СПОСОБЫ ОЧИСТКИ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСОВ Российский патент 2022 года по МПК C12N15/861 C12N7/02 

Родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США №62/417775, поданной 4 ноября 2016 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к материалам и способам очистки аденоассоциированного вируса (AAV).

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой небольшой вирус без оболочки, который упаковывает линейный одноцепочечный геном ДНК. AAV принадлежит к семейству Parvoviridae и роду Dependovirus, поскольку продуктивное заражение AAV происходит только в присутствии вируса-помощника, такого как, например, аденовирус или вирус герпеса. Даже в отсутствие вируса-помощника AAV (серотип 2) может достигать латентности путем интеграции в хромосому 19q13.4 генома человека-хозяина. Это единственный ДНК-вирус млекопитающих, о котором известно, что он способен к сайт-специфической интеграции (Daya and Berns, Clinical Microbiology Reviews, страницы 583-593 (2008)).

Для безопасного применения AAV в клинике AAV был генетически модифицирован в нескольких местах в его геноме. Например, ген Rep, который необходим для репликации вируса, и элемент, необходимый для сайт-специфической интеграции, были удалены из генома AAV во многих вирусных векторах. Эти рекомбинантные AAV (rAAV) существуют во внехромосомном состоянии и характеризуются очень низкой эффективностью интеграции в геномную ДНК. Таким образом, вероятность возникновения случайного мутагенеза в клетке-хозяине с помощью rAAV снижается, если не устраняется полностью. Из-за этих свойств и отсутствия патогенности rAAV показал большой потенциал в качестве вектора для генной терапии во многих аспектах доклинических и клинических применений. В клинике проходят испытания новые серотипы и самокомплементарные векторы. Наряду с этими постоянными разработками векторов, продолжающиеся усилия были сосредоточены на масштабных производственных процессах, которые могут эффективно производить большие количества титров векторов rAAV с высокой чистотой и эффективностью.

Хотя усилия по разработке эффективных, крупномасштабных способов очистки продукта AAV, подходящего для введения человеку, были значительными, все еще остается потребность в более эффективных способах очистки AAV. Например, современные способы получения AAV в культуре клеток приводят к образованию «пустых» капсидов, которые, как было показано, приводят к опосредованным Т-клетками иммунным ответам против капсидного антигена, что приводит к низкой степени гепатотоксичности и частичной потере экспрессии (Wright, Molec Therapy 22(1): 1-2 (2014)). Поэтому необходимы способы очистки AAV, которые предусматривают стадии удаления пустых капсидов AAV из конечного продукта AAV.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Особенностью получения вектора AAV в клеточной культуре является образование избытка «пустых» капсидов, в которых отсутствует геном вектора. Такие пустые капсиды не способны обеспечить терапевтическую пользу, связанную с производством трансгена. Влияние пустых капсидов на клинический исход неясно. Тем не менее, существует потенциал для усиления врожденных или адаптивных иммунных ответов на вектор, что затем вызывает проблемы пустых капсидов в контексте генной терапии. Wright, Molecular Therapy 22: 1-2 (2014).

В настоящем документе представлены способы получения продукта аденоассоциированного вируса (AAV), способы очистки AAV и способы очистки полных капсидов AAV из концентрированной фракции AAV, содержащей пустые капсиды AAV и полные капсиды AAV. Способы по настоящему изобретению являются преимущественными по сравнению с известными в настоящей области техники, поскольку способы, предоставленные в настоящем документе, подходят для крупномасштабного производства AAV и обеспечивают высокочистый, эффективный продукт, подходящий для клинического применения. Согласно иллюстративным аспектам описанные в настоящем документе способы обеспечивают продукт AAV, содержащий частицы AAV гомогенной популяции и высокой чистоты. Согласно иллюстративным аспектам описанные в настоящем документе способы обеспечивают продукт AAV, содержащий полноразмерную векторную ДНК. Согласно иллюстративным вариантам осуществления описанные в настоящем документе способы обеспечивают продукт AAV, который по существу не содержит нежелательных загрязнений, включая в себя, без ограничения, пустые частицы AAV (включая в себя содержащие усеченную или неполную векторную ДНК), частицы AAV с неполной белковой композицией и олигомеризованные структуры или контаминирующие вирусы, например, не AAV вирусы с липидной оболочкой. Согласно иллюстративным вариантам осуществления описанные в настоящем документе способы обеспечивают продукт AAV, содержащий большое количество ДНК (кДНК), кодирующей представляющий интерес белок.

Согласно иллюстративным вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают стадию ультрацентрифугирования для отделения полных капсидов AAV от пустых капсидов AAV. Согласно иллюстративным аспектам способы предусматривают (i) загрузку в ротор концентрированной фракции AAV по меньшей мере с двумя растворами сахара, каждый из которых характеризуется различной концентрацией сахара, (ii) работу ультрацентрифуги, содержащей загруженный ротор, в периодическом режиме для образования градиента сахара и (iii) получение фракции градиента сахара для получения фракции AAV, содержащей полные капсиды AAV. Согласно иллюстративным аспектам ротор представляет собой зональный ротор.

Согласно иллюстративным аспектам каждый по меньшей мере из двух растворов сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 45% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно иллюстративным аспектам один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, а другой раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы. Необязательно, существует другой раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 47% (в массовом отношении) до приблизительно 53% (в массовом отношении) сахарозы. При загрузке на дно ротора или отсека порядок загрузки может быть таким: сначала раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 47% (в массовом отношении) до приблизительно 53% (в массовом отношении) сахарозы, если присутствует, затем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, и затем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно определенным вариантам осуществления обрабатываемый образец добавляют перед добавлением растворов сахара. Согласно некоторым вариантам осуществления ультрацентрифугирование проводят в режиме непрерывного потока, и образец загружают после достижения градиента плотности во время центрифугирования.

Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают стадию ультрацентрифугирования для отделения полных капсидов AAV от пустых капсидов AAV. Согласно иллюстративным аспектам способы предусматривают (i) загрузку в ротор концентрированной фракции AAV по меньшей мере с двумя растворами сахара, каждый из которых характеризуется различной концентрацией сахара и каждый из которых содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 45% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы, (ii) работу ультрацентрифуги, содержащей загруженный ротор, в периодическом режиме для образования градиента сахара и (iii) получение доли градиента сахара для получения фракции AAV, причем по меньшей мере или приблизительно 60% частиц AAV во фракции AAV представляют собой полные капсиды AAV. Согласно иллюстративным аспектам ротор представляет собой зональный ротор. Согласно определенным вариантам осуществления объем растворов сахара больше или составляет приблизительно 50% объема зонального ротора. Согласно некоторым вариантам осуществления общий объем растворов сахара и фракции AAV меньше или равен объему зонального ротора. Согласно некоторым вариантам осуществления отношение объема растворов сахара к объему фракции AAV меньше или равно единице.

Согласно определенным вариантам осуществления каждый раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 50% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 55% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере один из растворов сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, превышающей приблизительно 50% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере один из растворов сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, превышающей приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере один из растворов сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 60% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно некоторым вариантам осуществления один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, причем второй раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы, и, необязательно, причем третий раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 47% (в массовом отношении) до приблизительно 53% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно определенным аспектам два раствора сахара загружают в зональный ротор. Согласно определенным вариантам осуществления два раствора сахара загружают в зональный ротор, причем один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, и второй раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно определенным аспектам в зональный ротор загружают по меньшей мере три раствора сахара. Согласно определенным вариантам осуществления в зональный ротор загружают три раствора сахара. Согласно определенным вариантам осуществления в зональный ротор загружают три раствора сахара, причем один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 47% (в массовом отношении) до приблизительно 53% (в массовом отношении) сахарозы, второй раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, и третий раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрация сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно некоторым вариантам осуществления концентрированную фракцию AAV загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, и причем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно определенным вариантам осуществления концентрированную фракцию AAV загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 47% (в массовом отношении) до приблизительно 53% (в массовом отношении) сахарозы, причем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 47% (в массовом отношении) до приблизительно 53% (в массовом отношении) сахарозы, загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, и причем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно определенным вариантам осуществления каждый раствор сахара загружают в зональный ротор в равных объемах. Согласно некоторым вариантам осуществления раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, который в два раза превышает объем по меньшей мере одного из других растворов сахара в зональном роторе. Согласно определенным вариантам осуществления раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, который по меньшей мере равен объему всех других растворов сахара, объединенных в зональном роторе. Согласно некоторым вариантам осуществления раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, который по меньшей мере вдвое превышает объем раствора сахара с наибольшей концентрацией сахара, причем объем раствора сахара с наибольшей концентрация сахара равен объему раствора сахара с промежуточной концентрацией сахара. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере два раствора сахара загружают в зональный ротор, причем раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, который по меньшей мере вдвое превышает объем по меньшей мере одного другого раствора сахара в зональном роторе. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере два раствора сахара загружают в зональный ротор, причем раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, равном объему по меньшей мере одному другому раствору сахара в зональном роторе. Согласно некоторым вариантам осуществления раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, который составляет половину объема концентрированной фракции AAV. Согласно определенным вариантам осуществления отношение объема общего градиента сахара к объему фракции AAV, загруженной в зональный ротор, составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:5.

Согласно некоторым аспектам фракция AAV содержит буферный раствор. Согласно некоторым вариантам осуществления буферный раствор включает в себя, без ограничения, фосфатные буферы, гистидин (например, L-гистидин), цитрат натрия, HEPES, трис, бицин, глицин, N-глицилглицин, ацетат натрия, карбонат натрия, глицилглицин, лизин, аргинин, фосфат натрия и их смеси. Согласно определенным вариантам осуществления фракция AAV включает в себя трис-HCl и NaCl. Согласно определенным вариантам осуществления концентрация трис-HCl составляет от приблизительно 20 до приблизительно 50 мМ, а концентрация NaCl составляет от приблизительно 150 до приблизительно 900 мМ. Согласно определенным вариантам осуществления NaCl находится в концентрации от приблизительно 500 мМ до приблизительно 750 мМ. Согласно определенным вариантам осуществления буферный раствор характеризуется рН от приблизительно 7,4 до приблизительно 9,0. Согласно некоторым вариантам осуществления буфер содержит приблизительно 50 мМ трис-HCl и приблизительно 500 мМ NaCl с рН 8,5. Согласно некоторым вариантам осуществления буфер содержит приблизительно 50 мМ трис-HCl и приблизительно 750 мМ NaCl с рН 8,0. Согласно определенным вариантам осуществления буферный раствор содержит 45-55% (в массовом отношении) этиленгликоля.

Согласно определенным вариантам осуществления каждый раствор сахара содержит дисахарид или трисахарид. Согласно определенным вариантам осуществления дисахарид содержит сахарозу, мальтозу, лактозу и их комбинации. Согласно определенным вариантам осуществления каждый раствор сахара содержит сахарозу. Согласно определенным вариантам осуществления каждый из растворов сахара дополнительно содержит трис-HCl и NaCl. Согласно определенным вариантам осуществления концентрация трис-HCl составляет от приблизительно 20 до приблизительно 50 мМ, а концентрация NaCl составляет от приблизительно 150 до приблизительно 500 мМ. Согласно определенным вариантам осуществления буферный раствор характеризуется рН от приблизительно 7,4 до приблизительно 8,5. Согласно некоторым вариантам осуществления буфер содержит 20 мМ трис-HCl и 8 г/л NaCl с рН 7,4.

Согласно определенным аспектам способы предусматривают работу ультрацентрифуги на первой скорости вращения менее чем 10000 об/мин в течение менее чем 60 минут и на второй скорости вращения в диапазоне от приблизительно 30000 до приблизительно 40000 об/мин в течение по меньшей мере 4 часов.

Согласно некоторым аспектам способы предусматривают работу ультрацентрифуги на первой скорости вращения менее чем 10000 об/мин в течение менее чем 60 минут и на второй скорости вращения в диапазоне от приблизительно 30000 до приблизительно 40000 об/мин в течение по меньшей мере 12 часов.

Согласно определенным вариантам осуществления первая скорость вращения составляет от приблизительно 3000 до приблизительно 6000 об/мин, необязательно, приблизительно 4000 об/мин. Согласно некоторым вариантам осуществления вторая скорость вращения составляет приблизительно 35000 об/мин и, необязательно, поддерживается в течение от приблизительно 4 до приблизительно 6 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления вторая скорость вращения поддерживается в течение по меньшей мере приблизительно 16 часов или по меньшей мере 20 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления вторая скорость вращения составляет приблизительно 35000 об/мин и, необязательно, поддерживается в течение от приблизительно 16 до приблизительно 20 часов.

Согласно определенным вариантам осуществления концентрированная фракция AAV, загруженная в зональный ротор, содержит по меньшей мере 1×10¹² капсидов AAV на мл. Согласно некоторым вариантам осуществления способы предусматривают сбор супернатанта из клеточной культуры, содержащей клетки HEK293, трансфицированные тройной плазмидной системой. Согласно определенным вариантам осуществления способы предусматривают (i) сбор супернатанта через приблизительно от 3 до 5 дней после трансфекции клеток HEK293 или (ii) когда клеточная культура характеризуется плотность клеток более чем или приблизительно 5×10⁶ клеток/мл и характеризуется жизнеспособностью клеток более чем 50%. Согласно определенным вариантам осуществления способы предусматривают фильтрацию собранного супернатанта с помощью глубинной фильтрации. Согласно некоторым вариантам осуществления способы предусматривают фильтрацию собранного супернатанта через фильтр, содержащий целлюлозу и перлит и характеризующийся минимальной проницаемостью приблизительно 500 л/м². Согласно определенным вариантам осуществления способы предусматривают фильтрацию собранного супернатанта через фильтр с минимальным размером пор приблизительно 0,2 мкм. Согласно определенным вариантам осуществления способы предусматривают концентрирование фракции AAV с использованием системы ультра/диафильтрации. Согласно некоторым вариантам осуществления способы предусматривают концентрирование фракции AAV с использованием системы ультра/диафильтрации до, после или до и после стадии, предусматривающей внесение фракции AAV в колонку для анионообменной (АЕХ) хроматографии в условиях, которые позволяют протекать AAV через хроматографическую колонку АЕХ. Согласно определенным вариантам осуществления способы предусматривают инактивацию вирусов с липидной оболочкой фракции AAV с помощью растворителя-детергента. Согласно определенным вариантам осуществления способы предусматривают нанофильтрацию фракции AAV для удаления вирусов размером более 35 нм. Согласно некоторым вариантам осуществления способы предусматривают стадию завершающей хроматографической очистки, предусматривающую проведение АЕХ-хроматографии с колонкой, содержащей гель типа «щупальца».

