y.pestis, но этот способ не предназначен для определения геновариантов возбудителя чумы.

Известен способ подвидовой и биоварной дифференциации штаммов Y.pestis методом ПЦР и мультилокусного сиквенс-типирования [Патент RU №2471872, опубликован 10.01.2013]. С помощью этого способа можно определить подвидовую и биоварную принадлежность исследуемого штамма Y.pestis. В то же время он не позволяет устанавливать принадлежность этого штамма к одному из геновариантов возбудителя чумы.

Определение геновариантов возбудителя чумы проводят на основе анализа полиморфизма единичных нуклеотидов в полногеномной последовательности штаммов Y.pestis [G. Morelli, Y. Song, С.J. Mazzoni et al., 2010; Y. Cui, C, Yu, Y. Yan et al., 2013]. Однако этот способ дорогостоящ и требует анализа большого числа генетических локусов, содержащих единичные полиморфные нуклеотиды, что значительно удлиняет время проведения анализа.

В научной и специальной литературе отсутствуют публикации об использовании метода мультилокусного секвенирования для определения геновариантов штаммов Y.pestis. Все вышеизложенное требует разработки простого и надежного способа определения геновариантов штаммов возбудителя чумы.

Технической задачей изобретения является разработка быстрого, эффективного и экономичного способа определения геновариантов штаммов Y.pestis с помощью мультилокусного секвенирования.

Технический результат заключается в обеспечении быстрого, простого и надежного способа определения геновариантов штаммов возбудителя чумы с помощью мультилокусного секвенирования. Вместо сложного, трудоемкого и дорогостоящего анализа полного генома исследуемого штамма Y.pestis по множеству локусов полиморфных единичных нуклеотидов для установления геноварианта изучаемого штамма достаточно провести у него секвенирование небольшого числа участков генома для выявления в их последовательности единичных замен нуклеотидов, маркерных для отдельных геновариантов возбудителя чумы.

Технический результат достигается способом определения геновариантов штаммов Y.pestis на основе мультилокусного секвенирования, который предусматривает амплификацию ДНК мишеней у исследуемого штамма с помощью сконструированных праймеров SEQ ID NO: 1-26, секвенирование амплифицированных фрагментов, выявление в них замен единичных нуклеотидов, маркерных для отдельных геновариантов, и определение этих геновариантов в соответствии с таблицей.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделение ДНК исследуемого штамма чумного микроба проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

В качестве ДНК мишеней используются следующие участки генома: YPO0785, YPO0027, YP03637, YPO0126, YPO2232, YPO1548, YPO0057, YPO0310, YPO1120, YPO1404, YPO1437, YPO1758, YPO1418, YPO2499, YPO1708, YPO0154, YPO1394, YPO0956, YPO3506, YPO2744, YPO1299, YPO0652, YPO0436, YPO1537, YPO0032 и YPO1565. Номера участкам присвоены по последовательности референтного штамма Y.pestis CO92. Праймеры на выбранные ДНК мишени рассчитаны на основе нуклеотидных последовательностей этих участков генома у штаммов Y.pestis, представленных в базе данных NCBI GenBank, а также на основе нуклеотидных последовательностей полных геномов штаммов возбудителя чумы, полученных нами. Используемые ДНК мишени и сконструированные на них праймеры представлены в таблице. У полученных в ПЦР с помощью рассчитанных праймеров фрагментов определяют нуклеотидную последовательность и устанавливают наличие единичных нуклеотидов, маркерных для отдельных геновариантов штаммов возбудителя чумы. Определение геновариантов проводят в соответствии с таблицей.

Установление принадлежности штамма Y.pestis к одному из геновариантов неосновных подвидов или пестоидов: кавказский подвид - 0.РЕ2а, 0.PE2b, 0.РЕ2с; Angola - 0.PE3; microtus - 0.PE4m; алтайский подвид - 0.РЕ4а; гиссарский подвид - 0.PE4h; таласские штаммы - 0.PE4t осуществляют по единичным полиморфным нуклеотидам в используемых локусах в соответствии с таблицей. У геноварианта 0.РЕ2а в локусе YPO0785 присутствует нуклеотид А, у 0.PE2b в локусе YPO0027 - А, у 0.РЕ2с в локусе YPO3637 - Т, у 0.РЕ3 в локусе YPO0126 - Т, у 0.PE4m в локусе YPO2232 - А, у 0.РЕ4а в локусе YPO1548 - А, у 0.PE4h в локусе YPO0057 - G, у 0.PE4t в локусе YPO0310 присутствует нуклеотид Т, у 0.РЕ5 в локусе YPO1120 - Т. В случае обнаружения у исследуемого штамма Y.pestis одного из вышеперечисленных нуклеотидов в используемом локусе этот штамм следует отнести к тому геноварианту неосновных подвидов, маркером которого является этот нуклеотид.

