СПОСОБ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ ПО ИХ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ К ВИДУ YERSINIA PESTIS, К ПОДВИДАМ, БИОВАРАМ, ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИМ ВЕТВЯМ И ПО НАЛИЧИЮ ГЕНОВ ОСНОВНЫХ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ МЕТОДОМ ДНК-ЧИПА Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к молекулярному типированию и внутривидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis, и может быть использовано в научно-исследовательских и практических учреждениях Роспотребнадзора и Минздрава России.

Y. pestis является возбудителем особо опасной инфекционной болезни - чумы, которая способна вызывать чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения, особенно при вспышке легочной чумы, имеющей тенденцию к международному распространению [Международные медико-санитарные правила, WHO, 2005].

По данным комплексного анализа свойств и полногеномного секвенирования создана современная классификация штаммов Y. pestis, которые делятся на семь подвидов: основной, ssp.pestis (биовары античный, средневековый и восточный); тибетский, ssp.tibetica; кавказский, ssp.caucasica; ангольский, ssp.angolica; центральноазиатский, ssp.central asiatica; улегейский, ssp.ulegeica; цинхайский, ssp.qinghaica.

Особенностями штаммов основного подвида являются высокая вирулентность и эпидемическая значимость. Они получили распространение в природных очагах чумы по всему миру. Основной подвид делится на три биовара - античный, средневековый и восточный. Античный биовар, в свою очередь, включает несколько филогенетических ветвей: 0.ANT, 1.ANT, 2.ANT и другие. Ветвь 1.ANT в процессе эволюции дала начало восточному биовару (1.ORI), а ветвь 2.ANT - средневековому биовару (2.MED). Внутри средневекового биовара выделяется наиболее древняя ветвь - 2.MED0, штаммы которой циркулируют на территории Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы, а также более поздняя - 2.MED1, штаммы которой доминируют в природных очагах России и других стран СНГ.

Штаммы неосновных подвидов характеризуются избирательной вирулентностью, низкой эпидемической значимостью и распространены в отдельных географических регионах: кавказского подвида - на Кавказе; центральноазиатского подвида - в Горно-Алтайском (Россия, Монголия), Гиссарском (Таджикистан), Таласском (Р. Кыргызстан) высокогорных очагах, в двух очагах чумы в Китае; улегейского - в Монголии. В центральноазиатский подвид включены четыре биовара - алтайский, гиссарский, таласский, microtus. В очагах Российской Федерации, других стран СНГ и сопредельных государств распространены штаммы основного, кавказского, центральноазиатского и улегейского подвидов.

Вирулентность возбудителя чумы является полидетерминантной и определяется наличием факторов патогенности, кодируемых хромосомой и плазмидами Y. pestis. В геноме присутствует хромосомная область пигментации, включающая остров высокой патогенности HPI с генами сидерофорзависимой системы потребления железа (в том числе ген irp2). Остров высокой патогенности HPI (от англ. High Pathogenicity Island) -обязательный фактор вирулентности, при утрате которого штаммы Y. pestis становятся авирулентными.

Геном Y. pestis несет в своем составе также три резидентные плазмиды - pCad, pFra, pPst. Последние две плазмиды являются видоспецифическими. Плазмида pCad кодирует систему секреции третьего типа - второй обязательный фактор вирулентности возбудителя чумы. Плазмида pCad включает ген lcrV, продукт которого, белок lcrV является одним из основных компонентов этой системы. Другая плазмида pFra содержит ген cafl, кодирующий фактор патогенности и иммуногенности - капсульный белок фракции F1. Еще одна плазмида pPst несет в своем составе ген pla, кодирующий протеазу pPla - активатор плазминогена, продукция которой необходима для проявления бубонной и легочной форм болезни. У штаммов Y. pestis кавказского подвида плазмида pPst отсутствует. Штаммы Y. pestis при неблагоприятных условиях могут спонтанно утрачивать хромосомную область пигментации с островом высокой патогенности и плазмиды, что приводит к их авирулентности.