Согласно некоторым вариантам осуществления способы предусматривают (i) внесение фракции AAV в колонку для анионообменной (АЕХ) хроматографии в условиях, которые позволяют AAV протекать через хроматографическую колонку АЕХ, и (ii) сбор проточного материала, содержащего AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления фракцию AAV вносят в хроматографическую колонку АЕХ с загрузочным буфером, содержащим от приблизительно 100 мМ до приблизительно 150 мМ NaCl, необязательно, причем рН загрузочного буфера составляет от приблизительно 8 до приблизительно 9. Согласно определенным вариантам осуществления загрузочный буфер содержит от приблизительно 115 до приблизительно 130 мМ NaCl, необязательно, загрузочный буфер содержит от приблизительно 120 до приблизительно 125 мМ NaCl.

Согласно определенным вариантам осуществления белки клетки-хозяина удаляются. Согласно определенным вариантам осуществления белки клетки-хозяина представляют собой HSP70 и/или LDH.

Согласно иллюстративным аспектам по меньшей мере или приблизительно 55% частиц AAV во фракции, полученной из градиента сахара, представляют собой полные капсиды AAV. Согласно иллюстративным аспектам более чем или приблизительно 60% частиц AAV во фракции, полученной из градиента сахара, представляют собой полные капсиды AAV. Согласно иллюстративным аспектам более чем или приблизительно 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% частиц AAV во фракции, полученной из градиента сахара, представляют собой полные капсиды AAV.

Согласно определенным вариантам осуществления способы предусматривают исследование фракции AAV с помощью AAV-специфического ИФА. Согласно определенным вариантам осуществления AAV-специфический ИФА представляет собой сэндвич-ИФА, специфический для AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способы не предусматривают стадию измерения активности с помощью количественной ПЦР.

Согласно определенным вариантам осуществления AAV представляет собой AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 или AAV10. Согласно определенным вариантам осуществления AAV представляет собой AAV8.

В настоящем документе также представлены продукты AAV, полученные способами, описанными выше и в настоящем документе.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой схему иллюстративного способа настоящего раскрытия.

Фиг. 2 представляет собой график количества вирусных частиц (граммов вируса) на мл супернатанта культуры трансфицированных клеток, нанесенных на график в течение определенного периода времени (дни). Увеличение количества AAV8 в клеточных культурах HEK293 в установленных стандартных условиях (например, рН, температура, скорость перемешивания) в масштабе 2 л (4 параллельных прогона с двумя разными партиями PEI): увеличение титра в супернатанте клеточной культуры с течением времени, измеренное с помощью специфической для FIX кПЦР (Т01 = 1 день трансфекции, Т02 = 2 день трансфекции и т.д.). Титр измеряли с помощью FIX-специфической кПЦР в биореакторах масштаба 3×2 л.

Фиг. 3 представляет собой график количества вирусных частиц (граммов вируса) на мл супернатанта культуры трансфицированных клеток, нанесенных на график в течение времени (дни). Увеличение количества AAV8 в клеточных культурах HEK293 в установленных стандартных условиях (например, рН, температура, скорость перемешивания) в масштабе 2 л (4 параллельных цикла с двумя разными партиями PEI): увеличение титра в супернатанте клеточной культуры с течением времени, измеренное с помощью AAV-специфического ИФА (Т01 = 1 день трансфекции, Т02 = 2 день трансфекции и т.д.). Титр векторного генома измеряли с помощью AAV-специфического ИФА в биореакторах масштаба 3×2 л.

Фиг. 4 представляет собой график давления и скорости потока на стадии глубинной фильтрации, измеренных непрерывно с помощью двух датчиков давления (давление 1 до глубинной фильтрации, давление 2 до мембранного фильтра после глубинного фильтра; поток = скорость потока, измеренная с помощью расходомера).

Фиг. 5 представляет собой график протекания продукта хроматографии на АЕХ Mustang Q в отрицательном (не связывающем) режиме.

Фиг. 6 представляет собой окрашивание серебром (слева) и вестерн-блот (справа) указанных фракций.

Фиг. 7 представляет собой окрашивание серебром (слева) и вестерн-блот (справа) указанных фракций.

Фиг. 8 представляет собой график ультрацентрифугирования профиля элюирования, отделяющего пустые капсиды от полных. Каждая фракция составляла 50 мл.

Фиг. 9 представляет собой окрашивание серебром (слева) и вестерн-блот (справа) указанных фракций.

Фиг. 10 представляет собой завершающую очистку AAV8 на Fractogel ТМАЕ.

Фиг. 11 представляет собой схему иллюстративного способа настоящего раскрытия.

Фиг. 12 представляет собой кривую, показывающую ультрацентрифугирование разделенных полных и пустых частиц AAV8 с использованием протокола 50-55-60% в водном растворе, включая в себя частицы, содержащие различные варианты последовательности ДНК. VectorDNA представляет собой человеческий фактор свертывания крови IX Падуя, двухцепочечный, полная длина приблизительно 4,8 т.п.н. Отдельные фракции, как указано в профиле UC, обрабатывали в колонке АЕХ-ТМАЕ объемом 4 мл и составляли для получения конечного продукта. Каждую из составленных фракций анализировали. Фракции с 10 по 14 объединяли и они представляют собой гомологичный конечный продукт, который содержит AAV8 с полноразмерной векторной ДНК. Фракции с 15 по 21 и дополнительно фракции 25 и 26 обрабатывают отдельно и показывают уменьшающуюся длину векторной ДНК, инкапсулированной в частицах AAV8. Это показано в гелях xDNA-Agarose на фиг. 14 и 15 и в данных аналитического ультрацентрифугирования (AUC), показанных на фиг. 16.

Фиг. 13 представляет собой окрашивание серебром (слева) и вестерн-блот (справа) указанных фракций.

Фиг. 14 представляет собой фотографию 1% агарозного геля следующих образцов, взятых из ультрацентрифугирования частиц AAV8, описанных в примере 9: дорожка 1 = маркер; дорожка 2 = PV007 (AAV8, полученный из исходного процесса Chatham); дорожка 3 = фракция 15; дорожка 4 = фракция 16; дорожка 5 = фракция 17; дорожка 6 = фракция 18; дорожка 7 = фракция 19; дорожка 8 = фракция 20; дорожка 9 = фракция 21; дорожка 10 = фракция 25; дорожка 11 = фракция 26; дорожка 12 = продукт AAV8 для клинического применения и дорожка 13 = маркер. BDS = нерасфасованное лекарственное вещество (конечный разведенный ТМАЕ-элюат). На этой фигуре показано, что объединенные фракции 10-14 пика УФ, полученные при более высокой плотности сахарозы при ультрацентрифугировании, содержат высокочистую одиночную полосу ДНК без какого-либо дополнительного указания на меньшие варианты ДНК векторной ДНК.

Фиг. 15 представляет собой фотографию 0,8% щелочного агарозного геля следующих образцов, взятых из ультрацентрифугирования частиц AAV8, описанных в примере 9: дорожка 1 = маркер; дорожка 2 = PV007 (AAV8, полученный из предыдущих производственных процессов); дорожка 3 = фракция 15; дорожка 4 = фракция 16; дорожка 5 = фракция 17; дорожка 6 = фракция 18; дорожка 7 = фракция 19; дорожка 8 = фракция 20; дорожка 9 = фракция 21; дорожка 10 = фракция 25; дорожка 11 = фракция 26; дорожка 12 = продукт AAV8 для клинического применения и дорожка 13 = маркер. BDS = объем лекарственного вещества (конечный разведенный ТМАЕ-элюат). На этой фигуре показано, что объединенные фракции 10-14 пика УФ, полученные при более высокой плотности сахарозы при ультрацентрифугировании, содержат высокочистую одиночную полосу ДНК без какого-либо дополнительного указания на меньшие варианты ДНК векторной ДНК.

Фиг. 16А-16В представляет собой профили элюирования Fractogel ТМАЕ, полученные из указанных фракций аналитического ультрацентрифугирования (AUC) в качестве исходного материала. Полные и пустые капсиды отмечены стрелками. Также идентифицирована субпопуляция капсидов, содержащих неполную векторную ДНК (также определенную в настоящем документе как пустая). Данные также представлены в таблице 17. Смотрите фиг. 12 относительно фракций.

Фиг. 17 представляет собой график профиля элюирования ультрацентрифугированием, в котором AAV8 в 50% (в массовом отношении) забуференном растворе этиленгликоля в Трис/NaCl ультрацентрифугируют в течение 20 часов при 35000 об/мин при использовании градиента сахарозы с растворами сахарозы 55% и 60%. Отношение загрузки образца AAV8 к градиенту сахарозы составляет 1:1. ДНК-вектор представляет собой человеческий фактор свертывания крови IX Падуя, одноцепочечный, самокомплементарный, полноразмерный (2,6 т.п.н.).

Фиг. 18 представляет собой график разделения AAV8, содержащего одноцепочечную векторную ДНК человеческого фактора свертывания крови IX Падуя (2,6 т.п.н.), с использованием ультрацентрифугирования с протоколом слоя сахара 55-60%, где образец AAV8 загружают в 50% (в массовом отношении) забуференный раствор этиленгликоля в трис/NaCl. Каждую фракцию исследуют с помощью: кПЦР ITR AAV8, антигена AAV8, WAX (слабый анионит - полные капсиды), соотношение ДНК/AAV представляет собой соотношение геномов вектора кПЦР ITR (мкг/мл)/антигена капсидного антигена AAV8 (сП/мл). Данные нормировали, чтобы графики могли быть представлены на одних и тех же осях.

Фиг. 19 представляет собой график профиля элюирования ультрацентрифугированием, в котором AAV8 в 50% (в массовом отношении) этиленгликоле в трис/NaCl-буфере ультрацентрифугируют в течение 20 часов при 35000 об/мин в градиенте растворов сахарозы 55% и 60%. Отношение загружаемого образца AAV8 к градиенту сахарозы составляет 1:1 с объемом сердечника 3200 мл. ДНК-вектор представляет собой фактор VIII свертывания человека, полноразмерный (~4,8 т.п.н.).

Фиг. 20 представляет собой наложение графиков коэффициентов седиментации из фракций 8-10 (смотрите фиг. 19), демонстрирующих разделение подвидов. Стрелка обозначает сдвиг в сторону AAV8 с меньшей массой от фракций с более высокой плотностью к меньшей плотности в UC-градиенте. Фракция 8 > фракция 9 > фракция 10.

Фиг. 21 представляет собой график разделения AAV8, содержащего одноцепочечную векторную ДНК человеческого фактора свертывания крови IX Падуя (2,6 т.п.н.), с использованием ультрацентрифугирования с протоколом слоя сахара 50-55-60%), где образец AAV8 загружают в забуференный трис-HCl/NaCl раствор. Каждую фракцию исследуют с помощью: кПЦР ITR AAV8 и ИФА. Отношение ДНК/AAV представляет собой отношение геномов вектора кПЦР ITR (vg/мл) к капсидному антигену AAV8 ИФА (ср/мл). Данные нормировали, чтобы графики могли быть представлены на одних и тех же осях.

Фиг. 22 представляет собой график профиля элюирования ультрацентрифугированием, в котором AAV8 в 50% (в массовом отношении) этиленгликоле в трис/NaCl-буфере ультрацентрифугируют в течение 20 часов при 35000 об/мин в градиенте сахарозы растворов сахарозы 55% и 60%. Отношение загружаемого образца AAV8 к градиенту сахарозы составляет 1:1 с объемом сердечника 7700 мл. Векторная ДНК представляет собой человеческий фактор свертывания крови IX Падуя, одноцепочечный самокомплементарный, полноразмерный (~2,6 т.п.н.).

Подробное описание настоящего изобретения

В настоящем документе предусмотрены способы получения продукта аденоассоциированного вируса (AAV), способы очистки AAV и способы очистки полных капсидов AAV из концентрированной фракции AAV, содержащей пустые капсиды AAV и полные капсиды AAV.

Преимущественно способы масштабируются до больших объемов исходного материала, например, клеточной культуры. Согласно определенным вариантам осуществления способы представленные в настоящем документе представляют собой крупномасштабные способы, способные очищать AAV из объемов по меньшей мере или приблизительно 150 л, по меньшей мере или приблизительно 250 л, по меньшей мере или приблизительно 500 л, по меньшей мере или приблизительно 600 л, по меньшей мере или приблизительно 700 л, по меньшей мере или приблизительно 800 л, по меньшей мере или приблизительно 900 л или по меньшей мере или приблизительно 1000 л. Согласно некоторым вариантам осуществления способы масштабируются до минимального объема исходного материала (например, клеточной культуры), равного по меньшей мере или приблизительно 1250 л, по меньшей мере или приблизительно 1500 л, по меньшей мере или приблизительно 2000 л, по меньшей мере или приблизительно 2500 л, по меньшей мере или приблизительно 3000 л, по меньшей мере или приблизительно 4000 л, по меньшей мере или приблизительно 5000 л, по меньшей мере или приблизительно 6000 л, по меньшей мере или приблизительно 7000 л, по меньшей мере или приблизительно 8000 л, по меньшей мере или приблизительно 9000 л, по меньшей мере или приблизительно 10000 л или более. Например, способы осуществляются с минимальным объемом приблизительно 1000 л или приблизительно 10000 л или 25000 л или более клеточной культуры, производящей AAV.