Определение принадлежности штаммов Y.pestis к геновариантам античного биовара 0.ANT1, 0.ANT2, 0.ANT3, 4.ANT, 3.ANT1, 3.ANT2, 1.ANT, 2.ANT1, 2.ANT2, 2.ANT3, осуществляют по единичным полиморфным нуклеотидам в используемых локусах в соответствии с таблицей. У геноварианта 0.ANT1 в локусе YPO1404 присутствует нуклеотид Т, у 0.ANT2 в локусе YPO1437 - Т, у 0.ANT3 в локусе YPO1758 - Т, у 4.ANT в локусе YPO1418 - А, у 3.ANT1 в локусе YPO2499 - А, у 3.ANT2 в локусе YPO1708 - А, у 1.ANT в локусе YPO0154 - G, у 2.ANT3 в локусе YPO3506 - Т. В случае обнаружения у исследуемого штамма Y.pestis одного из вышеперечисленных нуклеотидов в используемом локусе, этот штамм следует отнести к тому геноварианту античного биовара, маркером которого является этот нуклеотид.

Принадлежность к геновариантам 2.ANT1 и 2.ANT2 определяют по единичным полиморфным нуклеотидам в двух локусах - YPO1394 и YPO0956. У геноварианта 2.ANT1 в локусе YPO1394 присутствует нуклеотид Т, а в локусе YPO0956 - А. У геноварианта 2.ANT2 в локусе YPO1394 присутствует нуклеотид G, а локусе YPO0956 - А. В случае обнаружения у исследуемого штамма Y.pestis одного из сочетаний вышеперечисленных нуклеотидных замен в локусах YPO1394 и YPO0956 этот штамм следует отнести либо к геноварианту 2.ANT1, либо 2.ANT2.

Определение принадлежности исследуемого штамма Y.pestis к одному из геновариантов средневекового биовара 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3, 2.MED0 осуществляют по единичным полиморфным нуклеотидам в используемых локусах в соответствии с таблицей. У геноварианта 2.MED1 в локусе YPO2744 присутствует нуклеотид Т, у 2.MED2 в локусе YPO1299 - А, у 2.MED3 в локусе YPO0652 - Т, у 2.MED0 в локусе YPO0436 - G. В случае обнаружения у исследуемого штамма Y.pestis одного из вышеперечисленных нуклеотидов в используемом локусе этот штамм следует отнести к тому геноварианту средневекового биовара, маркером которого является этот нуклеотид.

Принадлежность исследуемого штамма Y.pestis к одному из геновариантов восточного биовара 1.ORI1, 1.ORI2, 1 ORI3 определяют по единичным полиморфным нуклеотидам в трех локусах - YPO1537, YPO0032 и YPO1565 в соответствии с таблицей: У геноварианта 1.ORI1 в локусе YPO1537 присутствует нуклеотид Т, в локусе YPO0032 - С, в локусе YPO01565 - С. У геноварианта 1.ORI2 в локусе YPO1537 присутствует нуклеотид Т, в локусе YPO0032 - Т, в локусе YPO01565 - С. У геноварианта 1.ORI3 в локусе YPO1537 присутствует нуклеотид Т, в локусе YPO0032 - С, в локусе YPO01565 - А. В случае обнаружения у исследуемого штамма Y.pestis одного из сочетаний вышеперечисленных нуклеотидных замен в локусах YPO1537, YPO0032 и YPO1565 этот штамм следует отнести к тому геноварианту восточного биовара, маркерами которого являются эти замены.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Определение геноварианта штамма Y.pestis неосновного подвида.

У исследуемого штамма с помощью праймеров SEQ ID NO: 1-9 проводят в ПЦР амплификацию ДНК мишеней YPO0785, YPO0027, YPO3637, YPO0126, YPO2232, YPO1548, YPO0057, YPO0310, YPO1120, а затем осуществляют секвенирование амплифицированных фрагментов. У исследуемого штамма в фрагменте YPO1120 в позиции 142 от начала фрагмента присутствует нуклеотид Т, маркерный для геноварианта 0.РЕ5. Исследуемый штамм Y.pestis относится к геноварианту 0.РЕ5 неосновного (улегейского) подвида.