Таким образом, выделяемые из природы и от больных штаммы возбудителя чумы могут отличаться по вирулентности, внутривидовой принадлежности и географическому региону происхождения. В связи с чрезвычайной опасностью чумы для отечественного и мирового здравоохранения, способностью возбудителя вызывать вспышки, эпидемии и даже пандемии чумы с высоким процентом летальности среди заболевших, а также ввиду внутривидового разнообразия штаммов Y. pestis, отличающихся по вирулентности и географическим регионам распространения, важной задачей является получение максимально полных данных о штаммах возбудителя и их свойствах за минимально короткое время с определением происхождения, путей завоза, вирулентности и внутривидовой таксономии. Все это требует совершенствования лабораторной диагностики чумы с применением современных высокоразрешающих молекулярно-генетических технологий. Актуальной является разработка способа быстрой и эффективной индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы по их принадлежности к виду Y. pestis, подвидам, биоварам, филогенетическим линиям, а также по вирулентности.

Наряду с традиционными и затратными по времени методами лабораторной диагностики возбудителей опасных инфекций широко применяются методы молекулярной диагностики, такие как полимеразная цепная реакции с электрофоретическим и гибриди-зационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени, варианты ПЦР в мультиплексном формате, ДНК биочипы. Наибольшей эффективностью, чувствительностью и быстротой выполнения среди методов ПЦР обладает мультиплексная ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени -мультиплексная ПЦР-РВ.

Однако возможности мультиплексной ПЦР ограничены количеством детектируемых признаков, не превышающих, как правило, 4-6. Увеличение количества используемых ДНК мишеней приводит к образованию неспецифических ПЦР-продуктов и получению ложноположительных результатов. Применение ДНК биочипов позволяет конструировать мультиплексные тест-системы на большее количество маркеров (от нескольких десятков до нескольких сотен и тысяч) за счет иммобилизации зондов на твердой подложке, возможности одновременного проведения анализа и получения результата по многим маркерам. Преимуществом ДНК биочипов по сравнению с мультиплексной ПЦР-РВ является также отсутствие зависимости от количества каналов в приборе, используемых для детекции сигнала гибридизации. В связи с этим очевидны преимущества применения биологических ДНК биочипов для индикации и идентификации штаммов Y. pestis, а также и других возбудителей инфекционных болезней. Разработки по биологическим микрочипам проводятся многими компаниями в странах Европы, США, Азии. В РФ созданные тест-системы для диагностики особо опасных инфекций на основе биочипов носят экспериментальный характер. Использование ДНК биочипов позволит повысить эффективность проводимого молекулярно-эпидемического мониторинга природных очагов чумы, устанавливать происхождение, вирулентность и эпидемическую значимость выделенных штаммов Y. pestis.

К настоящему времени разработано несколько способов индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы, однако, все они выполнены на основе методов ПЦР и секвенирования. Известен ряд методов с использованием метода ПЦР с электрофоретическим учетом результатов. В патенте RU №2422535 (опубликован 27.06.2011, Бюл. №18) описан способ идентификации штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis. Метод основан на одновременном использовании реакции непрямой иммунофлуоресценции (НИМФ) и полимеразной цепной реакции. Метод НИМФ позволяет детектировать штаммы Y. pestis и штаммы Y. pseudotuberculosis в R-форме. Метод ПЦР использует две пары праймеров, рассчитанных на области, специфические для Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, соответственно. Однако это изобретение основано на более затратном по времени методе ПЦР и более дорогом методе НИМФ, а также не позволяет проводить внутривидовую дифференциацию штаммов возбудителя чумы по их принадлежности к подвидам и биоварам Y. pestis.

В патенте RU №2415948 (опубликован 10.04.2011, бюл. №10) описан способ подвидовой дифференциации штаммов Y. pestis методом мультилокусного сиквенс-типирования. Но данный метод требует наличия дорогостоящего оборудования и реактивов для проведения фрагментного секвенирования полученных ПЦР-фрагментов вариабельных у разных подвидов Y. pestis участков генов жизнеобеспечения, а также значительных временных затрат.