Описанные в настоящем документе способы получения и очистки AAV также являются предпочтительными, поскольку способы приводят к получению AAV с высоким титром. Согласно некоторым вариантам осуществления продукт AAV, содержащий по меньшей мере приблизительно 10¹⁰ вирусных частиц (vp), получают из приблизительно 1000 л исходного материала (например, клеточной культуры). Согласно некоторым вариантам осуществления продукт AAV, содержащий по меньшей мере приблизительно 10¹¹ вирусных частиц (vp), получают из приблизительно 1000 л исходного материала (например, клеточной культуры). Согласно некоторым вариантам осуществления продукт AAV, содержащий по меньшей мере приблизительно 10¹² вирусных частиц (vp), получают из приблизительно 1000 л исходного материала (например, клеточной культуры). Согласно некоторым вариантам осуществления продукт AAV, содержащий по меньшей мере приблизительно 10¹³ вирусных частиц (vp), получают из приблизительно 1000 л исходного материала (например, клеточной культуры). Согласно некоторым вариантам осуществления продукт AAV, содержащий по меньшей мере приблизительно 10¹⁴ вирусных частиц (vp), получают из приблизительно 1000 л исходного материала (например, клеточной культуры). Согласно некоторым вариантам осуществления продукт AAV, содержащий по меньшей мере приблизительно 10¹⁵ вирусных частиц (vp), получают из приблизительно 1000 л исходного материала (например, клеточной культуры). Согласно некоторым вариантам осуществления продукт AAV, содержащий по меньшей мере приблизительно 2×10¹⁵ вирусных частиц (vp), получают из приблизительно 1000 л исходного материала (например, клеточной культуры). Согласно некоторым вариантам осуществления продукт AAV, содержащий по меньшей мере приблизительно 5×10¹⁵ вирусных частиц (vp), получают из приблизительно 1000 л исходного материала (например, клеточной культуры).

Способы по настоящему раскрытию, которые обеспечивают высокие выходы AAV, предусматривают согласно некоторым вариантам осуществления стадию нанофильтрации для удаления вирусов, превышающих спецификацию исключения фильтра, используемого на этапе нанофильтрации. Эта стадия фильтрации позволяет сделать конечный продукт AAV более безопасным для введения человеку, по сравнению с теми продуктами AAV, которые получены другими способами. Стадия нанофильтрации представляет собой эффективную стадию снижения количества вирусов, превышающих спецификацию исключения фильтра, используемого на стадии нанофильтрации, что согласно некоторым вариантам осуществления означает, что способ способен удалять более 4 логарифмов загрязняющих вирусов из продукта AAV посредством нанофильтрации, как дополнительно описано в настоящем документе.

Другое преимущество описанных в настоящем документе способов заключается в том, что эти способы дают высокочистый продукт AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления продукт AAV, полученный способами по настоящему изобретению, по существу не содержит одного или нескольких загрязняющих веществ: белков клетки-хозяина, нуклеиновых кислот клетки-хозяина (например, ДНК клетки-хозяина), плазмидной ДНК, пустых вирусных векторов (включая в себя содержащих усеченную или неполную векторную ДНК), частицы AAV с неполной белковой композицией и олигомеризованные структуры или заражающие вирусы, например, не AAV вирусы с липидной оболочкой, белок теплового шока 70 (HSP70), лактатдегидрогеназу (LDH), протеасомы, загрязняющие не AAV вирусы (например, вирусы с липидной оболочкой), компоненты культуры клеток-хозяев (например, пептиды, антибиотики), компоненты, связанные с процессом (например, 0,3% три-н-бутилфосфат; 1,0% Triton Х100, полиэтиленимин), микоплазму, пирогены, бактериальные эндотоксины и случайные средства. Продукты AAV могут быть определены как практически свободные, если они кажутся свободными от примесей, что определяется стандартными способами анализа, такими как, без ограничения, тонкослойная хроматография (ТСХ), гель-электрофорез и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), иммуноферментный анализ (ИФА) или кПЦР ITR, используемыми специалистами в настоящей области техники для оценки такой чистоты, или достаточно чистые, чтобы дальнейшая очистка не обнаруживала видимых изменений физических и химических свойств, таких как ферментативная и биологическая активность вещества. Согласно одному варианту осуществления термин «по существу не содержит примесей» охватывает препараты AAV, содержащие менее чем приблизительно 50% (по сухой массе), 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% неполного капсидного материала AAV. Согласно другому варианту осуществления термин «по существу не содержит примесей» охватывает препараты AAV, в которых примесь составляет менее чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% или составляет столько от объема продукта AAV.

Согласно иллюстративным вариантам осуществления способы по настоящему изобретению обеспечивают очищенный продукт AAV, в котором удаляется по меньшей мере или приблизительно 50% загрязнителя, обнаруженного в исходном материале (например, клеточной культуре). Согласно иллюстративным вариантам осуществления способы по настоящему изобретению обеспечивают очищенный продукт AAV, в котором удаляется по меньшей мере или приблизительно 60% загрязнителя, обнаруженного в исходном материале (например, клеточной культуре). Согласно иллюстративным вариантам осуществления способы по настоящему изобретению обеспечивают очищенный продукт AAV, в котором удаляется по меньшей мере или приблизительно 70% загрязнителя, обнаруженного в исходном материале (например, клеточной культуре). Согласно иллюстративным вариантам осуществления способы по настоящему изобретению обеспечивают очищенный продукт AAV, в котором удаляется по меньшей мере или приблизительно 80% загрязнителя, обнаруженного в исходном материале (например, клеточной культуре). Согласно иллюстративным вариантам осуществления способы по настоящему изобретению обеспечивают очищенный продукт AAV, в котором удаляется по меньшей мере или приблизительно 90% загрязнителя, обнаруженного в исходном материале (например, клеточной культуре).

Согласно определенным вариантам осуществления продукт AAV, полученный способами по настоящему изобретению, подходит для введения человеку. Согласно определенным вариантам осуществления AAV представляет собой рекомбинантный AAV (rAAV). Согласно определенным вариантам осуществления продукт AAV, полученный способами по настоящему изобретению, является стерильным и/или класса надлежащей производственной практики (GMP). Согласно некоторым вариантам осуществления продукт AAV, полученный с помощью способов настоящего раскрытия, соответствует требованиям, изложенным в главе 1046 Фармакопеи США или Европейской фармакопее по лекарственным средствам для генной терапии, или как предписано Управлением по контролю за продуктами и лекарственными средствами США (USFDA) или Европейским агентством по лекарственным средствам (ЕМА).

Кроме того, продукты AAV, полученные способами, описанными в настоящем документе, являются высокоэффективными. Активность продукта AAV, например, продукта AAV8, может быть описана в терминах (1) биоактивность in vivo (например, производство активного белка у мышей), которая дана в единицах (FIX или FVIII) на мл плазмы мыши; или (2) биоактивность in vitro. Тест на биоактивность in vitro измеряет способность векторов AAV трансдуцировать клетки, например, клетки HepG2, которые экспрессируют и секретируют представляющий интерес белок в среду, и определяют количество с помощью способов ИФА и/или активности фермента. Подходящие способы измерения биоактивности in vivo и in vitro известны в настоящей области техники и также описаны в настоящем документе как пример 12.

Согласно другим вариантам осуществления продукт AAV, полученный с помощью описанных в настоящем документе способов, демонстрирует превосходное соотношение ДНК/AAV. Согласно иллюстративным вариантам осуществления продукт AAV, полученный с помощью описанных в настоящем документе способов, демонстрирует превосходное соотношение векторных геномов на мкг AAV, демонстрируя, что продукт AAV содержит большое количество полных вирусных частиц. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование фракции AAV с помощью AAV-специфического ИФА. Согласно некоторым вариантам осуществления AAV-специфический ИФА является достаточным для обеспечения репрезентативного считывания активности фракции AAV, потому что большинство капсидов во фракции AAV представляют собой полные капсиды.

Ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахара

Согласно иллюстративным вариантам осуществления способы по настоящему раскрытию содержат этап ультрацентрифугирования, в процессе которого образуется градиент плотности. Без желания быть связанными с теорией, полагают, что стадия ультрацентрифугирования позволяет отделить полные капсиды AAV от пустых капсидов AAV. Используемый в настоящем документе термин «полные капсиды AAV» в отношении AAV или капсидов AAV, или частиц AAV относится к тем, которые содержат полный векторный геном. Полные капсиды AAV могут обеспечить терапевтическую пользу пациентам-реципиентам. Используемый в настоящем документе термин «пустой» в отношении AAV или капсидов AAV, или частиц AAV относится к тем, у которых отсутствует целый (т.е. полный) векторный геном. Согласно некоторым вариантам осуществления «пустой» может также включать в себя «неполную векторную ДНК» или «усеченную векторную ДНК». Такие пустые AAV или пустые капсиды AAV, или пустые частицы AAV могут не иметь векторного генома частично или полностью, то есть они могут быть частично пустыми или полностью пустыми и, как таковые, не быть способными обеспечивать терапевтическую пользу.

Соответственно, настоящее раскрытие обеспечивает способ отделения полных капсидов AAV от пустых капсидов AAV или способ очистки полных капсидов AAV от концентрированной фракции AAV, содержащей полные капсиды AAV и пустые капсиды AAV. Согласно иллюстративным аспектам способы настоящего раскрытия предусматривают (i) загрузку в ротор фракции AAV (например, раствора, содержащего AAV) по меньшей мере с двумя растворами сахара, причем каждый раствор сахара характеризуется различной концентрацией сахара, (ii) работу ультрацентрифуги, содержащей загруженный ротор, в периодическом режиме для образования градиента сахара и (iii) получение фракции градиента сахара для получения фракции AAV, содержащей полные капсиды AAV. Согласно определенным вариантам осуществления загружают по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть растворов сахара. Согласно определенным вариантам осуществления загружают два раствора сахара. Согласно определенным вариантам осуществления загружают три раствора сахара.

Порядок загрузки может представлять собой сначала фракцию AAV (например, раствор, содержащий AAV), затем низшую концентрацию раствора сахара, затем следующий, более концентрированный раствор сахара и так далее.

Согласно иллюстративным аспектам способ предусматривает загрузку в ротор фракции AAV (например, раствора, содержащего AAV) по меньшей мере с двумя растворами сахара, причем каждый раствор сахара (а) содержит различную концентрацию сахара и (b) содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 45% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 50% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы или от приблизительно 55% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 52 до 58% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере другой раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 57 до 63% (в массовом отношении) сахарозы, и, необязательно, еще один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 47 до 53% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 54 до 56% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере другой раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 59 до 61% (в массовом отношении) сахарозы, и, необязательно, другой раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 49 до 51% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, превышающей приблизительно 54% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере другой раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, превышающей приблизительно 59% (в массовом отношении) сахарозы, и, необязательно, другой раствор сахара в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, превышающей приблизительно 49% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, равной или превышающей 55% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере другой раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрация сахарозы, равной или превышающей приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы, и, необязательно, другой раствор сахара с концентрацией, эквивалентной концентрации сахарозы, равной или превышающей приблизительно 50% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, равной приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы, и, по меньшей мере другой раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, равной приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы, и, необязательно, другой раствор сахара в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы приблизительно 50% (в массовом отношении) сахарозы.

Последовательность загрузки может представлять собой сначала фракцию AAV (например, раствор, содержащий AAV), затем самую низкую концентрацию раствора сахара, затем следует следующий более концентрированный раствор сахара (например, сначала раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 47 до 53% (в массовом отношении) сахарозы, если присутствует, затем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 52 до 58% (в массовом отношении) сахарозы, и затем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 57 до 63% (в массовом отношении) сахарозы).

Преимущество вариантов осуществления по меньшей мере с одним раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, составляющей 52-58% (в массовом отношении) сахарозы, 53-57% (в массовом отношении) сахарозы или приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы, и по меньшей мере другим раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы 57-63% (в массовом отношении) сахарозы, 58-62% (в массовом отношении) сахарозы или приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы, заключается в том, что градиенты, образованные из таких растворов сахара, могут обеспечить улучшенное отделение капсидов AAV.

Согласно иллюстративным аспектам способ предусматривает загрузку в ротор фракции AAV (например, раствора, содержащего AAV) по меньшей мере с тремя растворами сахара, причем каждый раствор сахара (а) характеризуется различной концентрацией сахара и (b) содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 45% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 50% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 47 до 53% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере другой раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 52 до 58% (в массовом отношении) сахарозы, и, по меньшей мере другой раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 57 до 63% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 49 до 51% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере другой раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 54 до 56% (в массовом отношении) сахарозы, и по меньшей мере другой раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 59 до 61% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, превышающей приблизительно 49% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере другой раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, превышающей приблизительно 54% (в массовом отношении) сахарозы, и по меньшей мере один раствор сахара в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, превышающей приблизительно 49% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, равной или превышающей приблизительно 50% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере другой раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, равной или превышающей приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы, и по меньшей мере один раствор сахара в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, равной или превышающей приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы приблизительно 50% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы, и по меньшей мере другой раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы приблизительно 60% (в массовом отношении).

Согласно некоторым вариантам осуществления порядок загрузки может быть таким: сначала раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 47 до 53% (в массовом отношении) сахарозы, затем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 52 до 58% (в массовом отношении) сахарозы, и затем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 57 до 63% (в массовом отношении) сахарозы.

Последовательность загрузки может представлять собой сначала фракцию AAV (например, содержащий AAV раствор), за которой следует самая низкая концентрация раствора сахара, затем следует следующий более концентрированный раствор сахара (например, сначала раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 47 до 53% (в массовом отношении) сахарозы, затем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 52 до 58% (в массовом отношении) сахарозы, и затем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от 57 до 63% (в массовом отношении) сахарозы).

Согласно иллюстративным аспектам каждый из растворов фракции AAV и/или сахара может содержать дополнительные компоненты, например, буферные средства, соли и т.п. Согласно определенным вариантам осуществления каждая из фракций AAV и/или растворов сахара содержит, по отдельности, любое буферное вещество или их комбинации для стабилизации рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 8,5. Примеры приемлемых буферных средств хорошо известны в настоящей области техники и включают в себя, без ограничения, фосфатные буферы, гистидин (например, L-гистидин), цитрат натрия, HEPES, трис, бицин, глицин, N-глицилглицин, ацетат натрия, карбонат натрия, глицилглицин, лизин, аргинин, фосфат натрия и их смеси. Согласно определенным вариантам осуществления буфер представляет собой трис-HCl или трис-HCl/NaCl. рН буфера/фракции/раствора может составлять 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 или 9,0. рН буфера/фракции/раствора может составлять от 7,0 до 9,0, от 7,1 до 8,9, от 7,2 до 9,0, от 7,0 до 8,8, от 7,2 до 8,8, от 7,1 до 8,6, от 7,3 до 8,9, от 7,4 до 9,0 или от 7,4 до 8,5. Согласно определенным вариантам осуществления каждый, отдельно, из буфера, фракции AAV и/или растворов сахара характеризуется рН приблизительно 7,4. Согласно определенным вариантам осуществления каждый, отдельно, из буфера, фракции AAV и/или растворов сахара характеризуется рН приблизительно 8,0. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из буфера, фракции AAV и/или растворов Сахаров по отдельности характеризуется рН приблизительно 8,5.

