ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Deinococcus radiodurans Российский патент 2011 года по МПК C12N1/10 C12R1/00 

Предлагаемое изобретение относится к микробиологии, а именно к получению питательных сред для культивирования бактерий Deinococcus radiodurans.

Непатогенная бактерия Deinococcus radiodurans известна устойчивостью к дозам радиации, в десятки раз превышающим летальные для изученных к настоящему времени микроорганизмов.

Одной из характерных особенностей этой бактерии является выработка деиноксантина - каротиноида, придающего колониям характерную розово-оранжевую окраску. Это вещество обладает уникально высокой антиоксидантной активностью. Деиноксантин способен значительно эффективнее, чем β-каротин и α-токоферол, перехватывать синглетный кислород и гидроксильный радикал (наиболее опасные виды активных форм кислорода).

Следовательно, это безвредное вещество может иметь целый ряд применений:

- в пищевой технологии как недорогой натуральный краситель для разнообразных продуктов; или как натуральный антиоксидант, препятствующий прогорканию жирных продуктов (майонеза, шоколадной пасты и др.);

- в фармакологии как эффективный антиоксидант; в том числе как основа адаптогенов, геропротекторов, анестетиков нового поколения, протекторов ближнего ультрафиолета.

В связи с вышеизложенным разработка дешевых питательных сред для выращивания бактерии Deinococcus radiodurans в настоящее время является актуальной задачей.

Известен питательный бульон (ТУ 42-14-83-78) [1] для культивирования широкого спектра микроорганизмов и дистиллированной воды, имеющий следующий состав, г/л:

Панкреатический гидролизат кильки 10,05 Натрия хлорид 4,95

рН 7,2±0,2.

Недостатком известного питательного бульона является низкая производительность культивирования бактерий Deinococcus radiodurans.

Известна питательная среда [2], используемая для выращивания штамма микроорганизмов Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, включающая, г/л:

Дрожжевой экстракт 5,0 Пептон 15,0 NaCl 5,0 Агар 15,0 Дистиллированная вода до 1 л

Недостатком известной питательной среды является дороговизна составляющих компонентов (продукт животного происхождения - пептон, дрожжевой экстракт, агар). При этом производительность культивирования бактерий Deinococcus radiodurans с использованием данной среды недостаточно высокая.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является выбранная в качестве прототипа питательная среда [3], используемая для выращивания микроорганизмов Deinococcus radiodurans, следующего состава, г/л:

Триптон 5,0 Глюкоза 1,0 Дрожжевой экстракт 3,0 Дистиллированная вода до 1 л

Недостатком данной среды является использование для питательной основы дорогостоящих ингредиентов (триптон - трипсиновый гидролизат белкового субстрата животного происхождения, дрожжевой экстракт - автолизат пекарских дрожжей). При этом производительность культивирования бактерий Deinococcus radiodurans с использованием данной среды недостаточно высокая.

Задачей предлагаемого изобретения является удешевление среды, упрощение ее состава, а также повышение выхода биомассы бактерий Deinococcus radiodurans.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда, содержащая питательную основу и дистиллированную воду, согласно изобретению в качестве питательной основы содержит соевую муку при следующем соотношении компонентов, г/л:

Соевая мука 50,0 Дистиллированная вода до 1 л

В отличие от прототипа, предлагаемая среда более простая и дешевая и обеспечивает оптимальные условия для роста Deinococcus radiodurans.

Неизвестно использование соевой муки в качестве питательной основы для выращивания микроорганизмов Deinococcus radiodurans, что является отличительным признаком предлагаемой питательной среды.

Способ поясняется следующими примерами.

Экспериментально был проведен подбор оптимального количества соевой муки в питательной среде.

Пример 1. Для получения одного литра питательной среды берут 10 г соевой муки, добавляют до 1 л дистиллированной воды, стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.

Для достоверности во всех опытах были использованы 3 штамма микроорганизмов: Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, Deinococcus radiodurans BKM В-1422, Deinococcus radiodurans BKM В-1467.