Зарегистрирована тест-система «ГенПест» (регистрационный номер ФСР 2007/00096 по ТУ 8895-005-01898109-2007), предназначенная для экспресс-диагностики Y. pestis методом ПЦР с использованием двух пар праймеров на участки генов cafl (плазмида pFra) и pla (плазмида pPst). Однако эта тест-система предназначена для детекции вида Y. pestis и не может быть использована для проведения его внутривидовой дифференциации.

Известен способ экспресс-диагностики бактерий рода Yersinia, основанный на методе мультиплексной ПЦР с последующим анализом длин амплифицированных фрагментов гена порина - OmpF (патент RU №2385941, опубликован 10.04.2010, бюл. №10). Метод позволяет одновременно осуществлять детекцию и дифференциальную диагностику патогенных и непатогенных видов иерсиний, а также видовую идентификацию патогенных для человека видов: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Однако этот способ не предназначен для проведения внутривидовой дифференциации штаммов Y. pestis.

Известен способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции (патент RU №2425891, опубликован 10.08.2011, бюл. №22). Согласно этому способу, дифференциацию исследуемых штаммов проводят на основе сравнения размеров получаемых фрагментов генов terC, ilvN и inv с аналогичными фрагментами типичных штаммов возбудителей чумы основного и неосновных подвидов. Этот метод позволяет быстро, эффективно и надежно проводить дифференциацию штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов и Y. pseudotuberculosis, однако, он не обеспечивает разделения штаммов возбудителя чумы неосновных подвидов.

Известен способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба (патент RU №2332464, опубликован 27.08.2008, бюл. №24). Согласно этому способу дифференциацию исследуемых штаммов проводят по размеру ампликонов вариабельной хромосомной области hutG-YPO1967, полученных с помощью праймеров TAN1 и TAN2. Недостатком этого способа является то, что локус hutG-YPO1967 расположен в нестабильной области генома Y. pestis, которая может утрачиваться у штаммов основного подвида. Также этот способ сложен в интерпретации результатов и требует использования большого количества референтных штаммов.

Известен способ дифференциации биоваров и геновариантов штаммов Yersinia pestis основного подвида с помощью полимеразной цепной реакции (патент RU №2565554, опубликован 20.10.2015, бюл. №29). Этот способ предназначен для разделения биоваров основного подвида и отдельных популяций штаммов Y. pestis, но не для разделения штаммов разных подвидов возбудителя.

Разработан способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции (патент RU №2552611, опубликован 10.06.2015, бюл. №16), основанный на использовании метода ПЦР с электрофоретическим учетом результатов. Недостаток этого способа заключается в том, что он не позволяет проводить дифференциацию штаммов алтайского и гиссарского биоваров.

Известен «Набор и способ для ускоренной идентификации чумного микроба с одновременной дифференциацией вирулентных и авирулентных штаммов Y. pestis, определением их плазмидного профиля» (патент RU №2473701, опубликован 27.01.2013, бюл. №3). Недостатком этого способа является отсутствие возможности дифференциации подвидов и биоваров Y. pestis.

Метод ПЦР-РВ использовался недостаточно для проведения внутривидовой дифференциации штаммов Y. pestis. Известен способ проведения внутривидовой дифференциации типичных и атипичных штаммов Y. pestis средневекового биовара методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (Патент RU №2550257, опубликован 10.05.2015, бюл. №13). Способ предназначен для разделения штаммов основного подвида средневекового биовара, но он не позволяет разделять штаммы разных подвидов возбудителя чумы.

В патенте RU №2621869 (опубликован 07.06.2017, бюл. №16) представлен способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. Описанный способ позволяет проводить подвидовую дифференциацию штаммов Y. pestis, но не дает возможности разделять штаммы по их принадлежности к биоварам и филогенетическим линиям.

