СПОСОБ АНАЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР И ИХ КОМПОНЕНТОВ Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/04 G01F19/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу анализа клеточной структуры, которая включает вирусные морфологии.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В прошлом были предприняты многочисленные попытки классифицировать и анализировать клеточные структуры, которые включают вирусы и другие компоненты. Были разработаны способы анализа различных изображений с целью описать, сегментировать и классифицировать вирусы с использованием доступных технологий изображений. Например, была использована криоэлектронная микроскопия, но с ее помощью структуры клеток и вирусные частицы не могли быть показаны достаточно хорошо. Также было трудно объективно, многократно и достоверно описывать клеточные компоненты с тем, чтобы точно определить стадии созревания данных клеточных компонентов. Это частично объясняет, почему предшествующие способы анализа не были достаточно эффективными, и существует потребность в более эффективных способах анализа структур клетки и вирусных частиц.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ согласно настоящему изобретению обеспечивает решение вышеуказанных проблем. Более конкретно, способ согласно настоящему изобретению предназначен для анализа клеточных структур и их компонентов. Может быть предложена клеточная структура, которая содержит множество вирусных частиц. Первое изображение первой вирусной частицы и второе изображение второй вирусной частицы может быть получено с использованием технологии электронной микроскопии. Первая вирусная частица характеризуется как находящаяся на первой стадии созревания, а вторая вирусная частица - как находящаяся на второй стадии созревания. Первое и второе изображения преобразуют соответственно в первый и второй профили шкалы яркости на основе пиксельных данных или другой информации от изображений. Первый и второй профили шкалы яркости сохраняют соответственно в виде первой и второй матриц. Затем в третьем изображении может быть идентифицирована третья вирусная частица. Третье изображение преобразуют в третий профиль шкалы яркости. Третью шкалу яркости сравнивают с первой и второй матрицами для определения стадии созревания третьей вирусной частицы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг.1 представлено схематическое изображение клеточного ядра, содержащего вирусные частицы;

На Фиг.2А - микроскопическое изображение вирусной частицы на первой стадии созревания;

На Фиг.2В - схематическое изображение профиля шкалы яркости вирусной частицы, показанной на Фиг.2А;

На Фиг.3А - микроскопическое изображение вирусной частицы на второй стадии созревания;

На Фиг.3В - схематическое изображение профиля шкалы яркости вирусной частицы, показанной на Фиг.3А;

На Фиг.4А - микроскопическое изображение вирусной частицы на третьей стадии созревания;

На Фиг.4В - схематическое изображение профиля шкалы яркости вирусной частицы, показанной на Фиг.4А.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Со ссылкой на Фиг.1-4 способ согласно настоящему изобретению относится к стадиям анализа клеточных структур, которые включают такие компоненты, как вирусные частицы. Анализ вирусных частиц используют только в качестве иллюстративного примера способа согласно настоящему изобретению, и данное изобретение не ограничивается вирусными частицами. Любой подходящий компонент в структуре, такой как клетка, может быть проанализирован с помощью данного способа. Важным признаком настоящего изобретения является то, что разные вирусные частицы создают однозначно определяемые графики или профили уровня яркости.

Кроме того, различные вирусные частицы могут находиться на разных стадиях созревания, так что настоящий способ может быть использован не только для определения типов вирусных частиц, но и стадии созревания конкретной вирусной частицы.

В общем случае изображение 12 клеточной структуры 14 может быть сначала получено с помощью подходящей методики, такой как трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕМ). Данное изображение может включать вирусные частицы 16, которые находятся на разных стадиях созревания. Например, вирусные частицы могут быть классифицированы как находящиеся на трех или более стадиях созревания, включая пустые или совершенно незрелые вирусные частицы, как показано на Фиг.2А, промежуточные вирусные частицы, как показано на Фиг.3А, и более зрелые вирусные частицы, как показано на Фиг.4А.

Вирусные частицы 16 часто линейно деформированы, что делает их слегка похожими на эллипсы, а не на круги. Чтобы можно было сделать точный профиль радиальной плотности, желательно, чтобы вирусные частицы были радиально симметричными. Таким образом, деформация должна быть инвертирована с целью достижения лучших результатов при осуществлении анализа согласно настоящему изобретению. Это может быть осуществлено путем подгонки эллипса к вирусной частице, которая предположительно является приблизительно круглой. Главные радиусы и ориентация эллипса могут быть использованы для определения деформации и для того, чтобы осуществить обратную деформацию.

Каждое положение пикселя в предыдущем эллиптическом изображении затем преобразуют в новое изображение для создания картины, где структуры вирусных частиц являются округлыми. Все структуры вирусных частиц являются предпочтительно объектом для этой деформационной корректировки. Как описано ниже, радиально симметричная структура вирусной частицы может быть преобразована в профиль уровня яркости. Он может быть использован для описания структуры путем вычисления среднего уровня яркости на каждом расстоянии от центра, идущем из центра и по направлению к периферии или оболочке структуры вирусной частицы. Преобразование в округлые структуры является, в частности, полезным при измерении радиуса частицы и толщины стенки вирусной частицы.