Согласно определенным вариантам осуществления буфер может представлять собой трис-HCl/NaCl. Согласно некоторым вариантам осуществления трис-HCl находится в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ или от приблизительно 20 до приблизительно 50 мМ. Согласно некоторым вариантам осуществления трис-HCl находится в концентрации приблизительно 10 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 75 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 90 мМ или приблизительно 100 мМ. Согласно некоторым вариантам осуществления NaCl находится в концентрации от приблизительно 100 до приблизительно 1 мМ, от приблизительно 150 до приблизительно 750 мМ, от приблизительно 150 до приблизительно 500 мМ или от приблизительно 500 до приблизительно 750 мМ. Согласно некоторым вариантам осуществления концентрация NaCl составляет приблизительно 100 мМ, приблизительно 120 мМ, приблизительно 125 мМ, приблизительно 130 мМ, приблизительно 136 мМ, приблизительно 140 мМ, приблизительно 150 мМ, приблизительно 175 мМ, приблизительно 200 мМ, приблизительно 225 мМ, приблизительно 250 мМ, приблизительно 275 мМ, приблизительно 300 мМ, приблизительно 325 мМ, приблизительно 350 мМ, приблизительно 375 мМ, приблизительно 400 мМ, приблизительно 425 мМ, приблизительно 450 мМ, приблизительно 475 мМ, приблизительно 500 мМ, приблизительно 525 мМ, приблизительно 550 мМ, приблизительно 575 мМ, приблизительно 600 мМ, приблизительно 625 мМ, приблизительно 650 мМ, приблизительно 675 мМ, приблизительно 700 мМ, приблизительно 725 мМ, приблизительно 750 мМ, приблизительно 775 мМ, приблизительно 800 мМ, приблизительно 825 мМ, приблизительно 850 мМ, приблизительно 875 мМ, приблизительно 900 мМ, приблизительно 925 мМ, приблизительно 950 мМ, приблизительно 975 мМ или приблизительно 1 М. Согласно некоторым вариантам осуществления трис-HCl находится в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ или от приблизительно 20 мМ до приблизительно 50 мМ и NaCl в концентрации от приблизительно 100 до приблизительно 1 мМ, от приблизительно 150 до приблизительно 750 мМ, от приблизительно 150 до приблизительно 500 мМ или от приблизительно 500 до приблизительно 750 мМ. Согласно определенным вариантам осуществления концентрация трис-HCl составляет приблизительно 50 мМ, а концентрация NaCl составляет приблизительно 500 мМ. Согласно определенным вариантам осуществления концентрация трис-HCl составляет приблизительно 20 мМ, а концентрация NaCl составляет приблизительно 136 мМ. Согласно определенным вариантам осуществления концентрация трис-HCl составляет приблизительно 50 мМ, а концентрация NaCl составляет приблизительно 750 мМ. Согласно некоторым вариантам осуществления буфер представляет собой буфер трис-HCl/NaCl с рН 7,4 или приблизительно 7,4. Согласно некоторым вариантам осуществления буфер представляет собой буфер трис-HCl/NaCl с рН 8,0 или приблизительно 8,0. Согласно определенным вариантам осуществления буфер представляет собой буфер трис-HCl/NaCl с рН 8,5 или приблизительно 8,5.

Согласно определенным вариантам осуществления раствор фракции AAV содержит приблизительно 50 мМ трис-HCl и 500 мМ NaCl при рН 8,5. Согласно некоторым вариантам осуществления раствор фракции AAV содержит приблизительно 50 мМ трис-HCl и 750 мМ NaCl при рН 8,0. Согласно определенным вариантам осуществления растворы Сахаров содержат приблизительно 20 мМ трис-HCl и 136 мМ NaCl при рН 7,4.

Согласно иллюстративным аспектам способ предусматривает загрузку в ротор фракции AAV (например, раствора, содержащего AAV), содержащей забуференный раствор этиленгликоля и по меньшей мере два раствора сахара, причем каждый раствор сахара (а) характеризуется различной концентрацией сахара и (b) содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 45% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 50% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы или от приблизительно 55% (в массовом отношении) до приблизительно 60%. (в массовом отношении) сахарозы. Диапазон концентраций сахара такой же, как указано выше. Преимущество применения забуференного раствора этиленгликоля состоит в том, что могут быть выполнены небольшие градиенты. Без желания быть связанными какой-либо теорией, раствор этиленгликоля может изменить свойства вязкости и/или плотности матрицы ультрацентрифугирования. Неожиданно было обнаружено, что добавление этиленгликоля в сочетании с увеличением времени обработки создает неглубокий градиент, который позволяет отделить полные капсиды от пустых капсидов, содержащих меньшую векторную ДНК (например, ≤3 т.п.н. или ≤5 т.п.н.). Используемый в настоящем документе термин «неглубокий градиент» представляет собой такой, при котором плотность раствора или концентрация образующего градиент раствора изменяется (например, градиент сахарозы) постепенно в зависимости от расстояния. Это противоположно тому, когда плотность раствора или концентрация образующего градиент раствора быстро изменяется в зависимости от расстояния. Например, AAV с вектором ДНК, содержащим от приблизительно 2,5 до приблизительно 5,0 т.п.н., может быть разделен более эффективно, когда загрузочный буфер содержит от приблизительно 45% до приблизительно 55% раствора этиленгликоля. Согласно некоторым вариантам осуществления применение этиленгликоля в растворе фракции AAV позволяет разделить ДНК-вектор, содержащий от приблизительно 2,5 до приблизительно 3,0 т.п.н. Согласно некоторым вариантам осуществления способ обеспечивает большее разрешение вектора ДНК, содержащего приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,2, приблизительно 3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9, приблизительно 4,0, приблизительно 4,1, приблизительно 4,2, приблизительно 4,3, приблизительно 4,4, приблизительно 4,5, приблизительно 4,6, приблизительно 4,7, приблизительно 4,8, приблизительно 4,9 или приблизительно 5,0 т.п.н. Согласно некоторым вариантам осуществления улучшенное разрешение происходит с раствором сахара по меньшей мере с тремя различными концентрациями сахара. Согласно некоторым вариантам осуществления улучшенное разрешение происходит с раствором сахара по меньшей мере с двумя различными концентрациями сахара. Согласно некоторым вариантам осуществления улучшенное разрешение происходит с раствором сахара с двумя различными концентрациями сахара. Согласно некоторым вариантам осуществления улучшенное разрешение наблюдается при применении одного раствора сахара в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, составляющей 52-58% (в массовом отношении) сахарозы, 53-57% (в массовом отношении) сахарозы или приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы, и по меньшей мере другого раствора сахара, содержащего сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы 57-63% (в массовом отношении) сахарозы, 58-62% (в массовом отношении) сахарозы или приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы.

Согласно иллюстративным аспектам способ предусматривает загрузку в ротор фракции AAV (например, содержащего AAV раствора) с буферным раствором этиленгликоля и по меньшей мере тремя растворами сахара, каждый раствор сахара из которых (а) характеризуется различной концентрацией сахара и (b) содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 45% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 50% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы. Диапазон концентраций сахара такой же, как указано выше.

Забуференный раствор этиленгликоля может содержать любое буферное вещество или его комбинации для стабилизации рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 8,5. Примеры приемлемых буферных средств хорошо известны в настоящей области техники и включают в себя без ограничения фосфатные буферы, гистидин, цитрат натрия, HEPES, трис, бицин, глицин, N-глицилглицин, ацетат натрия, карбонат натрия, глицилглицин, лизин, аргинин, фосфат натрия и их смеси. Согласно определенным вариантам осуществления буфер представляет собой трис-HCl или трис-HCl/NaCl. рН буфера/раствора может составлять 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 или 9,0. рН буфера/раствора может составлять от 7,0 до 9,0, от 7,1 до 8,9, от 7,2 до 9,0, от 7,0 до 8,8, от 7,2 до 8,8, от 7,1 до 8,6, от 7,3 до 8,9, от 7,4 до 9,0 или с 7,4 до 8,5. Согласно определенным вариантам осуществления буфер/раствор характеризуется рН приблизительно 7,4. Согласно определенным вариантам осуществления буфер/раствор характеризуется рН приблизительно 8,0. Согласно определенным вариантам осуществления буфер/раствор характеризуется рН приблизительно 8,5.

Согласно определенным вариантам осуществления забуференный раствор этиленгликоля содержит трис-HCl/NaCl. Согласно некоторым вариантам осуществления трис-HCl находится в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ или от приблизительно 20 до приблизительно 50 мМ. Согласно некоторым вариантам осуществления трис-HCl находится в концентрации приблизительно 10 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 75 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 90 мМ или приблизительно 100 мМ. Согласно некоторым вариантам осуществления NaCl находится в концентрации от приблизительно 100 мМ до приблизительно 1 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 750 мМ или от приблизительно 150 мМ до приблизительно 500 мМ. Согласно некоторым вариантам осуществления концентрация NaCl составляет приблизительно 100 мМ, приблизительно 120 мМ, приблизительно 125 мМ, приблизительно 130 мМ, приблизительно 136 мМ, приблизительно 140 мМ, приблизительно 150 мМ, приблизительно 175 мМ, приблизительно 200 мМ, приблизительно 225 мМ, приблизительно 250 мМ, приблизительно 275 мМ, приблизительно 300 мМ, приблизительно 325 мМ, приблизительно 350 мМ, приблизительно 375 мМ, приблизительно 400 мМ, приблизительно 425 мМ, приблизительно 450 мМ, приблизительно 475 мМ, приблизительно 500 мМ, приблизительно 525 мМ, приблизительно 550 мМ, приблизительно 575 мМ, приблизительно 600 мМ, приблизительно 625 мМ, приблизительно 650 мМ, приблизительно 675 мМ, приблизительно 700 мМ, приблизительно 725 мМ, приблизительно 750 мМ, приблизительно 775 мМ, приблизительно 800 мМ, приблизительно 825 мМ, приблизительно 850 мМ, приблизительно 875 мМ, приблизительно 900 мМ, приблизительно 925 мМ, приблизительно 950 мМ, приблизительно 975 мМ или приблизительно 1 М. Согласно некоторым вариантам осуществления трис-HCl находится в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ или от приблизительно 20 мМ до приблизительно 50 мМ и NaCl в концентрации от приблизительно 100 мМ до приблизительно 1 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 750 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 500 мМ или от приблизительно 500 мМ до приблизительно 750 мМ. Согласно определенным вариантам осуществления концентрация трис-HCl составляет приблизительно 50 мМ, а концентрация NaCl составляет приблизительно 500 мМ. Согласно определенным вариантам осуществления концентрация трис-HCl составляет приблизительно 20 мМ, а концентрация NaCl составляет приблизительно 136 мМ. Согласно определенным вариантам осуществления концентрация трис-HCl составляет приблизительно 50 мМ, а концентрация NaCl составляет приблизительно 750 мМ. Согласно некоторым вариантам осуществления буфер представляет собой буфер трис-HCl/NaCl с рН 7,4 или приблизительно 7,4. Согласно некоторым вариантам осуществления буфер представляет собой буфер трис-HCl/NaCl с рН 8,0 или приблизительно 8,0. Согласно определенным вариантам осуществления буфер представляет собой буфер трис-HCl/NaCl с рН 8,5 или приблизительно 8,5.

Забуференный раствор этиленгликоля может составлять от 45 до 55% (в массовом отношении), от 46% до 54% (в массовом отношении), от 45% до 53% (в массовом отношении), от 47% до 55% (в массовом отношении) или от 48% до 52% (в массовом отношении) буфера (например, трис-HCl/NaCl). Забуференный раствор этиленгликоля может содержать 40% (в массовом отношении), 41% (в массовом отношении), 42% (в массовом отношении), 43% (в массовом отношении), 44% (в массовом отношении), 45% (в массовом отношении), 46% (в массовом отношении), 47% (в массовом отношении), 48% (в массовом отношении), 49% (в массовом отношении), 50% (в массовом отношении), 51% (в массовом отношении), 52% (в массовом отношении), 53% (в массовом отношении), 54% (в массовом отношении), 55% (в массовом отношении), 56% (в массовом отношении), 57% (в массовом отношении) 58% (в массовом отношении), 59% (в массовом отношении) или 60% (в массовом отношении) буфера (например, трис-HCl/NaCl). Забуференный раствор этиленгликоля может быть водным.

Согласно некоторым вариантам осуществления забуференный раствор этиленгликоля содержит 45-55% (в массовом отношении) этиленгликоля, 50 мМ трис-HCl и 750 мМ NaCl при рН 8,0. Согласно некоторым вариантам осуществления забуференный раствор этиленгликоля содержит 50% (в массовом отношении) этиленгликоля, 50 мМ трис-HCl и 750 мМ NaCl при рН 8,0.

Согласно определенным вариантам осуществления объем сердечника ротора ультрацентрифуги составляет от приблизительно 800 мл до приблизительно 9000 мл. Согласно определенным вариантам осуществления объем сердечника ротора ультрацентрифуги составляет от приблизительно 800 мл до приблизительно 7700 мл. Согласно некоторым вариантам осуществления объем сердечника ротора ультрацентрифуги составляет приблизительно 800 мл. Согласно определенным вариантам осуществления объем сердечника ротора ультрацентрифуги составляет приблизительно 1600 мл. Согласно определенным вариантам осуществления объем сердечника ротора ультрацентрифуги составляет приблизительно 3200 мл. Согласно некоторым вариантам осуществления объем сердечника ротора ультрацентрифуги составляет приблизительно 7700 мл.