Тест-систем на основе биочипов для диагностики особо опасных инфекционных болезней, включая чуму, в РФ, а также за рубежом не зарегистрировано.

Технический результат изобретения заключается в обеспечении быстрой и надежной индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы по их принадлежности к виду Y. pestis, подвидам, биоварам, филогенетическим линиям возбудителя и по наличию генов основных факторов патогенности.

Технический результат достигается высокоэффективным и быстрым способом индикации и идентификации штаммов Y. pestis с определением принадлежности к виду, подвидам, биоварам, филогенетическим линиям и по наличию генов факторов патогенности методом ДНК чипа, который предусматривает для получения ДНК мишеней проведение 6 мультиплексных ПЦР:

1 - на ДНК мишени «pla», «3а», «cafl», «yihN;

2 - на ДНК мишени «irp2», «lcrV»;

3 - на ДНК мишени «glpD», «Pro», «Med24», «45»;

4 - на ДНК мишени «Med70», «Phage»;

5 - на ДНК мишени «A1t», «His», «U1»;

6 - на ДНК мишени «Caucas», «Tal», «Micr»;

с последующей дифференциацией штаммов по наличию и отсутствию сигналов флуоресценции после гибридизации с зондами, фиксированными на твердой подложке в соответствии с таблицами 1-6.

Используемые ДНК-мишени находятся в нижеуказанных областях хромосомы и плазмид Y. pestis (названия и координаты даны по геному штамма CO92, номера доступа в NCBI GenBank NC_003143.1 - хромосома, NC_003131.1 - pCad, NC 003134.1 - pFra, NC 003132.1 - pPst).

Координаты мишеней, использованных в ДНК-чипе:

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

Полимеразную цепную реакцию осуществляют в шести мультиплексных смесях в отдельных пробирках (таблицы 1-6). Олигонуклеотидные праймеры, применяемые для амплификации в ПЦР хромосомных и плазмидных мишеней, рассчитывают на основе нуклеотидных последовательностей штаммов Y. pestis CO92, KIM, Antiqua и Nepal516 и штаммов неосновных подвидов, а также последовательностей плазмид pCKF, pCad, pPst, pFra, представленных в базе данных NCBI GenBank. Один из пары праймеров для каждой мишени, несет в своем составе флуоресцентный краситель Су5. С помощью праймеров в ПЦР проводят амплификацию участков «yihN», «3а», «45», «Alt», «His», «Ul», «Caucas», «Tal», «Micr», «glpD», «Med24», «Pro», «Med70», «Phage», «pla», «cafl», «irp2», «lcrV».

Процедуру блокировки поверхности ДНК-чипа (предгибридизацию) и процедуру гибридизации проводят в соответствии с общепринятыми методами. В ячейку вносят ПЦР продукты всех шести мультиплексных ПЦР-смесей.

Учет и анализ результатов

Регистрацию и учет результатов анализа проводят с помощью сканера микрослайдов и прилагаемого программного обеспечения.

Рассчитывают критический уровень сигнала флуоресценции по формуле

С_кр=2,2×К^-,

где К^- - значение флуоресценции отрицательного контроля при 635 нм. Результат считают отрицательным, если среднее значение флуоресценции при длине волны 635 нм для 4-х повторов одного зонда меньше критического уровня флуоресценции. Результат считают положительным, если среднее значение флуоресценции при длине волны 635 нм для 4-х повторов одного зонда больше или равно критическому уровню флуоресценции. Результаты анализа подлежат учету при отрицательном результате в лунке отрицательного контроля (гибридизационный буфер).

Принадлежность штамма к виду Y. pestis, к определенному подвиду, биовару, филогенетической линии и вирулентность (присутствие генов основных факторов патогенности) устанавливают по наличию или отсутствию флуоресценции на стекле в местах нанесения соответствующих зондов после проведения гибридизации с ампликонами, полученными в шести мультиплексных ПЦР (таблицы 1-6).