Штаммы Deinococcus radiodurans выращивали в 250-мл широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ/мл использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Подсчитанное количество КОЕ/мл для всех штаммов микроорганизмов Deinococcus radiodurans дано в таблице 1.

При выращивании в данной среде для всех штаммов Deinococcus radiodurans наблюдалось незначительное равномерное окрашивание среды в розово-оранжевый цвет и незначительное образование осадка биомассы розово-оранжевого цвета.

Пример 2. По примеру 1 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:

Соевая мука 50,0 Дистиллированная вода до 1 л

Культуры Deinococcus radiodurans выращивали в соответствии с примером 1. Для подсчета количества КОЕ/мл также использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Подсчитанное количество КОЕ/мл для всех штаммов микроорганизмов Deinococcus radiodurans дано в таблице 1.

При выращивании штаммов Deinococcus radiodurans в этой питательной среде для каждого из них наблюдалось значительное равномерное окрашивание среды в розово-оранжевый цвет и значительное образование осадка биомассы розово-оранжевого цвета.

Пример 3. По примеру 1 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:

Соевая мука 100,0 Дистиллированная вода до 1 л

Штаммы микроорганизмов Deinococcus radiodurans выращивали в соответствии с примером 1. Аналогично примеру 1 подсчитывали количество КОЕ/мл.

Подсчитанное количество КОЕ/мл для всех штаммов микроорганизмов Deinococcus radiodurans дано в таблице 1.

При выращивании в данной среде разных штаммов микроорганизмов Deinococcus radiodurans для каждого из них наблюдалось значительное равномерное окрашивание среды в розово-оранжевый цвет и значительное образование осадка биомассы розово-оранжевого цвета.

Из таблицы видно, что максимальный рост для всех штаммов микроорганизмов Deinococcus radiodurans наблюдался в средах с содержанием соевой муки 50 г/л и 100 г/л. При этом количество КОЕ/мл для всех штаммов на этих средах было примерно одинаковым, но в 13,6-17,7 и в 11,8-15,6 раз больше соответственно, чем количество КОЕ/мл на среде с этими штаммами с содержанием соевой муки 10 г/л.

Полученные результаты позволили определить, что оптимальный вариант питательной среды на основе соевой муки - 50 г/л дистиллированной воды.

Таблица 1 Количество соевой муки в 1 л питательной среды, г Количество колониеобразующих единиц/мл (КОЕ/мл) Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 Deinococcus radiodurans BKMB-1422 Deinococcus radiodurans BKMB-1467 10 1,1×10⁸ 1,2×10⁸ 0,9×10⁸ 50 1,5×10⁹ 1,7×10⁹ 1,6×10⁹ 100 1,3×10⁹ 1,3×10⁹ 1,4×10⁹

Данное соотношение ингредиентов позволяет добиться максимального роста культуры Deinococcus radiodurans при наименьшем расходе соевой муки. Кроме того, экспериментально показана возможность культивирования на данной питательной среде различных штаммов Deinococcus radiodurans.

Пример 4. Согласно методическим рекомендациям [4] были проведены качественный и количественный контроли биологических свойств предложенной среды с использованием трех тестовых штаммов Deinococcus radiodurans: ВКПМ В-8209, ВКМ В-1422, ВКМ В-1467. Качественный контроль выполняли путем посева односуточного тестового штамма в предлагаемую питательную среду с помощью общепринятой методики.

Питательную среду готовили следующим образом.

Для получения одного литра питательной среды брали 50 г соевой муки, добавляли до 1 л дистиллированной воды и стерилизовали при 1 атм в течение 20 мин В 250-мл широкогорлые колбы Эрленмейера с 50 мл данной жидкой среды вносили по 50 мкл ночной культуры бактерий Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, Deinococcus radiodurans ВКМ В-1422, Deinococcus radiodurans ВКМ В-1467. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С, 150 об/мин в течение 48 часов.