Согласно определенным вариантам осуществления растворы сахара загружают с постоянной скоростью потока. Согласно некоторым вариантам осуществления постоянная скорость потока составляет от приблизительно 0,25 л/час до приблизительно 10 л/час или от приблизительно 1,5 л/час до приблизительно 7 л/час. Согласно некоторым вариантам осуществления постоянная скорость потока составляет приблизительно 0,25 л/час, приблизительно 0,5 л/час, приблизительно 0,75 л/час, приблизительно 1 л/час, приблизительно 1,25 л/час, приблизительно 1,5 л/час, приблизительно 1,75 л/час, приблизительно 2 л/час, приблизительно 2,5 л/час, приблизительно 3 л/час, приблизительно 3,5 л/час, приблизительно 4 л/час, приблизительно 4,5 л/час, приблизительно 5 л/час, приблизительно 5,5 л/час, приблизительно 6 л/час, приблизительно 6,5 л/час, приблизительно 7 л/час, приблизительно 7,5 л/час, приблизительно 8 л/час, приблизительно 8,5 л/час, приблизительно 9 л/час, приблизительно 9,5 л/час или приблизительно 10 л/час.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает загрузку в ротор приблизительно 45-55% (в массовом отношении) фракции AAV (с буферным раствором этиленгликоля или без него) и приблизительно 45-55% (в массовом отношении) по меньшей мере двух растворов сахара. Согласно иллюстративным вариантам осуществления способ предусматривает загрузку в ротор приблизительно 50% (в массовом отношении) фракции AAV (с буферным раствором этиленгликоля или без него) и приблизительно 50% (в массовом отношении) по меньшей мере двух растворов сахара. Согласно некоторым вариантам осуществления объем сердечника ротора ультрацентрифуги составляет от приблизительно 800 мл до приблизительно 3200 мл, и в ротор загружают приблизительно 45-55% (в массовом отношении) фракции AAV (с буферным раствором этиленгликоля или без него) и приблизительно 45-55% (в массовом отношении) по меньшей мере двух растворов сахара. Согласно некоторым вариантам осуществления объем сердечника ротора ультрацентрифуги составляет от приблизительно 800 мл до приблизительно 3200 мл, и в ротор загружают приблизительно 50% (в массовом отношении) фракции AAV (с буферным раствором этиленгликоля или без него) и приблизительно 50% (в массовом отношении) по меньшей мере двух растворов сахара в общей сложности. Например, если сердечник ротора составляет 800 мл, фракция AAV может составлять 400 мл, а общая доля раствора сахара составлять 400 мл.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает загрузку в ротор приблизительно 65-85% (в массовом отношении) фракции AAV (с буферным раствором этиленгликоля или без него) и 15-35% (в массовом отношении) по меньшей мере двух растворов сахара. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает загрузку в ротор приблизительно 70-80% (в массовом отношении) фракции AAV (с буферным раствором этиленгликоля или без него) и приблизительно 20-30% (в массовом отношении) по меньшей мере двух растворов сахара. Согласно иллюстративным вариантам осуществления способ предусматривает загрузку в ротор приблизительно 75% (в массовом отношении) фракции AAV (с буферным раствором этиленгликоля или без него) и приблизительно 25% (в массовом отношении) по меньшей мере двух растворов сахара. Согласно иллюстративным вариантам осуществления способ предусматривает загрузку в ротор приблизительно 74% (в массовом отношении) фракции AAV (с буферным раствором этиленгликоля или без него) и приблизительно 26% (в массовом отношении) по меньшей мере двух растворов сахара. Согласно некоторым вариантам осуществления объем сердечника ротора ультрацентрифуги составляет от приблизительно 7700 мл до приблизительно 9000 мл, и в ротор загружают приблизительно 70-80% (в массовом отношении) фракции AAV (с буферным раствором этиленгликоля или без него) и приблизительно 20-30% (в массовом отношении) по меньшей мере двух растворов сахара. Согласно некоторым вариантам осуществления объем сердечника ротора ультрацентрифуги составляет от приблизительно 7700 мл до приблизительно 9000 мл, и в ротор загружают приблизительно 75% (в массовом отношении) фракции AAV (с буферным раствором этиленгликоля или без него) и приблизительно 25% (в массовом отношении) по меньшей мере двух растворов сахара. Согласно некоторым вариантам осуществления объем сердечника ротора ультрацентрифуги составляет от приблизительно 7700 мл до приблизительно 9000 мл, и в ротор загружают приблизительно 74% (в массовом отношении) фракции AAV (с буферным раствором этиленгликоля или без него) и приблизительно 26% (в массовом отношении) по меньшей мере двух растворов сахара. Например, если сердечник ротора составляет 7700 мл, фракция AAV может составлять 6100 мл, а общая доля раствора сахара может составлять 1600 мл.

Согласно определенным вариантам осуществления растворы сахара добавляют в приблизительно одинаковых объемах. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает загрузку по меньшей мере двух растворов сахара, и раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, равном объему других растворов сахара в роторе. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает загрузку по меньшей мере двух растворов сахара, и раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, который в два раза превышает объем одного из других растворов сахара в роторе. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает загрузку по меньшей мере двух растворов сахара, и раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, который приблизительно в 1,6 раза или приблизительно в 2,6 раза превышает объем одного из других растворов сахара в роторе. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает загрузку по меньшей мере двух растворов сахара, и раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, который составляет половину объема одного из других растворов сахара в роторе. Согласно некоторым вариантам осуществления раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, который в два раза превышает объем раствора сахара с наибольшей концентрацией сахара, необязательно, причем объем раствора сахара с наибольшей концентрацией сахара равен объему раствора сахара с промежуточной концентрацией сахара. Согласно некоторым вариантам осуществления раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, который приблизительно в 2,6 раза превышает объем раствора сахара с самой большой концентрацией сахара, необязательно, причем объем раствора сахара с промежуточной концентрацией сахаром приблизительно в 1,6 раза превышает объем раствора сахара с наибольшей концентрацией сахара. Согласно определенным вариантам осуществления раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, который равен объему раствора сахара с наибольшей концентрацией сахара, необязательно, причем объем раствора сахара с наибольшей концентрацией сахара составляет половину объема раствора сахара с промежуточной концентрацией сахара. Согласно определенным вариантам осуществления раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, который составляет половину объема фракции AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, который составляет три четверти объема фракции AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления отношение объема растворов сахара к объему фракции AAV меньше или равно единице.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает загрузку двух растворов сахара, и раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, который равен объему раствора с наибольшей концентрацией сахара в роторе. Согласно определенным вариантам осуществления раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, который составляет половину объема фракции AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления отношение объема растворов сахара к объему фракции AAV меньше или равно единице.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает загрузку трех растворов сахара, и раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, который по меньшей мере вдвое превышает объем одного из двух других растворов сахара в роторе. Согласно некоторым вариантам осуществления раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, который в два раза превышает объем раствора сахара с наибольшей концентрацией сахара, необязательно, причем объем раствора сахара с наибольшей концентрацией сахара равен объему раствора сахара с промежуточной концентрацией сахара. Например, раствор сахара с наименьшим раствором сахара может характеризоваться объемом от приблизительно 750 мл до приблизительно 900 мл или приблизительно 800 мл, раствор сахара с промежуточной концентрацией сахара может составлять от приблизительно 350 мл до приблизительно 450 мл или приблизительно 400 мл, и раствор сахара с наибольшей концентрацией сахара может характеризоваться объемом от приблизительно 350 мл до приблизительно 450 мл или приблизительно 400 мл. Согласно определенным вариантам осуществления раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, который составляет половину объема фракции AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в ротор в объеме, который составляет три четверти объема фракции AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления отношение объема растворов сахара к объему фракции AAV меньше или равно единице. Согласно иллюстративным аспектам ротор представляет собой зональный ротор. Согласно некоторым вариантам осуществления общий объем растворов сахара и фракции AAV меньше или равен объему зонального ротора. Согласно некоторым вариантам осуществления объем общего объема растворов в зональном роторе составляет приблизительно от 800 мл до 9 л. Согласно некоторым вариантам осуществления объем растворов сахара больше или равен приблизительно 50% объема зонального ротора. Например, объем растворов сахара больше или равен приблизительно 50% объема зонального ротора, характеризующегося объемом менее чем приблизительно 3200 мл, например, приблизительно 3200 мл, приблизительно 1600 мл или приблизительно 800 мл. Согласно некоторым вариантам осуществления объем растворов сахара меньше или равен приблизительно 25% объема зонального ротора, например, когда используют сердечник объемом более 7 л, например, 7,7 л.

Согласно некоторым вариантам осуществления отношение объема общего градиента сахара к объему фракции AAV, загруженной в зональный ротор, составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:5. Согласно некоторым вариантам осуществления объем общего градиента сахара к объему фракции AAV, загруженной в зональный ротор, составляет приблизительно 1:1, приблизительно 1:1,25, приблизительно 1:1,5, приблизительно 1:1,75, приблизительно 1:2, приблизительно 1:2,25, приблизительно 1:2,5, приблизительно 1:2,75, приблизительно 1:3, приблизительно 1:3,25, приблизительно 1:3,5, приблизительно 1:3,75, приблизительно 1:4, приблизительно 1:4,25, приблизительно 1:4,5, приблизительно 1:4.75 или приблизительно 1:5.

Согласно иллюстративным аспектам способ предусматривает загрузку в зональный ротор концентрированной фракции AAV по меньшей мере с двумя растворами сахара, каждый из которых характеризуется различной концентрацией сахара и каждый из которых содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 45% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы (диапазоны, как указано выше), причем (А) объем растворов сахара больше или составляет приблизительно 50% от объема зонального ротора, (В) общий объем растворов сахара и фракции AAV меньше или равен объему зонального ротора, (С) отношение объема растворов сахара к объему фракции AAV составляет менее чем единицу или равно единице или (D) комбинация (А), (В) и (С). Согласно некоторым вариантам осуществления объем общего объема растворов в зональном роторе составляет приблизительно от 800 мл до 9 л. Согласно некоторым вариантам осуществления объем растворов сахара больше или равен приблизительно 50% объема зонального ротора. Например, объем растворов сахара больше или равен приблизительно 50% объема зонального ротора, имеющего объем менее чем приблизительно 3200 мл, например, приблизительно 3200 мл, приблизительно 1600 мл или приблизительно 800 мл. Согласно некоторым вариантам осуществления объем растворов сахара меньше или равен приблизительно 25% объема зонального ротора, например, когда используют сердечник объемом более чем 7 л, например, 7,7 л.

Согласно иллюстративным аспектам каждый раствор сахара содержит растворимый углевод или смесь углеводов. Согласно определенным вариантам осуществления каждый раствор сахара содержит дисахарид (например, сахарозу, мальтозу или лактозу) и/или трисахарид. Согласно некоторым вариантам осуществления плотность растворов сахара равна плотности растворов сахарозы с концентрацией в диапазоне от приблизительно 45% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении). Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере один из растворов сахара характеризуется плотностью, равной приблизительно 60% сахарозы при данной температуре. Согласно определенным вариантам осуществления диапазоны являются такими, как указано выше.

Для целей настоящего изобретения может быть использован сахар, отличный от сахарозы, при условии, что сахар в растворе сахара характеризуется концентрацией, эквивалентной концентрации сахарозы в указанном диапазоне или в определенном количестве (% (в массовом отношении)). Концентрация сахарозы может быть определена с помощью способа измерения показателей преломления, который определяет содержание сахара в водном растворе в градусах по шкале Брикса («Вх»), где один градус Брикса представляет собой 1 г сахарозы в 100 г раствора. Градусы по шкале Брикса представляют собой концентрацию раствора в процентах по массе - если раствор содержит растворенные твердые вещества, отличные от чистой сахарозы, то Вх только приближает содержание растворенного твердого вещества. Концентрация сахарозы также может быть определена путем измерения плотности в случае чистых растворов. Если необходимо определить как идентичность, так и концентрацию, можно применять коммерчески доступный ферментативный набор для определения концентрации и выделения сахарозы от других дисахаридов и углеводов. Можно использовать набор для анализа на сахарозу, такой как набор, продаваемый Sigma-Aldrich (St. Louis, МО) под № в каталоге SCA20.

Согласно иллюстративным аспектам каждый раствор сахара содержит сахарозу. Согласно иллюстративным аспектам способ предусматривает загрузку в ротор (например, зональный ротор) фракции AAV (например, раствора, содержащего AAV) по меньшей мере с двумя растворами сахарозы, причем каждый раствор сахарозы (а) характеризуется различной концентрацией сахарозы и (b) содержит сахарозу в концентрации от приблизительно 45% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации 52-58% (в массовом отношении) сахарозы и по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации 57-63% (в массовом отношении) сахарозы, и, необязательно, по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации 47-53% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации 54-56% (в массовом отношении) сахарозы, и по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации 59-61% (в массовом отношении) сахарозы, и необязательно, по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации от 49 до 51% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации, превышающей приблизительно 54% (в массовом отношении) сахарозы, и по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации, превышающей приблизительно 59% (в массовом отношении) сахарозы, и, необязательно, по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации, превышающей приблизительно 49% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации, равной или превышающей приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации, равной или превышающей приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы, и, необязательно, по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации, равной или превышающей приблизительно 50% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации, равной приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы и, необязательно, по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации приблизительно 50% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления раствор, содержащий AAV, представляет собой забуференный раствор (например, буфер трис-HCl/NaCl). Согласно определенным вариантам осуществления раствор, содержащий AAV, представляет собой забуференный раствор этиленгликоля, как описано выше. Согласно определенным вариантам осуществления забуференный раствор этиленгликоля представляет собой водный раствор. Согласно некоторым вариантам осуществления забуференный раствор этиленгликоля представляет собой водный раствор, который содержит 45-55% (в массовом отношении) этиленгликоля, и буфер, содержащий трис-HCl и NaCl. Согласно некоторым вариантам осуществления трис-HCl находится в концентрации от приблизительно 20 до приблизительно 50 мМ. Согласно определенным вариантам осуществления NaCl находится в концентрации от приблизительно 100 мМ до приблизительно 750 мМ или от приблизительно 150 мМ до приблизительно 500 мМ. Согласно некоторым вариантам осуществления концентрация трис-HCl составляет от приблизительно 20 до приблизительно 50 мМ, а концентрация NaCl составляет от приблизительно 100 мМ до приблизительно 750 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 500 мМ или от приблизительно 500 мМ до приблизительно 750 мМ. Согласно некоторым вариантам осуществления рН раствора, содержащего AAV, составляет от 7,4 до 8,5, от 7,6 до 8,3, от 7,8 до 8,5, от 7,4 до 7,8, от 7,6 до 8,0, от 7,8 до 8,2 или от 8,0 до 8,5.

Согласно иллюстративным аспектам способ предусматривает загрузку в ротор (например, зональный ротор) фракции AAV (например, раствора, содержащего AAV) по меньшей мере с двумя растворами сахарозы, каждый раствор сахарозы из которых (а) характеризуется различной концентрацией сахарозы и (b) содержит сахарозу в концентрации от приблизительно 50% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации 52-58% (в массовом отношении) сахарозы и по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации 57-63% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации 54-56% (в массовом отношении) сахарозы и по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации 59-61% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации, превышающей приблизительно 54% (в массовом отношении) сахарозы и по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации, превышающей приблизительно 59% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации, равной или превышающей приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы, и по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации, равной или превышающей приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации, равной приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы, и по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления раствор, содержащий AAV, представляет собой забуференный раствор (например, буфер трис-HCl/NaCl). Согласно определенным вариантам осуществления раствор, содержащий AAV, представляет собой забуференный раствор этиленгликоля, как описано выше.