У всех штаммов Y. pestis будет наблюдаться флуоресценция по мишеням «yihN» и «3а», являющимся маркерными для штаммов этого вида.

При использовании ДНК мишеней для дифференциации подвидов у штаммов Y. pestis основного подвида будет отсутствовать сигнал флуоресценции по мишени «45». У штаммов алтайского биовара центральноазиатского подвида будет отсутствовать сигнал флуоресценции по мишени «Alt», у гиссарского биовара этого подвида - по мишени «His», у таласского биовара этого подвида - по мишени «Tal», у биовара microtus этого подвида - по мишени «Micr». У штаммов улегейского подвида не будет регистрироваться сигнал по мишени «U1», у штаммов кавказского подвида - по мишени «Caucas».

При дифференциации штаммов Y. pestis основного подвида по принадлежности к биоварам у штаммов восточного биовара (1.ORI) будет отсутствовать сигнал флуоресценции по мишени «glpD», делеция в которой является маркерной для этого биовара. Сигнал флуоресценции по мишени «Med24» будет отсутствовать у всех штаммов средневекового биовара за исключением отдельной филогенетической линии этого биовара - 2.MED0. Штаммы этой линии идентифицируют по наличию сигнала флуоресценции с праймерами на мишень «pCKF» - участок плазмиды pCKF, маркерной для штаммов ветви 2.MED0. У штаммов античного биовара основного подвида будут отмечаться сигналы флуоресценции по мишеням «glpD» и «Med24».

Для штаммов филогенетической ветви «1» (1.ANT и 1.ORI) будет характерно наличие флуоресцентного сигнала по мишени «Phage», а для штаммов филогенетической ветви «2» (2.ANT и 2.MED) будет характерно отсутствие сигнала флуоресценции по мишени «Med70».

При детекции основных генов патогенности у штаммов Y. pestis, содержащих остров высокой патогенности HPI в составе хромосомной области пигментации, будет наблюдаться сигнал флуоресценции по мишени «irp2». Для штаммов, несущих ген pla плазмиды pPst, будет характерно наличие сигнала флуоресценции по мишени «pla». У штаммов с геном lcrV плазмиды pCad будет регистрироваться флуоресценция по мишени «lcrV». Для штаммов, содержащих ген cafl плазмиды pFra, будет характерно наличие сигнала флуоресценции по мишени «caf».

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Индикация и идентификация штамма Y. pestis основного подвида восточного биовара филогенетической ветви 1.ORI

Выделение ДНК исследуемого штамма Y. pestis проводят с помощью коммерческих наборов для выделения ДНК. Полученную ДНК используют для постановки ПЦР на ДНК мишени «yihN», «3а», «45», «Alt», «His», «U1», «Caucas», «Tal», «Micr», «glpD», «Med24», «Pro», «Med70», «Phage», «pla», «caf1 », «irp2», «lcrV».

Для индикации и идентификации исследуемого штамма проводят шесть мультиплексных ПЦР на ДНК мишени «yihN», «3а», «45», «Alt», «His», «U1», «Caucas», «Tal», «Micr», «glpD», «Med24», «Pro», «Med70», «Phage», «pla», «cafl», «irp2», «lcrV» (таблицы 1-6). Затем проводят гибридизацию ДНК исследуемого штамма с иммобилизованными на носителе зондами ДНК мишеней. По результатам гибридизации получают следующие результаты. По мишеням «yihN», «3а», «Alt», «His», «U1», «Caucas», «Tal», «Micr», «Med24», «Med70», «Phage», «pla», «cafl», «irp2», «lcrV» сигнал флуоресценции присутствует, но он не проявляется по мишеням «45», «glpD», «Pro». Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к филогенетической ветви 1.ORI восточного биовара основного подвида и в составе его генома присутствуют гены основных факторов патогенности: ген irp2 острова высокой патогенности хромосомной области пигментации, ген pla плазмиды pPst, ген lcrV плазмиды pCad, ген cafl плазмиды pFra.