По истечении срока инкубации тестовые штаммы дали хорошо различимый рост с типичными отличительными признаками: помутнение жидкой среды с равномерным окрашиванием в розово-оранжевый цвет (штамм образует пигмент розово-оранжевого цвета) и образованием осадка розово-оранжевого цвета. Проведение качественного контроля показало способность тестовых штаммов Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, Deinococcus radiodurans ВКМ В-1422, Deinococcus radiodurans ВКМ В-1467 расти на предложенной среде, с получением при этом характерных дифференцирующих признаков.

Также проводили количественный контроль предложенной среды по биологическим показателям. Для этого готовили суспензию тестовых штаммов с использованием стандарта мутности в 10 единиц (концентрация микробных клеток в 1 млрд) и десятикратные серийные разведения (по 8-е разведение включительно).

Для контроля разбавления из 6-го и 7-го разведений высевали по 0,1 мл суспензии прямым посевом на чашки с питательным агаром. Из каждого разведения делали по три таких посева. Чашки с посевами инкубировали в термостате при 30°С в течение 24-48 часов. Для каждой серии посевов подсчитывали среднее число колоний, выросших на трех чашках.

Среднее число колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 из шестого разведения, составило 93, а из седьмого - 9.

Среднее число колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового штамма Deinococcus radiodurans BKM В-1422 из шестого разведения, составило 97, а из седьмого - 9.

Среднее число колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового штамма Deinococcus radiodurans BKM В-1467 из шестого разведения, составило 88, а из седьмого - 9.

Согласно методическим рекомендациям [4] среднее число колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового штамма из шестого разведения, должно составлять около 100 КОЕ (колониеобразующих единиц), а соотношение средних значений при посеве из шестого в седьмое разведение должно быть близко 10:1. Таким образом, полученные значения свидетельствуют о пригодности и эффективности предложенной среды для выращивания микроорганизмов Deinococcus radiodurans.

Кроме того, была проведена сравнительная характеристика роста микроорганизмов Deinococcus radiodurans на разных питательных средах.

Интенсивность роста бактерий Deinococcus radiodurans на разных средах оценивали путем приготовления ряда разведений суспензии штамма из каждой питательной среды, посева на агаризованные среды и учета количества КОЕ/мл.

Пример 5. Для выращивания штаммов Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, Deinococcus radiodurans BKM В-1422, Deinococcus radiodurans BKM В-1467 была приготовлена питательная среда TGY, описанная в прототипе [3] и имеющая следующий состав г/л:

Триптон 5,0 Глюкоза 1,0 Дрожжевой экстракт 3,0 Дистиллированная вода до 1 л

Культуры Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, Deinococcus radiodurans BKM В-1422, Deinococcus radiodurans BKM В-1467 выращивали в 250- мл широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С, 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ/мл использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Подсчитанное количество КОЕ/мл для всех штаммов бактерий Deinococcus radiodurans дано в таблице 2.

Пример 6. Для выращивания штаммов Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, Deinococcus radiodurans BKM В-1422, Deinococcus radiodurans BKM В-1467 была приготовлена жидкая питательная среда L, описанная в аналоге [2] и имеющая следующий состав, г/л:

Дрожжевой экстракт 5,0 Пептон 15,0 NaCl 5,0 Дистиллированная вода до 1 л

Культуры Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, Deinococcus radiodurans BKM В-1422, Deinococcus radiodurans BKM В-1467 выращивали в 250-мл широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С, 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ/мл использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Подсчитанное количество КОЕ/мл для всех штаммов Deinococcus radiodurans приведено в таблице 2.

Пример 7. Для выращивания штаммов микроорганизмов Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, Deinococcus radiodurans BKM В-1422, Deinococcus radiodurans BKM В-1467 был приготовлен описанный в аналоге [1] питательный бульон (ТУ 42-14-83-78) производства ФГУП «НПО «МИКРОГЕН» МЗ РФ следующего состава, г/л:

Панкреатический гидролизат кильки 10,05 Натрия хлорид 4,95

рН 7,2±0,2.