Пример 2. Определение геноварианта штамма Y.pestis основного подвида античного биовара.

У исследуемого штамма с помощью праймеров SEQ ID NO: 10-19 проводят в ПЦР амплификацию ДНК мишеней YPO1404, YPO1437, YPO1758, YPO1418, YPO2499, YPO1708, YPO0154, YPO1394, YPO0956, YPO3506, а затем осуществляют секвенирование амплифицированных фрагментов. У исследуемого штамма в фрагменте YP02499 в позиции 129 от начала фрагмента присутствует нуклеотид А, маркерный для геноварианта 3.ANT1. Исследуемый штамм относится к геноварианту 3.ANT1 основного подвида античного биовара.

Пример 3. Определение геноварианта штамма Y.pestis основного подвида средневекового биовара.

У исследуемого штамма Y.pestis с помощью праймеров SEQ ID NO: 20-23 проводят в ПЦР амплификацию ДНК мишеней YPO2744, YPO1299, YPO0652 и YPO0436, а затем осуществляют секвенирование амплифицированных фрагментов. У исследуемого штамма в фрагменте YP02744 в позиции 89 от начала фрагмента присутствует нуклеотид Т, маркерный для геноварианта 2.MED1. Исследуемый штамм Y.pestis относится к геноварианту 2.MED1 основного подвида средневекового биовара.

Пример 4. Определение геноварианта штамма Y.pestis основного подвида восточного биовара.

У исследуемого штамма Y.pestis с помощью праймеров SEQ ID NO: 24-26 проводят в ПЦР амплификацию ДНК мишеней YPO1537, YPO0032 и YPO1565, а затем осуществляют секвенирование амплифицированных фрагментов. У исследуемого штамма в фрагменте YPO1537 в позиции 76 присутствует нуклеотид Т, в YPO0032 в позиции 180 - С, в YPO01565 в позиции 216 - С, маркерные для геноварианта 1.ORI1. Исследуемый штамм Y.pestis относится относится к геноварианту 1.ORI1 основного подвида восточного биовара.

Таким образом, заявленный способ определения геновариантов штаммов Y.pestis с помощью мультилокусного секвенирования, основанный на выявлении маркерных единичных нуклеотидов в ряде участков генома возбудителя чумы, обеспечивает проведение быстрой и надежной идентификации этих геновариантов.

Разработанный метод является простым, высокоразрешающим и универсальным методом генодиагностического анализа штаммов Y.pestis, который найдет широкое применение при молекулярной экспертизе вспышек чумы, при эпидемиологическом мониторинге природных очагов чумы и в фундаментальных исследованиях, связанных с изучением внутривидовой эволюции возбудителя чумы.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения геновариантов штаммов возбудителя чумы методом мультилокусного секвенирования. Заявленный способ предусматривает выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, амплификацию ДНК мишеней в полимеразной цепной реакции с использованием сконструированных праймеров, секвенирование амплифицированных фрагментов. Геновариант исследуемого штамма возбудителя чумы определяют по вариабельным нуклеотидам, маркерным для отдельных геновариантов. Способ позволяет эффективно и надежно определять геноварианты штаммов Y.pestis. 1 табл., 4 пр.

Способ определения геновариантов 0.PE2а, 0.PE2b, 0.PE2с, 0.PE3, 0.PE4m, 0.PE4а, 0.PE4h, 0.PE4t, 0.PE5, 0.ANT1, 0.ANT2, 0.ANT3, 4.ANT, 3.ANT1, 3.ANT2, 1.ANT, 2.ANT1, 2.ANT2, 2.ANT3, 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3, 2.MED0, 1.ORI1, 1.ORI2, 1.ORI3 штаммов возбудителя чумы методом мультилокусного секвенирования, включающий выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, амплификацию ДНК мишеней в полимеразной цепной реакции с использованием сконструированных праймеров SEQ ID NO: 1-26, секвенирование амплифицированных фрагментов, выявление в них замен единичных нуклеотидов, маркерных для отдельных геновариантов, и определение геновариантов в соответствии с таблицей.