Пример 2. Индикация и идентификация штамма Y. pestis основного подвида античного биовара филогенетической ветви 2.ANT

Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. В результате проведения гибридизации получают следующие результаты. По мишеням «yihN», «3а», «Alt», «His», «U1», «Caucas», «Tal», «Micr», «glpD», «Med24», «pla», «cafl», «irp2», «lcrV» сигнал флуоресценции присутствует, но он не проявляется по мишеням «45», «Pro», «Phage», «Med70». Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к филогенетической ветви 2.ANT античного биовара основного подвида и в составе его генома присутствуют гены основных факторов патогенности: ген irp2 острова высокой патогенности хромосомной области пигментации, ген pla плазмиды pPst, ген lcrV плазмиды pCad, ген cafl плазмиды pFra.

Пример 3. Индикация и идентификация штамма Y. pestis основного подвида средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED0

Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. По мишеням «yihN», «3а», «Alt», «His», «U1», «Caucas», «Tal», «Micr», «glpD», «Med24», «Pro», «Phage», «pla», «cafl», «irp2», «lcrV» сигнал флуоресценции присутствует, но он не проявляется по мишеням «45», «Phage», «Med70». Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к филогенетической ветви 2.MED0 средневекового биовара основного подвида и в составе его генома присутствуют гены основных факторов патогенности: ген irp2 острова высокой патогенности хромосомной области пигментации, ген pla плазмиды pPst, ген lcrV плазмиды pCad, ген cafl плазмиды pFra.

Пример 4. Индикация и идентификация штаммов Y. pestis улегейского подвида Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. По мишеням «yihN», «3а», «45», «Alt», «His», «Caucas», «Tal», «Micr», «glpD», «Med24», «Med70», «pla», «cafl», «irp2», «lcrV» сигнал флуоресценции присутствует, но он не проявляется по мишеням «Pro», «Phage», «U1». Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к улегейскому подвиду и в составе его генома присутствуют гены основных факторов патогенности: ген irp2 острова высокой патогенности хромосомной области пигментации, ген pla плазмиды pPst, ген lcrV плазмиды pCad, ген cafl плазмиды pFra.

Пример 5. Индикация и идентификация штаммов Y.pestis кавказского подвида Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. По мишеням «yihN», «3а», «45», «Alt», «His», «U1», «Tal», «Micr», «glpD», «Med24», «Med70», «cafl», «irp2», «lcrV» сигнал флуоресценции присутствует, но он не проявляется по мишеням «pla», «Pro», «Cauc», «Phage». Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к кавказскому подвиду и в составе его генома присутствуют гены основных факторов патогенности: ген irp2 острова высокой патогенности хромосомной области пигментации, ген lcrV плазмиды pCad, ген cafl плазмиды pFra.

Пример 6. Индикация и идентификация штаммов Y.pestis алтайского биовара центральноазиатского подвида

Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. По мишеням «yihN», «3а», «45», «Cauc», «His», «U1», «Tal», «Micr», «glpD», «Med24», «Med70», «cafl», «irp2», «lcrV», «pla» сигнал флуоресценции присутствует, но он не проявляется по мишеням «Pro», «Alt», «Phage». Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к алтайскому биовару центральноазиатского подвида и в составе его генома присутствуют гены основных факторов патогенности: ген irp2 острова высокой патогенности хромосомной области пигментации, ген pla плазмиды pPst, ген lcrV плазмиды pCad, ген cafl плазмиды pFra.

Пример 7. Индикация и идентификация штаммов Y.pestis гиссарского биовара центральноазиатского подвида

Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. По мишеням «yihN», «3а», «45», «Саис», «U1», «Alt», «Tal», «Micr», «glpD», «Med24», «Med70», «cafl», «irp2», «lcrV», «pla» сигнал флуоресценции присутствует, но он не проявляется по мишеням «Pro», «His», «Phage». Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к гиссарскому биовару центральноазиатского подвида и в составе его генома присутствуют гены основных факторов патогенности: ген irp2 острова высокой патогенности хромосомной области пигментации, ген pla плазмиды pPst, ген lcrV плазмиды pCad, ген cafl плазмиды pFra.

