ШТАММ БАКТЕРИЙ MYCOBACTERIUM SMEGMATIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОКИСЛЕНИЯ СТЕРИНОВ РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ДО АНДРОСТ-4-ЕН-3,17-ДИОНА Российский патент 1999 года по МПК C12P33/00 C07J1/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/34 

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно касается получения стероидных медицинских препаратов с использованием микроорганизмов.

Целью изобретения является получение нового эффективного мутантного штамма бактерий, способного трансформировать стерины растительного (ситостерин) и животного (холестерин) происхождения в андрост-4-ен-3,17-дион (АД) - ключевой промежуточный продукт в синтезе стероидных медицинских препаратов. В настоящее время указанные стерины являются наиболее перспективным видом стероидного сырья.

Трансформация стероидов микроорганизмами, в том числе некоторыми видами рода Mycobacterium, широко описана в мировой научной и патентной литературе [А.А.Ахрем, Ю.А.Титов "Стероиды и микроорганизмы", Наука, М., 1970; S.B.Mahato, S. Banerjee, and S.Podder "Phytochemistry", 1989, 28, p.7]. Все описанные микроорганизмы-трансформанты характеризуются медленной скоростью роста как в поверхностных, так и в глубинных условиях, в связи с чем трансформация может продолжаться более 10 суток. Эти микроорганизмы не выделяют антибиотических веществ, что при крупномасштабном производстве нередко приводит к контаминации посторонней микрофлорой. В связи с этим перспективно иметь процессы выращивания вегетативного посевного материала и ферментации (трансформации), защищенные от подобных отрицательных моментов. Это достигается добавлением в среды для выращивания и трансформации определенного количества экзогенного антибиотика и соответственно использования трансформирующего микроорганизма, устойчивого к данному антибиотику. Штамм бактерий с подобными свойствами обладает преимуществом перед другими микроорганизмами, способными окислять стерины.

Для селекции штамма, окисляющего стерины, в качестве исходной родительской культуры использован штамм Mycobacterium smegmatis, выделенный из биологического материала, полученного из ветеринарной лечебницы г. Москвы.

Исходная культура была подвергнута чередующемуся воздействию физических (УФ-облучение) и химических (нитрозометилбиурет и нитрозогуанидин) мутагенных факторов. Путем ступенчатого отбора индуцированных мутантов получен новый, оригинальный, стрептомициноустойчивый штамм Mycobacterium smegmatis.

Штамм Mycobacterium smegmatis депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ Ас-1552 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

(Среды приготовлены по книге "Методы селекции продуцентов антибиотиков и ферментов", М., 1978 г. Цвет колоний определен по шкале Бондарцева).

Среда с дрожжевым экстрактом и глицерином.

Колонии округлые, плоские с неровным краем, пигмент в среду не выделяется, цвет колоний Ж-2 (рыжий), диаметр колоний 5-6 мм. Среда с глюкозой и пептоном.

Колонии плоские с неровными краями, центр колоний слегка приподнят, пигмент в среду не выделяется, цвет близок к Ж-2 (рыжеватый), диаметр колоний 4,5-5 мм.

Среда с глюкозой и БВК.

Колонии округлые плоские с неровным краем, с намечающейся по краям радиальной складчатостью, в центре - мелкоморщинистые, пигмент в среду не выделяется, цвет Ж-2, диаметр колоний 4,5 - 7,5 мм.

Среда 1.

Колонии плоские матовые, по краям более светлые, складчатость центрическая, пигмент в среду не выделяется, цвет колоний 0-3 (оранжевый), диаметр 4,0 - 7,0 мм.

Среда 6 (кукурузная).

Колонии овальные плоские с шероховатой поверхностью, пигмент в среду не выделяется, цвет 0-5 (телесно-розовый), диаметр колоний 5,5 - 7 мм.

Среда 12.

Колонии плоские с шероховатой поверхностью, неровными краями, цвет 0 - 5 (телесно-розовый), диаметр колоний 5,5 - 6,6 мм.

Среда 22 с мясным экстрактом и пептоном.

Колонии плоские неровно-округлые, с неровным краем, мелкоморщинистые, пигмент в среду не выделяется, цвет Ж-4 (бледно-терракотовый), диаметр колоний 4,5 - 5 мм.

Среда 63.

Колонии плоские неровно-округлые, морщинистые с неровными краями, пигмент в среду не выделяют, цвет М-7 (золотисто-желтый), диаметр колоний 4 - 5 мм.

Соевый агар.

Колонии плоские неровно-округлые, с неровными краями, мелкоморщинистые, пигмент в среду не выделяется, цвет близкий Ж-2 (рыжеватый), диаметр колоний 5,5 - 6,5 мм.

Среда гороховая.

Колонии плоские округлые с неровными краями, шероховатой поверхностью, пигмент в среду не выделяется, цвет колоний 0-3 (оранжевый), диаметр 7,0 - 8,5 мм.

Среда пептоно-кукурузная.

Колонии неровно-округлые с шероховатой поверхностью, по краям колонии неровные, более светлые и гладкие, чем в средней части, пигмент в среду не выделяется, цвет колоний 0-3 (оранжевый), диаметр 7 - 11 мм.

Среда с глюкозо-аспарагиновая.

Колонии неровно-округлые с неровными краями, поверхность колоний радиально-морщинистая, пигмент в среду не выделяется, цвет колоний Д-2 (абрикосово-желтый), диаметр колоний 6,0 - 8,0 мм.