Согласно иллюстративным аспектам способ предусматривает загрузку в ротор (например, зональный ротор) фракции AAV (например, раствора, содержащего AAV) по меньшей мере с тремя растворами сахарозы, причем каждый раствор сахарозы из которых (а) характеризуется различной концентрацией сахарозы и (b) содержит сахарозу в концентрации от приблизительно 45% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы, необязательно, от приблизительно 50% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении). Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации 47-53% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации 52-58% (в массовом отношении) сахарозы и по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации 57-63% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации 49-51% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации 54-56% (в массовом отношении) сахарозы и по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации 59-61% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации, превышающей приблизительно 49% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации, превышающей 54% (в массовом отношении) сахарозы, и по меньшей мере другой раствор содержит сахарозу в концентрации, превышающей приблизительно 59% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации, равной или превышающей приблизительно 50% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации, равной или превышающей приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы, и по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации, равной или превышающей приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации, равной приблизительно 50% (в массовом отношении) сахарозы, по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы, и по меньшей мере один раствор содержит сахарозу в концентрации приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления раствор, содержащий AAV, представляет собой забуференный раствор (например, буфер трис-HCl/NaCl). Согласно определенным вариантам осуществления раствор, содержащий AAV, представляет собой забуференный раствор этиленгликоля, как описано выше.

Согласно иллюстративным аспектам способ предусматривает загрузку в ротор (например, зональный ротор) трех, четырех, пяти, шести или более растворов сахарозы, каждый раствор сахарозы из которых (а) характеризуется различной концентрацией сахарозы и (b) содержит сахарозу в концентрации от приблизительно 45% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы, необязательно, в диапазоне от приблизительно 50% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении) или, необязательно, в диапазоне от приблизительно 55% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении). Полные диапазоны концентраций сахарозы являются такими, как указано выше в отношении диапазонов растворов сахара. Соотношение растворов сахарозы к фракции AAV и/или другим растворам сахара является таким, как указано выше.

Согласно иллюстративным аспектам объем раствора сахарозы с самой низкой концентрацией сахарозы и объем раствора сахарозы с самой высокой концентрацией сахарозы составляют от приблизительно 20% до приблизительно 30% и от приблизительно 20% до приблизительно 30% объема ротора, соответственно. Согласно некоторым вариантам осуществления объем раствора сахарозы с самой низкой концентрацией сахарозы, объем раствора сахарозы с промежуточной концентрацией сахарозы и объем раствора сахарозы с самой высокой концентрацией сахарозы составляют каждый приблизительно 25% объема ротора. Согласно иллюстративным аспектам объем раствора сахарозы с самой низкой концентрацией сахарозы, раствора сахарозы с промежуточной концентрацией сахарозы и раствора сахарозы с самой высокой концентрацией сахарозы составляют от приблизительно 20% до приблизительно 30%, от приблизительно 10% до приблизительно 15% и от приблизительно 10% до приблизительно 15% объема ротора соответственно. Согласно некоторым вариантам осуществления объем раствора сахарозы с самой низкой концентрацией сахарозы, раствора сахарозы с промежуточной концентрацией сахарозы и раствора сахарозы с самой высокой концентрацией сахарозы составляют приблизительно 25%, приблизительно 12,5% и приблизительно 12,5% от объема ротора, соответственно. Согласно некоторым вариантам осуществления объем сердечника или объем ротора ультрацентрифуги находится в диапазоне от приблизительно 200 мл до приблизительно 10000 мл, в диапазоне от приблизительно 700 мл до приблизительно 8500 мл или в диапазоне от приблизительно 700 мл до приблизительно 70000 мл.

Доступен и известен специалистам в настоящей области техники широкий спектр сердечников ультрацентрифуг. Например, самый маленький сердечник ультрацентрифуги представляет собой Hitachi CC40S объемом 200 мл, а самый большой сердечник представляет собой Hitachi СС40 объемом 8000 мл. Могут использоваться СС40СТ3 Core Е все другие ультрацентрифуги с непрерывным потоком и сердечники от других поставщиков.

Согласно иллюстративным аспектам способ предусматривает работу ультрацентрифуги, содержащей ротор (например, зональный ротор), в периодическом режиме, после чего образуется градиент сахара. Согласно определенным вариантам осуществления ультрацентрифуга работает с первой скоростью вращения менее чем 10000 об/мин. Согласно некоторым вариантам осуществления первая скорость вращения составляет от приблизительно 3000 об/мин до приблизительно 6000 об/мин (например, 4000 об/мин или 5000 об/мин), и первая скорость вращения достигается в течение от приблизительно 15 до приблизительно 25 минут. Согласно определенным вариантам осуществления ультрацентрифуга работает с первой скоростью вращения при температуре от приблизительно 2°С до приблизительно 10°С. Согласно определенным вариантам осуществления ультрацентрифуга работает с первой скоростью вращения с целью в конечном итоге достижения более высокой скорости вращения. Согласно некоторым вариантам осуществления ультрацентрифуга ускоряется до второй скорости вращения, которая по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза больше, чем первая скорость вращения. Согласно некоторым вариантам осуществления вторая скорость вращения достигается при ускорении ультрацентрифуги в течение от приблизительно 5 до приблизительно 60 минут. Согласно определенным вариантам осуществления ультрацентрифуга работает со второй скоростью вращения, которая больше или равна приблизительно 30000 об/мин. Согласно определенным вариантам осуществления ультрацентрифуга работает со второй скоростью вращения, которая больше или равна приблизительно 30000 об/мин и меньше или равна приблизительно 50000 об/мин. Согласно некоторым вариантам осуществления вторая скорость вращения составляет от приблизительно 30000 об/мин до приблизительно 40000 об/мин, например, приблизительно 35000 об/мин. Согласно определенным вариантам осуществления ультрацентрифуга работает со второй скоростью вращения в течение по меньшей мере или приблизительно 3 часов, по меньшей мере или приблизительно 4 часов, по меньшей мере или приблизительно 5 часов или по меньшей мере или приблизительно 6 часов, по меньшей мере или приблизительно 10 часов, по меньшей мере или приблизительно 12 часов, по меньшей мере или приблизительно 14 часов, по меньшей мере или приблизительно 16 часов, по меньшей мере или приблизительно 18 часов, по меньшей мере или приблизительно 20 часов или по меньшей мере или приблизительно 22 часов. Согласно определенным вариантам осуществления ультрацентрифуга работает на второй скорости вращения в течение по меньшей мере или приблизительно 4 часов. Согласно определенным вариантам осуществления ультрацентрифуга работает со второй скоростью вращения в течение от приблизительно 16 до приблизительно 20 часов. Согласно определенным вариантам осуществления ультрацентрифуга работает на второй скорости вращения в течение по меньшей мере или приблизительно 16 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления ультрацентрифуга работает со второй скоростью вращения при температуре от приблизительно 15°С до приблизительно 30°С, например, по меньшей мере приблизительно 18°С, от приблизительно 20°С до приблизительно 25°С (например, приблизительно 22°С). Согласно некоторым вариантам осуществления ультрацентрифуга впоследствии приводится в действие для снижения скорости вращения, например, до первой скорости вращения, например, приблизительно 4000 об/мин, необязательно, в течение от приблизительно 5 до приблизительно 90 минут. Согласно некоторым вариантам осуществления замедление происходит при температуре менее чем приблизительно 18°С, от приблизительно 2°С до приблизительно 10°С или менее чем приблизительно 8°С. Согласно определенным вариантам осуществления ультрацентрифуга работает при температуре менее чем приблизительно 8°С по меньшей мере за 30 минут до остановки ультрацентрифуги.

Согласно иллюстративным аспектам способ предусматривает получение фракции градиента сахара для получения фракции AAV. Согласно определенным вариантам осуществления полученная фракция AAV содержит более 60% полных капсидов. Согласно определенным вариантам осуществления полученная фракция AAV содержит 70-80% полных капсидов. Согласно определенным вариантам осуществления получают одну или несколько фракций градиента сахара, а согласно некоторым вариантам осуществления фракции получают из градиента, содержащего фракции с более высокой плотностью. Согласно некоторым вариантам осуществления получают фракции, эквивалентные фракциям 7-11, как показано на фиг. 8. Согласно некоторым вариантам осуществления получают фракции, эквивалентные фракциям 10-14, как описано в примере 9. Согласно определенным вариантам осуществления получают фракции, эквивалентные фракциям 1-8, как описано в примере 16. Согласно некоторым вариантам осуществления любая фракция, содержащая полные капсиды, отделяется от пустых капсидов по разнице их плотности, когда они элюируются из ротора в градиенте плотности. Контроль разделения может быть достигнут либо путем фракционирования в небольших объемах с последующим аналитическим исследованием [например, как описано в примере 9], либо фракционированием в соответствии с УФ-сигналами при линейном измерении УФ-сигналов (например, при сигналах УФ 254 нм/ УФ 280 нм и контроля вдоль линии их соотношения). Согласно определенным вариантам осуществления фракцию AAV получают из зоны с более высокой плотностью сахарозы на стадии ультрацентрифугирования. Согласно некоторым вариантам осуществления полученная фракция AAV (например, AAV8) подтверждается как в основном полные капсиды (например, >60% полных капсидов) посредством соотношения [УФ-сигнал при 254 нм]/[УФ-сигнал при 280 нм], не зависящего от объема используемого сердечника UC. Если это соотношение (OD 254 hm/OD 280 нм)>1, то фракция представляет собой полные капсиды.

Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию дают продукт AAV, в котором по меньшей мере 50% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способы по настоящему раскрытию дают продукт AAV, в котором по меньшей мере 55% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способы по настоящему раскрытию дают продукт AAV, в котором по меньшей мере 60% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способы по настоящему раскрытию дают продукт AAV, в котором по меньшей мере 70% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему раскрытию дают продукт AAV, в котором по меньшей мере 80% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему раскрытию дают продукт AAV, в котором по меньшей мере 90% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV. Понятно, что «по меньшей мере 50%» относится к диапазону, где 50% представляет собой минимальный процент. Максимальный процент такого диапазона согласно различным вариантам осуществления составляет 100%, хотя в настоящем документе также рассматриваются поддиапазоны, где максимальный процент составляет, например, 99%, 98%, 95%, 80%, 85% и т.п. Подходящие способы измерения количества полных капсидов по сравнению с пустыми капсидами известны в настоящей области техники и предусматривают, например, трансэлектронную микроскопию с отрицательным окрашиванием и аналитическую анионообменную хроматографию с использованием установки обнаружения, которая позволяет различать полные и пустые капсиды. Смотрите, например, Human Gene Ther Part В 23:56-64 (2012) и Qu et al., J Virol Methods 140: 183-192(2007).

Согласно иллюстративным аспектам растворы сахара (например, сахарозы) различаются по концентрации от приблизительно 5% (в массовом отношении) до приблизительно 15% (в массовом отношении). Согласно некоторым вариантам осуществления растворы сахара отличаются по концентрации, эквивалентной сахарозе, от приблизительно 5% (в массовом отношении) до приблизительно 10% (в массовом отношении), от приблизительно 4% (в массовом отношении) до приблизительно 8% (в массовом отношении) или от приблизительно 2% (в массовом отношении) до приблизительно 3% (в массовом отношении). Согласно некоторым вариантам осуществления растворы сахара содержат сахарозу и отличаются по концентрации сахарозы от приблизительно 5% (в массовом отношении) до приблизительно 10% (в массовом отношении), от приблизительно 4% (в массовом отношении) до приблизительно 8% (в массовом отношении) или от приблизительно 2% (в массовом отношении) до приблизительно 3% (в массовом отношении).

Согласно иллюстративным аспектам способ очистки частиц рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) и/или способ отделения полных вирусных частиц от пустых капсидов предусматривает ультрацентрифугирование фракции, содержащей частицы rAAV, с двумя растворами сахарозы, причем каждый раствор сахарозы содержит другую концентрацию сахарозы в диапазоне от приблизительно 50% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) при первой скорости вращения менее 10000 об/мин (например, 4000 об/мин) в течение от приблизительно 15 минут до приблизительно 45 минут или от приблизительно 17 минут до приблизительно 25 минут и при второй скорости вращения в диапазоне от приблизительно 30000 до приблизительно 40000 об/мин (например, 35000 об/мин) в течение по меньшей мере 4 часов или от приблизительно 16 до приблизительно 20 часов. Согласно определенным вариантам осуществления один раствор содержит сахарозу в концентрации, равной приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы, и один раствор содержит сахарозу в концентрации приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно иллюстративным аспектам стадию ультрацентрифугирования проводят, как описано в примере 6.

Согласно иллюстративным аспектам способ очистки частиц рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) и/или способ отделения полных вирусных частиц от пустых капсидов предусматривает ультрацентрифугирование фракции, содержащей частицы rAAV, с тремя растворами сахарозы, причем каждый раствор сахарозы содержит другую концентрацию сахарозы в диапазоне от приблизительно 45% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) при первой скорости вращения менее 10000 об/мин (например, 4000 об/мин) в течение от приблизительно 15 минут до приблизительно 45 минут или от приблизительно 17 минут до приблизительно 25 минут и при второй скорости вращения в диапазоне от приблизительно 30000 до приблизительно 40000 об/мин (например, 35000 об/мин) в течение по меньшей мере 4 часов или от приблизительно 16 до приблизительно 20 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления один раствор содержит сахарозу в концентрации, равной приблизительно 50% (в массовом отношении) сахарозы, один раствор содержит сахарозу в концентрации приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы и один раствор содержит сахарозу в концентрации приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы. Согласно иллюстративным аспектам стадию ультрацентрифугирования проводят как по существу описано в примерах 7 или 9.