Пример 8. Индикация и идентификация штаммов Y.pestis таласского биовара центральноазиатского подвида

Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. По мишеням «yihN», «3а», «45», «Cauc», «U1», «Alt», «His», «Micr», «glpD», «Med24», «Med70», «cafl», «irp2», «lcrV», «pla» сигнал флуоресценции присутствует, но он не проявляется по мишеням «Pro», «Tal», «Phage». Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к таласскому биовару центральноазиатского подвида и в составе его генома присутствуют гены основных факторов патогенности: ген irp2 острова высокой патогенности хромосомной области пигментации, ген pla плазмиды pPst, ген lcrV плазмиды pCad, ген cafl плазмиды pFra.

Пример 9. Индикация и идентификация штаммов Y.pestis биовара microtus центральноазиатского подвида

Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. По мишеням «yihN», «3а», «45», «Cauc», «U1», «Alt», «His», «Tal», «glpD», «Med24», «Med70», «cafl», «irp2», «lcrV», «pla» сигнал флуоресценции присутствует, но он не проявляется по мишеням «Pro», «Micr», «Phage». Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к биоваре microtias центральноазиатского подвида и в составе его генома присутствуют гены основных факторов патогенности: ген irp2 острова высокой патогенности хромосомной области пигментации, ген pla плазмиды pPst, ген lcrV плазмиды pCad, ген cafl плазмиды pFra.

Таким образом, заявленный способ индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы методом ДНК-чипа с использованием мишеней «yihN», «3а», «45», «Alt», «His», «U1», «Caucas», «Tal», «Micr», «glpD», «Med24», «Pro», «Med70», «Phage», «pla», «cafl», «irp2», «lcrV» позволяет быстро и эффективно определять их принадлежность к виду Y. pestis, подвидам, биоварам, филогенетическим линиям возбудителя, а также наличие у них генов основных факторов патогенности.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы по их принадлежности к виду Yersinia pestis, к подвидам, биоварам, филогенетическим ветвям по наличию генов основных факторов патогенности методом ДНК-чипа. Способ включает выделение ДНК штамма, проведение мультиплексных ПЦР в один прием в шести реакционных смесях на ДНК мишени: «pla», «3а», «cafl», «yihN» в первой; «irp2», «lcrV» во второй; «glpD», «Pro», «Med24», «45» в третьей; «Med70», «Phage» в четвертой; «Alt», «His», «U1» в пятой; «Caucas», «Tal», «Micr» в шестой с последующей гибридизацией с иммобилизованными зондами, индикацией и идентификацией штаммов по наличию и отсутствию сигналов флуоресценции. У всех штаммов Y. pestis будет наблюдаться флуоресценция по мишеням «yihN» и «3а». При дифференциации подвидов будет отсутствовать сигнал флуоресценции у штаммов Y. pestis основного подвида по мишени «45», у штаммов алтайского биовара центральноазиатского подвида по мишени «Alt», у гиссарского биовара центральноазиатского подвида по мишени «His», у таласского биовара центральноазиатского подвида по мишени «Та1», у биовара microtias центральноазиатского подвида по мишени «Micr», у штаммов улегейского подвида по мишени «U1», у штаммов кавказского подвида по мишени «Caucas». При дифференциации штаммов Y. pestis основного подвида по принадлежности к биоварам будет отсутствовать сигнал флуоресценции у штаммов восточного биовара (1.ORI) по мишени «glpD», у всех штаммов средневекового биовара кроме 2.MED0 по мишени «Med24» и будут отмечаться сигналы флуоресценции у штаммов ветви 2.MED0 по мишени «pCKP», у штаммов античного биовара основного подвида по мишеням «glpD» и «Med24». Для штаммов филогенетической ветви «1» (1.ANT и 1.ORI) будет характерно наличие флуоресцентного сигнала по мишени «Phage», для штаммов филогенетической ветви «2» (2.ANT и 2.MED) будет характерно отсутствие сигнала флуоресценции по мишени «Med70». При детекции основных генов патогенности будет наблюдаться сигнал флуоресценции у штаммов Y. pestis, содержащих остров высокой патогенности HPI в составе хромосомной области пигментации по мишени «irp2», у штаммов, несущих ген pla плазмиды pPst по мишени «pla», у штаммов с геном lcrV плазмиды pCad по мишени «lcrV», у штаммов, содержащих ген cafl плазмиды pFra по мишени «caf». Изобретение позволяет определить принадлежности к виду, подвидам, биоварам, филогенетическим ветвям и наличие основных генов патогенности методом ДНК-чипа, который предусматривает выделение ДНК-штамма, проведение шести мультиплексных ПЦР на ДНК мишени yihN», «3а», «45», «Alt», «His», «U1», «Caucas», «Tal», «Micr», «glpD», «Med24», «Pro», «Med70», «Phage», «pla», «cafl», «irp2», «lcrV», с последующей гибридизацией с иммобилизованными зондами, индикацией и идентификацией штаммов по наличию и отсутствию сигналов флуоресценции в соответствии с таблицами. 6 табл., 9 пр.