Среда глицерино-аспарагиновая.

Колонии неровно-округлые радиально-морщинистые, с неровными краями, пигмент в среду не выделяется, цвет колоний 0-3 (оранжевый), диаметр 3,0 - 5,0 мм.

Среда Гаузе.

Рост слабый, колонии точечные, цвет В-5 (темно-телесный).

Среда Ваксмана.

Колонии пленчатые с шероховатой поверхностью, неправильной формы, диаметр 4,5 - 6,0 мм. В рассеве присутствуют колонии двух типов:
1 - большая часть - пленчатые, неправильной формы;
2 - округлые с неровным краем; цвет, близкий Ж-2 (рыжеватый).

Среда Чапека.

Колонии приподнятые с сухой поверхностью, неровно-овальные, диффузно-морщинистые, пигмент в среду не выделяется, цвет колоний 0-3 (оранжевый), диаметр колоний 4,5 - 8,0 мм.

Среда Чапека-Докса.

Рост слабый, колонии точечные, цвет В-5 (темно-телесный).

Физиологические признаки микроорганизма.

Строгий аэроб, оптимальная температура выращивания культуры на агаровых средах 28 - 35^oC.

Биохимические признаки.

Желатин не разжижает; молоко пептонизирует, но не коагулирует; крахмал не гидролизует.

Отношение к углеводам: усваивает глюкозу, фруктозу, инозит, маннит; не усваивает арабинозу, ксилозу, раффинозу, галактозу, сахарозу, лактозу, рамнозу, сорбит, мальтозу.

Культура грам-положительна, представлена короткими прямыми или изогнутыми удлиненными палочками (в зависимости от условий выращивания); размеры варьируют: 0,2 - 0,4 x 0,5 - 4,0 мкм, спор не образует.

Штамм является устойчивым к 100 мкг/мл стрептомицина, непатогенным.

Штамм Mycobacterium smegmatis ВКПМ Ас-1552 способен трансформировать стерины растительного и животного происхождения с концентрацией 10 - 20 г/л с образованием целевого продукта андрост-4-ен-3,17-диона в концентрации до 7 - 9 г/л соответственно.

Использование штамма Mycobacterium smegmatis ВКПМ Ас-1552 может быть проиллюстрировано следующим примером.

Пример 1. Культуру Mycobacterium smegmatis в 6-дневном возрасте, выросшую на агаровой среде следующего состава (в г/л): глюкоза - 10, соевая мука - 3, лимонная кислота - 2,2, мочевина - 0,5, дигидрофосфат калия - 0,5, хлорид аммония - 1, сульфат магния - 0,5, сульфат железа - 0,05, агар-агар - 25, вода дистиллированная, pH до стерилизации - 6,8 - 7,0, переносят в 30 мл жидкой посевной среды в конические плоскодонные колбы вместимостью 250 мл. Состав посевной среды (г/л): глюкоза - 10, соевая мука - 3, мочевина - 0,5, лимонная кислота - 2,2, хлорид аммония - 1, дигидрофосфат калия -0,5, сульфат железа - 0,05, сульфат магния 0,5, карбонат кальция - 1,5, вода дистиллированная, pH до стерилизации 7,0. Инкубируют 48 часов на качалке при интенсивности перемешивания 220 об/мин (эксцентриситет 5 см) и температуре 30^oC.

Выращенную культуру вносят в количестве 10 об.% в среду следующего состава (г/л): глюкоза - 10, соевая мука - 10, мочевина - 0,5, гидрофосфат аммония - 1,5, лимонная кислота - 2,2, сульфат магния - 0,2, сульфат железа - 0,05, карбонат кальция - 1,5, вода дистиллированная, pH до стерилизации 7,0. Среду разливают в аналогичные колбы по 30 мл. До стерилизации в среду добавляют хорошо гомогенизированный холестерин в количестве 1% (концентрация 10 г/л). Ферментацию проводят на качалке в условиях, описанных для получения вегетативного посевного материала, в течение 96 + 4 ч.

По окончании ферментации (концентрация АД - 7,0 г/л по данным ВЭЖХ-анализа) культуральную жидкость отделяют от биомассы на центрифуге. Биомассу экстрагируют водным ацетоном (60 - 65% содержания). Растворитель упаривают в вакууме до прекращения погона. Из образовавшейся водной суспензии отфильтровывают технический целевой продукт. После перекристаллизации из хлористого метилена и гексана получают АД с выходом 70% и температурой плавления 172 - 174^oC.

Использование: биотехнология, а именно микробиологическое получение андрост-4-ен-3,17-диона. Предложенный новый штамм Mycobacterium smegmatis способен трансформировать стерины растительного и животного происхождения (например, ситостерин, холестерин) до андрост-4-ен-3,17-диона. Штамм Mycobacterium smegmatis депонирован в ВКПМ под номером ВКПМ Ас-1552. Штамм устойчив к стрептомицину, что позволяет использовать его без риска заражения среды посторонней микрофлорой. Штамм ВКПМ Ас-1552 обеспечивает получение целевого продукта в концентрации до 7-9 г/л.

Штамм бактерий Mycobacterium smegmatis ВКПМ Ас-1552, используемый для окисления стеринов растительного и животного происхождения до андрост-4-ен-3,17-диона.