Более конкретно, на Фиг.2А представлено изображение 20 относительно незрелой или пустой вирусной частицы 22 в клеточном ядре, а на Фиг.2В представлен ее соответствующий профиль уровня яркости 24 на графике 25. Можно также создать математический алгоритм для описания структуры вирусной частицы вместо использования профилей шкалы яркости. Вирусная ДНК может встраиваться в вирусную частицу 22, которая, в конечном счете, может развиться в зрелую вирусную частицу с плотной ДНК-сердцевиной, как показано на Фиг.4А и обсуждается ниже.

Вирусная частица 22 имеет радиус 26, который простирается из центра 28 радиально наружу к центру стенки оболочки 30 вирусной частицы. Поскольку вирусная частица 22 фактически не содержит вирусных компонентов, то центральная часть является почти белой, что проявляется в виде высокого значения уровня яркости профиля 24 на левой стороне графика 25. Оболочка 30 темнее, поэтому профиль 24 имеет постепенно снижающееся значение уровня яркости на правой стороне графика 25, поскольку область оболочки соответствует правой стороне графика 25.

На Фиг.3А представлено изображение 32 вирусной частицы 34, которая является не полностью зрелой. Вирусная частица 34 содержит дополнительный вирусный белок, который участвует в упаковке вирусной ДНК в вирусные частицы. Стенки вирусных частиц могут включать белковые слои, так что можно определить размер вирусной частицы и толщину этих слоев. На Фиг.3В представлен соответствующий профиль уровня яркости 36 на графике 38.

Вирусная частица 34 имеет радиус 48, который простирается из центра 50 к центру периферической оболочки 52 вирусной частицы. Черное или темное кольцо 40 показано как локальный минимум 42 в профиле 36, тогда как белое кольцо 44 показано как локальный максимум 46 в профиле 36. Начало и конец колец и стенки оболочки могут быть определены путем анализа второй производной профилей шкалы яркости.

Аналогично, на Фиг.4А представлено изображение 54 более зрелой вирусной частицы 56, а на Фиг.4В представлен соответствующий профиль уровня яркости 58 на графике 60. Вирусная частица 56 имеет радиус 62, который простирается из центра 64 к центру стенки периферической оболочки 66 вирусной частицы 56. Белое кольцо 68 показано как локальный максимум 70 в профиле 58.

Важной функциональной возможностью способа согласно настоящему изобретению является то, что он позволяет создавать матрицы на основе профилей шкалы яркости для объективного описания вирусных частиц. Матрицы могут быть созданы также с использованием математических способов. Например, матрица может быть основана на средней величине характеристик многих вирусных частиц, которые находятся на одинаковой стадии созревания. Матрицы могут быть затем сохранены в базе данных и позже извлечены, когда придет время анализировать и характеризовать новые изображения, содержащие вирусные частицы. Когда будут получены тысячи изображений, тогда матрицы могут быть использованы для определения количества вирусных частиц на различных стадиях созревания. Таким образом, продуцирование вируса в клетке может быть количественно определено путем получения дополнительных ТЕМ-изображений.

В частности, профили уровня яркости матрицы промежуточных вирусных частиц могут быть созданы и использованы для идентификации этих частиц на электронных микрофотографиях. Для создания профиля яркости матрицы должна быть известна центральная точка вместе с приблизительным размером вирусной частицы. Приблизительный размер (радиус) в пикселях вирусной частицы может быть выведен на основании увеличения изображения и фактического истинного размера вирусной частицы, или он может быть обозначен на изображении. Центральная точка объекта может быть помечена вручную или обнаружена при совмещении матриц. Предпочтительно центральную точку автоматически выбирают в качестве центра эллипса после корректировки деформации. Как описано выше, профиль уровня яркости может быть визуализирован в виде профиля кривой, где пики на кривой представляют светлые кольцевые участки, а минимумы представляют темные кольцевые участки.

Ширина некоторых кольцевых деталей, таких как оболочка вирусной частицы, может давать информацию относительно степени покрытости вирусной частицы, когда данные измерения применяют к цитоплазматическим формам вирусных частиц. Проблема с измерением этой толщины непосредственно из изображения или профиля состоит в трудности определения, где вирусная частица начинается и заканчивается. Для решения этой проблемы может быть использована градиентная информация о профиле. Первый градиент измеряет, как уровни яркости изменяются вдоль кривой. Если уровни яркости движутся от темного к светлому вдоль профиля, то градиент будет иметь положительные значения, а если уровни яркости движутся от светлого к темному, то градиент будет иметь отрицательные значения. Если изменения нет вообще или если профиль имеет локальный максимум или минимум, то градиент будет равен 0. Поэтому толщина оболочки может быть описана как количество пикселей между локальным минимумом и локальным максимумом в градиенте. Это объективный способ измерения того, где оболочка начинается и заканчивается. Для того чтобы найти эти точки экстремума, вычисляют второй градиент (градиент градиентной кривой), поскольку локальный максимум или минимум будет равен нулю в градиентной кривой.

Таким образом, профили уровня яркости определяют для многих вирусных частиц. Полученные кривые профилей уровня яркости могут быть сглажены путем свертки со стандартной функцией Гаусса.