Способ индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы по их принадлежности к виду Yersinia pestis, к подвидам, биоварам, филогенетическим ветвям по наличию генов основных факторов патогенности методом ДНК-чипа, предусматривающий выделение ДНК штамма, проведение мультиплексных ПЦР в один прием в шести реакционных смесях на ДНК мишени: «pla», «3а», «cafl», «yihN» в первой; «irp2», «lcrV» во второй; «glpD», «Pro», «Med24», «45» в третьей; «Med70», «Phage» в четвертой; «Alt», «His», «U1» в пятой; «Caucas», «Tal», «Micr» в шестой с последующей гибридизацией с иммобилизованными зондами, индикацией и идентификацией штаммов по наличию и отсутствию сигналов флуоресценции: у всех штаммов Y. pestis будет наблюдаться флуоресценция по мишеням «yihN» и «3а»; при дифференциации подвидов будет отсутствовать сигнал флуоресценции у штаммов Y. pestis основного подвида по мишени «45», у штаммов алтайского биовара центральноазиатского подвида по мишени «Alt», у гиссарского биовара центральноазиатского подвида по мишени «His», у таласского биовара центральноазиатского подвида по мишени «Та1», у биовара microtias центральноазиатского подвида по мишени «Micr», у штаммов улегейского подвида по мишени «U1», у штаммов кавказского подвида по мишени «Caucas»; при дифференциации штаммов Y. pestis основного подвида по принадлежности к биоварам будет отсутствовать сигнал флуоресценции у штаммов восточного биовара (1.ORI) по мишени «glpD», у всех штаммов средневекового биовара кроме 2.MED0 по мишени «Med24» и будут отмечаться сигналы флуоресценции у штаммов ветви 2.MED0 по мишени «pCKP», у штаммов античного биовара основного подвида по мишеням «glpD» и «Med24»; для штаммов филогенетической ветви «1» (1.ANT и 1.ORI) будет характерно наличие флуоресцентного сигнала по мишени «Phage», для штаммов филогенетической ветви «2» (2.ANT и 2.MED) будет характерно отсутствие сигнала флуоресценции по мишени «Med70»; при детекции основных генов патогенности будет наблюдаться сигнал флуоресценции у штаммов Y. pestis, содержащих остров высокой патогенности HPI в составе хромосомной области пигментации по мишени «irp2», у штаммов, несущих ген pla плазмиды pPst по мишени «pla», у штаммов с геном lcrV плазмиды pCad по мишени «lcrV», у штаммов, содержащих ген cafl плазмиды pFra по мишени «caf».