Культуры Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, Deinococcus radiodurans BKM В-1422, Deinococcus radiodurans BKM В-1467 выращивали в 250-мл широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С, 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ/мл использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Подсчитанное количество КОЕ/мл для всех штаммов Deinococcus radiodurans дано в таблице 2.

Пример 8. Для выращивания штаммов Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, Deinococcus radiodurans BKM В-1422, Deinococcus radiodurans BKM В-1467 была приготовлена предлагаемая питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:

Соевая мука 50,0 Дистиллированная вода до 1 л

Культуры Deinococcus radiodurans ВКПМ B-8209, Deinococcus radiodurans BKM B-1422, Deinococcus radiodurans BKM B-1467 выращивали в 250-мл широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл предложенной соевой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С, 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ/мл использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Подсчитанное количество КОЕ/мл для всех штаммов Deinococcus radiodurans приведено в таблице 2.

Таблица 2 Название среды Количество колониеобразующих единиц/мл (КОЕ/мл) Deinococcus radiodurans ВКПМ B-8209 Deinococcus radiodurans BKM B-1422 Deinococcus radiodurans BKM В-1467 TGY 5,0×10⁸ 7,7×10⁸ 7,1×10⁸ L 1,0×10⁸ 1,6×10⁸ 2,1×10⁸ Питательный бульон 3,5×10⁷ 5,5×10⁷ 6,3×10⁷ Соевая среда 1,3×10⁹ 1,7×10⁹ 1,3×10⁹

Как видно из таблицы 2, максимальный рост штаммов микроорганизмов Deinococcus radiodurans ВКПМ B-8209, Deinococcus radiodurans BKM B-1422, Deinococcus radiodurans BKM B-1467 наблюдался при выращивании в предлагаемой среде. При этом количество КОЕ/мл на соевой среде для всех штаммов микроорганизмов Deinococcus radiodurans было в 1,8-2,6 раз больше, чем на среде TGY, в 6,2-13,0 раз больше, чем количество КОЕ/мл на среде L, и в 20,6-37,1 раз больше, чем на питательном бульоне.

Это позволяет сделать вывод о явных преимуществах предлагаемой питательной среды для выращивания микроорганизмов Deinococcus radiodurans в сравнении с известными средами, в том числе и со средой-прототипом.

Таким образом, более простая и дешевая питательная среда позволяет получать более высокий выход количества колоний бактерий Deinococcus radiodurans. При этом предлагаемая питательная среда технически проста в приготовлении (без предварительного этапа подготовки основы), в нее не входят дорогие компоненты.

Источники информации

1. Справочник по микробиологическим питательным средам. Под редакцией Меджидова М.М. Дагестанское книжное издательство, Махачкала, 1989, с.14.

2. Паспорт на штамм микроорганизма Deinococcus radiodurans ВКПМ 8209. Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов. ФГУП ГосНИИГенетика.

3. Zhang Y.M., Wong T.Y., Chen L.Y., Lin C.S., Liu J.K. Induction of a futile Embden-Meyerhof-Parnas pathway in Deinococcus radiodurans by Mn: possible role of the pentose pathway in cell survival. Applied and Enivironmental Microbiology. 2000. Vol.66. №. 1, p. 105-112 (прототип).

4. МР "Контроль качества питательных сред" № 04-3-16/1615 от 27.06+.2003.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения питательных сред для выращивания Deinococcus radiodurans. Питательная среда содержит соевую муку и дистиллированную воду при заданных количественных соотношениях. Изобретение позволяет повысить выход Deinococcus radiodurans. 2 табл.

Питательная среда для выращивания микроорганизмов Deinococcus radiodurans, содержащая питательную основу и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит соевую муку при следующих количественных соотношениях компонентов, г/л:
соевая мука 50,0 дистиллированная вода до 1 л