Поведение кривых в стенке вирусной частицы или оболочке вирусной частицы может быть изображено в виде впадины относительно линейного поведения, представляющего общую структуру вирусной частицы.

Производная функции достигает локального минимума в месте наиболее крутого спуска кривой, что означает начало стенки вирусной частицы. Локальный максимум наблюдается в месте наиболее крутого подъема кривой, что означает конец или наружную сторону стенки вирусной частицы. Положения этих локальных экстремумов определяют в виде переходов через нуль второй производной профиля, и расстояние между этими экстремумами служит в качестве показателя ширины стенки вирусной частицы.

Как обсуждалось выше, радиус вирусной частицы вычисляют как расстояние между центром вирусной частицы и центром стенки вирусной частицы. Центр стенки вирусной частицы может быть предсказан как минимальное значение в профиле, сглаженном при помощи Гаусса, которое представляет собой переход через нуль 1-го градиента сглаженной кривой.

Другой важной функциональной возможностью является то, что изображения могут быть получены снова в более позднее время, и новую статистику стадий созревания вирусных частиц можно сравнить с более ранней статистикой количества вирусных частиц на различных стадиях созревания. Это представляет особый интерес, когда вирусные частицы подвергались воздействию активного химического вещества, такого как подходящее фармацевтическое вещество, для лучшего понимания того, как данное вещество влияет на продуцирование вируса в вирусных частицах. Например, существующее или новое вещество может быть использовано для определения того, какая часть продуцирования вируса или какая стадия созревания подвергается влиянию или останавливается данным веществом. Если, например, вирус проходит через шесть стадий созревания и вирус отсутствует на четвертой стадии созревания, то можно сделать вывод, что данное фармацевтическое вещество препятствует созреванию вируса после четвертой стадии созревания. Способ также может быть использован для определения того, какая стадия созревания должна быть мишенью для воздействия нового фармацевтического средства.

Также можно идентифицировать новые различные морфологии вируса и описать, чем новый вирус отличается от более ранних идентифицированных морфологий вируса.

Другой функциональной возможностью способа согласно настоящему изобретению является то, что можно удалять определенные белки из вируса с использованием биотехнических способов, таких как siRNA (малые интерферирующие РНК), и затем объективно определять, как удаление белка или белков влияет на морфологию вируса и его соответствующий профиль шкалы яркости. Например, фармацевтическое вещество может быть разработано для предупреждения образования определенного белка в вирусной частице, и можно исследовать воздействие такого предупреждения на профиль шкалы яркости. Удаление определенного белка может предупреждать прохождение вируса из одной стадии созревания в более позднюю стадию созревания. Данный способ позволяет определить, какая стадия созревания подвергается воздействию при удалении конкретного белка.

Хотя настоящее изобретение было описано в соответствии с предпочтительными композициями и примерами осуществления, следует понимать, что в нем могут быть сделаны определенные замены и изменения без отклонения от сущности и объема следующей формулы изобретения.

Изобретение относится к области вирусологии. Предложен способ анализа изображения вирусных частиц, при котором получают с помощью технологии электронной микроскопии изображения вирусных частиц. Первую вирусную частицу характеризуют как находящуюся на первой стадии созревания, а вторую вирусную частицу - как находящуюся на второй стадии созревания. Первое изображение и второе изображение преобразуют соответственно в первый и второй профили шкалы яркости на основе пиксельных данных. Первый и второй профили шкалы яркости затем сохраняют соответственно в виде первой и второй матриц. Третью вирусную частицу идентифицируют в третьем изображении. Третье изображение преобразуют в третий профиль шкалы яркости. Третью шкалу яркости сравнивают с первой и второй матрицей для определения стадии созревания третьей вирусной частицы. 3 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Способ анализа вирусных частиц, при котором:
- берут множество вирусных частиц (16);
- делают первое изображение (20) первой вирусной частицы (22) и второе изображение (32) второй вирусной частицы (34);
- характеризуют первую вирусную частицу как находящуюся на первой стадии созревания, а вторую вирусную частицу как находящуюся во второй стадии созревания;
- преобразуют первое изображение (20) в первый профиль шкалы яркости (24);
- преобразуют второе изображение (32) во второй профиль шкалы яркости (36);
- сохраняют первый профиль шкалы яркости (24) в виде первой матрицы;
- сохраняют второй профиль шкалы яркости (36) в виде второй матрицы;
- идентифицируют третью вирусную частицу в третьем изображении;
- преобразуют третье изображение в третий профиль шкалы яркости;
- сравнивают третью шкалу яркости с первой и второй матрицами для определения стадии созревания третьей вирусной частицы и
- преобразуют вирусные частицы эллиптической формы в вирусные частицы округлой формы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно определяют начало и конец стенки вирусной частицы путем взятия производных профиля шкалы яркости (24, 36, 58).

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно определяют начало и конец белкового слоя путем взятия производных профиля шкалы яркости (24, 36, 58).

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно удаляют белок из вирусной частицы (24) и производят модифицированный профиль шкалы яркости.