Источник частиц rAAV

Что касается способов по настоящему раскрытию, AAV может представлять собой AAV любого серотипа. Согласно определенным вариантам осуществления AAV, очищенный способами, описанными в настоящем документе, характеризуется серотипом AAV1, серотипом AAV2, серотипом AAV3, серотипом AAV4, серотипом AAV5, серотипом AAV6, серотипом AAV7, серотипом AAV8, серотипом AAV9 или серотипом AAV10. Согласно определенным вариантам осуществления частицы AAV, очищенные описанными в настоящем документе способами, характеризуется серотипом AAV8. Что касается способов по настоящему изобретению, фракция AAV, которую загружают в ротор, в качестве примера представляет собой концентрированную фракцию AAV. Согласно определенным вариантам осуществления фракция AAV, загруженная в ротор, содержит, по меньшей мере 1×10¹⁰, 1×10¹¹ или 1×10¹² капсидов AAV на мл. Согласно некоторым вариантам осуществления фракция AAV, загруженная в ротор, содержит по меньшей мере 1×10¹² капсидов AAV на мл, причем капсиды AAV включают в себя пустые капсиды AAV и полные капсиды AAV.

Согласно некоторым вариантам осуществления фракция AAV представляет собой фракцию AAV, производимую трансфицированными клетками-хозяевами. Согласно некоторым вариантам осуществления фракция AAV представляет собой супернатант, собранный из клеточной культуры, содержащей клетки-хозяева, трансфицированные тройной плазмидной системой, причем одна плазмида системы содержит представляющий интерес ген или кДНК, одна плазмида кодирует капсидный белок VP1, капсидный белок VP2 и/или капсидный белок VP3. Согласно некоторым вариантам осуществления VP1, VP2 и/или VP3 представляют собой VP1 AAV8, VP2 AAV8 и/или VP3 AAV8. Тройная плазмидная трансфекция с целью получения rAAV известна в настоящей области техники. Смотрите, например, Qu et al., 2015, выше, и Mizukami et al., "A Protocol for AAV vector production and purification." Диссертация на соискание ученой степени кандидата наук, подразделение генетических терапевтических средств, Центр молекулярной медицины, 1998 и Kotin et al., Hum Mol Genet 20(R1): R2-R6 (2011). Согласно некоторым вариантам осуществления трансфекция может быть осуществлена с использованием неорганических соединений, например, фосфата кальция, или органических соединений, полиэтиленимина (PEI), или нехимических средств, например, электропорации.

Согласно определенным вариантам осуществления клетки-хозяева представляют собой адгезивные клетки. Согласно определенным вариантам осуществления клетки-хозяева представляют собой суспензионные клетки. Согласно определенным вариантам осуществления клетки-хозяева представляют собой клетки HEK293 или клетки SP9 (например, инфицированные бакуловирусом клетки Sf9). Согласно определенным вариантам осуществления клеточная культура включает в себя культуральную среду, которая не содержит сыворотку и белок. Согласно некоторым вариантам осуществления среда характеризуется химически определенным составом и не содержит компонентов животного происхождения, например, гидролизатов.

Согласно определенным вариантам осуществления фракция, содержащая частицы rAAV, представляет собой фракцию, содержащую клетки HEK293, трансфицированные тройной плазмидной системой. Согласно некоторым вариантам осуществления фракция, содержащая частицы rAAV, представляет собой фракцию супернатанта, собранную через приблизительно от 3 до приблизительно 5 дней после трансфекции клеток HEK293 или когда клеточная культура характеризуется плотностью клеток более чем или приблизительно 5×10⁶ клеток/мл и характеризуется жизнеспособностью клеток более чем или приблизительно 50%. Согласно некоторым вариантам осуществления фракция, содержащая частицы rAAV, представляет собой фракцию, содержащую клетки HEK293, как описано в примере 1.

Согласно определенным вариантам осуществления AAV получают путем тройной плазмидной трансфекции с последующим сбором через один-пять дней спустя. Согласно определенным вариантам осуществления AAV получают посредством разрушения клеток.

Согласно определенным вариантам осуществления AAV получают следующим образом: клетки HEK293 являются адгезивными, и их выращивают в коммерчески доступной культуральной среде, которая может характеризоваться химически определенным составом и может не содержать компонентов животного происхождения, например, сыворотку и белки. Клетки культивируют до плотности клеток от приблизительно 3×10⁶ до приблизительно 12 клеток/мл, например, от приблизительно 6×10⁶ до приблизительно 10 клеток/мл. Затем клетки разделяют в соотношении приблизительно 1:2, так что плотность клеток составляет приблизительно 3-5×10⁶ клеток/мл. После расщепления клетки могут быть трансфицированы тремя плазмидами, которые включают в себя (1) плазмиду-помощника, способную обеспечить одну или несколько функций вирусного помощника, необходимых для производства AAV, (2) плазмиду, которая кодирует один или несколько генов, участвующих в получении капсида, репликации и упаковке вируса, и (3) плазмиду, содержащую представляющий интерес ген (GOI), который должен быть упакован в полученную частицу rAAV. Например, GOI может представлять собой векторную ДНК, содержащую человеческий фактор свертывания крови IX Падуя в одноцепочечной самокомплементарной форме, с векторной ДНК, имеющей полную длину 2,6 т.п.н. В качестве другого примера, GOI может представлять собой векторную ДНК, содержащую человеческий фактор свертывания крови IX Падуя в двухцепочечной самокомплементарной форме, причем векторная ДНК характеризуется полной длиной 4,8 т.п.н. В качестве другого примера, GOI может представлять собой векторную ДНК, содержащую фактор VIII свертывания крови человека с удаленным В-доменом в одноцепочечной самокомплементарной форме, причем векторная ДНК имеет полную длину 4,8 т.п.н. Могут применяться другие GOI. Трансфекция может быть осуществлена переходным способом, например, с использованием катионных полимеров. Перед элюированием клеточную линию HEK293 можно культивировать в течение по меньшей мере приблизительно 3 дней, например, 3-5 дней, до сбора.

Дополнительные стадии

Способы по настоящему раскрытию содержат любую комбинацию стадий, раскрытых в настоящем документе, и могут необязательно комбинироваться с одной или несколькими дополнительными стадиями. Соответственно, согласно иллюстративным аспектам способы настоящего раскрытия дополнительно предусматривают стадию трансфекции клеток-хозяев тройной плазмидной системой, как описано в настоящем документе. Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему изобретению предусматривают сбор супернатанта из клеточной культуры, содержащей клетки-хозяева, например, клетки HEK293 или Sf9 (например, клетки Sf9, инфицированные бакуловирусом), трансфицированные тройной плазмидной системой. Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию предусматривают сбор супернатанта через приблизительно 3-5 дней после трансфекции клеток HEK293 или когда клеточная культура характеризуется плотностью клеток более чем или приблизительно 5×10⁶ клеток/мл и жизнеспособность клеток составляет более чем 50%. Согласно определенным вариантам осуществления AAV получают посредством разрушения клеток. Согласно иллюстративным аспектам стадия трансфекции и сбора происходит перед описанной в настоящем документе стадией ультрацентрифугирования. Способы по настоящему изобретению могут содержать еще другие дополнительные стадии, которые могут дополнительно повысить чистоту AAV и удалить другие нежелательные компоненты и/или сконцентрировать фракцию, и/или подготовить фракцию для последующей стадии. Дополнительные стадии могут происходить до или после описанной выше стадии ультрацентрифугирования.

Согласно иллюстративным аспектам способ предусматривает стадию глубинной фильтрации. Согласно иллюстративным аспектам способ предусматривает подвергание фракции супернатанта трансфицированной клеточной культуры HEK293 глубинной фильтрации с использованием фильтра, содержащего целлюлозу и перлиты и характеризующегося минимальной проницаемостью приблизительно 500 л/м². Согласно иллюстративным аспектам способ дополнительно предусматривает применение фильтра с минимальным размером пор приблизительно 0,2 мкм. Согласно иллюстративным аспектам глубинная фильтрация сопровождается фильтрацией через фильтр, характеризующийся минимальным размером пор приблизительно 0,2 мкм. Согласно иллюстративным аспектам один или оба из глубинного фильтра и фильтра, характеризующегося минимальным размером пор приблизительно 0,2 мкм, промывают и промывки собирают. Согласно иллюстративным аспектам промывки объединяют вместе и объединяют с фильтратом, полученным после глубинной фильтрации и фильтрации с фильтром, характеризующимся минимальный размером пор приблизительно 0,2 мкм. В примере 2 представлен иллюстративный способ глубинной фильтрации и фильтрации через фильтр с минимальным размером пор приблизительно 0,2 мкм. Согласно иллюстративным аспектам стадия глубинной фильтрации и другая стадия фильтрации происходят до описанной в настоящем документе стадии ультрацентрифугирования.

Согласно некоторым вариантам осуществления сбор проводят следующим образом: супернатант культуры клеток собирают в это время посредством глубинной фильтрации, например, путем фильтрации от приблизительно 150 до приблизительно 250 л AAV-содержащей клеточной суспензии через элемент глубинного фильтра и полиэфирсульфоновый элемент. Скорость потока может составлять от приблизительно 40 кг/час до приблизительно 280 кг/час или от приблизительно 60 кг/час до 240 кг/час. Общее давление составляет менее чем 1,7 бар. Два фильтра промывают от приблизительно 10 до приблизительно 30 л буфера с трис-буферным солевым раствором (TBS). Отфильтрованный ферментативный бульон или сбор собирают. Процедура глубинной фильтрации может удалить по меньшей мере 70% белка и 60% ДНК клеток HEK293, сохранив при этом по меньшей мере 60% из 65% частиц AAV.

Согласно некоторым вариантам осуществления сбор, содержащий фракцию AAV, подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (UF/DF) и TFF для концентрирования и кондиционирования сбора следующим образом: сбор концентрируют приблизительно в 10-20 раз до целевого объема от приблизительно 10 л до приблизительно 15 л с использованием TFF. Концентрированный сбор затем подвергают двум стадиям диафильтрации, чтобы довести концентрированный сбор до рН от приблизительно 8,3 до приблизительно 8,7 и проводимости от приблизительно 13 мСм/см до приблизительно 17 мСм/см. Каждая стадия диафильтрации может быть выполнена с помощью 5-кратного объемного обмена с диафильтрационным буфером, например, первый буфер содержит 50 мМ трис и 500 мМ NaCl, характеризуется рН 8,5±0,2 и температурой 25°С, а второй буфер содержит 50 мМ трис и 125 мМ NaCl, характеризуется рН 8,5±0,2 и температурой 25°С. Затем предпринимают TFF для концентрирования ретентата до конечного целевого объема от приблизительно 8 л до приблизительно 12 л. Затем концентрат фильтруют через фильтрующий элемент 0,2 мкм. Выход AAV может увеличиться путем промывки фильтрующего элемента приблизительно от 1,5 до 2,5 второго буфера для диафильтрации.

Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему изобретению предусматривают одну или несколько стадий хроматографии. Согласно иллюстративным аспектам способы предусматривают стадию отрицательной хроматографии, при которой нежелательные компоненты связываются с хроматографической смолой, а желательный AAV не связывается с хроматографической смолой. Согласно иллюстративным аспектам способы предусматривают стадию хроматографии с отрицательным анионным обменом (АЕХ) или стадию хроматографии АЕХ в «режиме без связывания». В примере 4 описана такая стадия. Соответственно, согласно иллюстративным вариантам осуществления способы очистки частиц AAV предусматривают выполнение хроматографии с отрицательным анионом (АЕХ) на фракции, содержащей частицы AAV, путем нанесения фракции на хроматографическую колонку АЕХ или мембрану в условиях, которые позволяют AAV проходить через хроматографическую колонку АЕХ или мембрану и сбор частиц AAV. Согласно иллюстративным аспектам фракцию наносят на хроматографическую колонку или мембрану АЕХ с помощью загрузочного буфера, содержащего от приблизительно 100 мМ до приблизительно 150 мМ соли, например, NaCl, необязательно, причем рН загрузочного буфера составляет от приблизительно 8 до приблизительно 9. В качестве примера, загрузочный буфер содержит от приблизительно 115 мМ до приблизительно 130 мМ соли, например, NaCl, необязательно, причем загрузочный буфер содержит от приблизительно 120 мМ до приблизительно 125 мМ соли, например, NaCl. Согласно иллюстративным аспектам стадия отрицательного АЕХ происходит до описанной в настоящем документе стадии ультрацентрифугирования.

Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию предусматривают концентрирование фракции AAV с использованием системы ультра/диафильтрации. Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию предусматривают еще одну стадию фильтрации в тангенциальном потоке (TFF). Согласно иллюстративным аспектам фракция AAV подвергается ультра/диафильтрации. Согласно иллюстративным аспектам фракцию AAV концентрируют в системе ультра/диафильтрации перед стадией, предусматривающей выполнение хроматографии с отрицательной АЕХ, после стадии, предусматривающей выполнение хроматографии с отрицательной АЕХ, или до и после включения выполнения хроматографии с отрицательной АЕХ. В примерах 3 и 5 описаны такие стадии TFF. Согласно иллюстративным аспектам стадии TFF происходят перед описанной в настоящем документе стадией ультрацентрифугирования.

Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительную стадию TFF выполняют после отрицательной АЕХ-хроматографии следующим образом: AAV-содержащую проточную фракцию, полученную из АЕХ-хроматографии, концентрируют и подвергают диафильтрации против буфера, например, содержащего приблизительно 500 мМ NaCl, приблизительно 50 мМ трис-HCl; при рН от приблизительно 8,3 до приблизительно 8,7, чтобы подготовить продукт для ультрацентрифугирования. Затем выполняют стадию TFF.

Согласно некоторым вариантам осуществления пустые и полные частицы AAV отделяют друг от друга ультрацентрифугированием по «протоколу двух сахароз» следующим образом. Концентрат, содержащий AAV, в буфере трис-HCl/NaCl, за которым следует первый раствор сахарозы, содержащий сахарозу в концентрации сахарозы 55% (в массовом отношении), а затем второй раствор сахарозы, содержащий сахарозу в концентрации сахарозы 60% (в массовом отношении). Согласно определенным вариантам осуществления раствор AAV содержит приблизительно 50 мМ трис-HCl и приблизительно 500 мМ NaCl. Согласно определенным вариантам осуществления раствор сахарозы содержит приблизительно 50 мМ трис-HCl и приблизительно 136 мМ NaCl. Ультрацентрифугирование сначала проводят при приблизительно 4000 об/мин при температуре 2-10°С, скорость вращения увеличивают от приблизительно 33000 об/мин до приблизительно 37000 об/мин, температуру увеличивают от приблизительно 20°С до приблизительно 25°С, а затем выдерживают в течение приблизительно 4 часов, от приблизительно 14 часов до приблизительно 20 часов или от приблизительно 16 часов до приблизительно 20 часов. Затем фракции собирают.

Согласно некоторым вариантам осуществления пустые и полные частицы AAV отделяют друг от друга ультрацентрифугированием по «протоколу двух Сахаров» следующим образом. Концентрат, содержащий AAV, и забуференный раствор этиленгликоля, содержащий 45-50% (в массовом отношении) этиленгликоля в буфере трис-HCl/NaCl, за которым следует первый раствор сахарозы, содержащий сахарозу в концентрации сахарозы 55% (в массовом отношении) и затем второй раствор сахарозы, содержащий сахарозу в концентрации сахарозы 60% (в массовом отношении). Согласно некоторым вариантам осуществления раствор AAV содержит приблизительно 55% этиленгликоля, приблизительно 50 мМ трис-HCl и приблизительно 750 мМ NaCl. Согласно определенным вариантам осуществления раствор сахарозы содержит приблизительно 50 мМ трис-HCl и приблизительно 136 мМ NaCl. Ультрацентрифугирование сначала проводят при приблизительно 4000 об/мин при температуре 2-10°С, скорость вращения увеличивают от приблизительно 33000 об/мин до приблизительно 37000 об/мин, температуру увеличивают от приблизительно 20°С до приблизительно 25°С, а затем выдерживают в течение приблизительно 4 часов, от приблизительно 14 часов до приблизительно 20 часов или от приблизительно 16 часов до приблизительно 20 часов. Затем фракции собирают.

Согласно некоторым вариантам осуществления пустые и полные частицы AAV отделяют друг от друга ультрацентрифугированием по «протоколу трех сахаров» следующим образом. Концентрат, содержащий AAV в буфере трис-HCl/NaCl, за которым следует первый раствор сахарозы, содержащий сахарозу в концентрации сахарозы 50% (в массовом отношении), второй раствор сахарозы, содержащий сахарозу в концентрации сахарозы 55% (в массовом отношении), и третий раствор сахарозы, содержащий сахарозу в концентрации сахарозы 60% (в массовом отношении). Первый раствор сахарозы загружают в нижнюю часть ротора; затем второй раствор сахарозы и третий раствор сахарозы. Согласно определенным вариантам осуществления раствор AAV содержит приблизительно 50 мМ трис-HCl и приблизительно 500 мМ NaCl. Согласно определенным вариантам осуществления раствор сахарозы содержит приблизительно 50 мМ трис-HCl и приблизительно 136 мМ NaCl. Ультрацентрифугирование сначала проводят при приблизительно 4000 об/мин при температуре 2-10°С, скорость вращения увеличивают от приблизительно 33000 об/мин до приблизительно 37000 об/мин, температуру увеличивают от приблизительно 20°С до приблизительно 25°С, а затем выдерживают в течение от приблизительно 3 часов до приблизительно 6 часов, от приблизительно 4 часов, от приблизительно 14 часов до приблизительно 20 часов или от приблизительно 16 часов до приблизительно 20 часов. Затем фракции собирают.

Согласно некоторым вариантам осуществления пустые и полные частицы AAV отделяют друг от друга ультрацентрифугированием по «протоколу трех сахароз» следующим образом. Концентрат, содержащий AAV, и забуференный раствор этиленгликоля, содержащий 45-50% (в массовом отношении) этиленгликоля в буфере трис-HCl/NaCl, за которым следует первый раствор сахарозы, содержащий сахарозу в концентрации сахарозы 50% (в массовом отношении), второй раствор сахарозы, содержащий сахарозу в концентрации сахарозы 55% (в массовом отношении), и третий раствор сахарозы, содержащий сахарозу в концентрации сахарозы 60% (в массовом отношении). Первый раствор сахарозы загружают в нижнюю часть ротора; затем второй раствор сахарозы и третий раствор сахарозы. Согласно некоторым вариантам осуществления раствор AAV содержит приблизительно 55% этиленгликоля, приблизительно 50 мМ трис-HCl и приблизительно 750 мМ NaCl. Согласно определенным вариантам осуществления раствор сахарозы содержит приблизительно 50 мМ трис-HCl и приблизительно 136 мМ NaCl. Ультрацентрифугирование сначала проводят при приблизительно 4000 об/мин при температуре 2-10°С, скорость вращения увеличивают от приблизительно 33000 об/мин до приблизительно 37000 об/мин, температуру увеличивают от приблизительно 20°С до приблизительно 25°С, а затем выдерживают в течение приблизительно от 3 часов до приблизительно 6 часов, от приблизительно 4 часов, от приблизительно 14 часов до приблизительно 20 часов или от приблизительно 16 часов до приблизительно 20 часов. Затем фракции собирают.

Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию предусматривают обработку фракции, содержащей частицы AAV, растворителем-детергентом для инактивации вирусов с липидной оболочкой. В примере 8 описан иллюстративный способ инактивации вируса с липидной оболочкой. Согласно иллюстративным аспектам стадия обработки растворителем-детергентом происходит после стадии ультрацентрифугирования, описанной в настоящем документе.

Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему изобретению предусматривают фильтрацию фракции, содержащей частицы rAAV, для удаления вирусов большего размера, чем частицы rAAV во фракции. Согласно иллюстративным аспектам способ по настоящему изобретению предусматривает фильтрацию фракции, содержащей AAV, для удаления вирусов размером более чем или приблизительно 35 нм. Согласно иллюстративным аспектам размер пор фильтра находится в нанометровом диапазоне, и согласно иллюстративным аспектам способ предусматривает нанофильтрацию. Согласно иллюстративным аспектам способ по настоящему раскрытию предусматривает применение нанофильтра с размером пор в диапазоне 35 нм ± 2 нм, как определено способом потока воды. Иллюстративный нанофильтр с таким размером пор содержит пучки микропористых полых волокон, сконструированных из природной гидрофильной регенерированной целлюлозы купраммония. Классификация типа фильтра зависит от структуры мембраны, материала и поставщика. Согласно иллюстративным аспектам нанофильтр исследуют с помощью теста на утечку целостности, чтобы подтвердить, что фильтр не содержит точечных отверстий или крупных дефектов, и предварительно промывают буфером для состава.

Иллюстративная нанофильтрация описана в настоящем документе как пример 10.

Согласно иллюстративным аспектам фракцию, содержащую частицы rAAV, например, анионообменный элюат, предварительно разводят элюирующим буфером (PBS + 600 мМ NaCl) для регуляции концентрации вирусных частиц.

Согласно иллюстративным аспектам во время стадии фильтрации поддерживают разность давлений на фильтре. Согласно иллюстративным аспектам давление (перепад давления на фильтре) составляет от приблизительно 0,02 МПа до приблизительно 0,1 МПа. Согласно иллюстративным аспектам давление (например, перепад давления на фильтре) составляет от приблизительно 0,02 МПа до приблизительно 0,08 МПа. В случае, когда фильтр работает в тупиковом режиме, на перепад давления может влиять давление подачи подаваемого образца (то есть путем настройки насоса на определенный поток, который влияет на давление подачи). Согласно иллюстративным аспектам фильтрация проводится при постоянном давлении, не превышающем 0,1 МПа, в тупиковом режиме через нанофильтр. Согласно иллюстративным аспектам фильтр запускается способом тангенциального потока. Согласно иллюстративным аспектам выход выделенных вирусных частиц повышается путем последующей промывки нанофильтра буфером (например, буфером для препарата). Согласно иллюстративным аспектам испытание после целостности нанофильтра выполняется с помощью теста на утечку и/или теста с частицами золота, чтобы определить, что распределение пор по размерам нанофильтра не изменяется и что нанофильтр сохраняет свою целостность во время фильтрации. Согласно иллюстративным аспектам более 50 л раствора наносится на м² площади фильтра для увеличения выхода пробы.

Согласно иллюстративным аспектам стадия фильтрации для удаления вирусов, больших, чем частицы rAAV, происходит один раз во время процесса настоящего раскрытия. Согласно иллюстративным аспектам стадия фильтрации происходит дважды во время процесса. Согласно иллюстративным аспектам стадия фильтрации для удаления вирусов, больших, чем частицы rAAV, происходит после стадии ультрацентрифугирования, описанной в настоящем документе. Согласно иллюстративным аспектам стадия фильтрации для удаления вирусов, больших, чем частицы rAAV, происходит после стадии завершающей очистки.

Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему изобретению предусматривают стадию завершающей очистки, включающую в себя проведение АЕХ-хроматографии, необязательно с колонкой, содержащей гель типа «щупальца». В примере 8 описан иллюстративный способ, предусматривающий такую стадию завершающей очистки. Согласно иллюстративным аспектам стадия завершающей очистки происходит после стадии ультрацентрифугирования, описанного в настоящем документе.

Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию предусматривают одну или несколько стадий контроля качества, например, стадий для измерения эффективности. Отношение ДНК/AAV или удельная активность фракций AAV, полученных после одной или нескольких стадий (например, после каждой стадии) процесса. Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию предусматривают анализ на наличие AAV во фракциях с использованием кПЦР, например кПЦР ITR. кПЦР ITR представляет собой количественный анализ на основе ПНР для измерения количества нуклеиновой кислоты с инвертированным концевым повтором (ITR) AAV во фракции. Другие AAV-специфические или AAV8-специфические последовательности можно анализировать с помощью кПЦР.

Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему изобретению предусматривают анализ наличия AAV во фракциях с использованием ИФА. Согласно иллюстративным аспектам ИФА представляет собой сэндвич-ИФА. Согласно иллюстративным аспектам сэндвич-ИФА содержит антитело, специфическое к эпитопу AAV. Согласно иллюстративным аспектам эпитоп AAV представляет собой конформационный эпитоп, присутствующий на собранных капсидах AAV. Подходящий способ исследования соотношения ДНК/AAV описан в настоящем документе как пример 12. Как обсуждалось в настоящем документе, ИФА может заменить кПЦР в качестве способа определения эффективности фракции AAV. Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию предусматривают исследование фракции AAV с помощью AAV-специфического ИФА, и способы не предусматривают способ измерения эффективности посредством количественной ПЦР. Согласно иллюстративным аспектам AAV-специфический ИФА является достаточным для обеспечения репрезентативного прочтения активности фракции AAV, поскольку большинство капсидов во фракции AAV представляют собой полные капсиды.

Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию предусматривают специфический для AAV ИФА после одной или нескольких стадий по настоящему раскрытию. Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию предусматривают исследование фракции AAV, полученной после ультрацентрифугирования, с помощью AAV-специфического ИФА для определения отношения ДНК/AAV из AAV в этой фракции. Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию предусматривают исследование фракции AAV, полученной после глубокой фильтрации, с помощью AAV-специфического ИФА для определения соотношения ДНК/AAV из AAV в этой фракции. Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию предусматривают исследование фракции AAV, полученной после концентрирования фракции AAV, с использованием системы ультра-/диафильтрации с помощью AAV-специфического ИФА для определения отношения ДНК/AAV из AAV в этой фракции. Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию предусматривают исследование фракции AAV, полученной после стадии фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), посредством AAV-специфического ИФА для определения отношения ДНК/AAV из AAV в этой фракции. Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию предусматривают исследование фракции AAV, полученной после хроматографии с отрицательным анионным обменом (АЕХ), с помощью AAV-специфического ИФА для определения отношения ДНК/AAV из AAV в этой фракции. Согласно иллюстративным аспектам способы по настоящему раскрытию предусматривают исследование фракции AAV, полученной после стадии завершающей очистки, с помощью AAV-специфического ИФА для определения отношения ДНК/AAV из AAV в этой фракции.

Согласно иллюстративным аспектам способ по настоящему раскрытию предусматривает одну или комбинацию стадий, проиллюстрированных на фиг. 1. Согласно иллюстративным аспектам способ по настоящему раскрытию предусматривает все стадии, проиллюстрированные на фиг. 1.

AAV-продукт, полученный способом по настоящему раскрытию, дополнительно представлен в настоящем документе. Согласно иллюстративным аспектам продукт AAV содержит по меньшей мере приблизительно 10¹² вирусных частиц (vp), полученных из приблизительно 1000 л исходного материала (например, клеточной культуры), или по меньшей мере приблизительно 10¹³ вирусных частиц (vp), полученных из приблизительно 1000 л исходного материала (например, клеточной культуры), и причем по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55% капсидов AAV, присутствующих в продукте AAV, представляют собой полные капсиды AAV. Согласно иллюстративным аспектам продукт AAV по настоящему изобретению является высокочистым, высокоэффективным и пригодным для клинического применения у людей. Согласно иллюстративным аспектам продукт AAV содержит частицы AAV гомогенной популяции и высокой чистоты. Согласно иллюстративным аспектам продукт AAV содержит полноразмерную векторную ДНК. Согласно иллюстративным вариантам осуществления продукт AAV по существу не содержит нежелательных загрязняющих веществ, включая в себя, без ограничения, частицы AAV, содержащие усеченную или неполную векторную ДНК, частицы AAV с неполной белковой композицией и олигомеризованные структуры или загрязняющие вирусы, например, не AAV вирусы с липидной оболочкой. Согласно иллюстративным вариантам осуществления продукт AAV содержит большое количество кодирующей кДНК представляющего интерес белка. Согласно иллюстративным аспектам продукт AAV по настоящему изобретению подходит для введения человеку. Согласно иллюстративным аспектам продукт AAV является стерильным и/или имеет класс надлежащей производственной практики (GMP). Согласно иллюстративным аспектам продукт AAV соответствует требованиям, изложенным в главе 1046 Фармакопеи США или Европейской фармакопеи по лекарственным средствам для генной терапии или соответствует требованиям Управления по контролю за продуктами и лекарственными средствами США (USFDA) или Европейского агентства по лекарственным средствам (ЕМА). Согласно иллюстративным аспектам продукт AAV представляет собой готовый к применению продукт для непосредственного введения человеку практически без обработки.

Следующие примеры представлены просто для иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения его объема.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

В следующем примере описан иллюстративный способ трансфекции клеточной линии HEK293 тройной плазмидной системой для получения частиц rAAV, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес белок.

Прикрепленные клетки HEK293 выращивают в условиях суспензии в коммерчески доступной культуральной среде, которая характеризуется химически определенным составом и не содержит компонентов животного происхождения, белка и сыворотки. Клетки культивируют до плотности клеток приблизительно 6-10×10⁶ клеток/мл. Перед трансфекцией проводят разделение приблизительно 1:2 для достижения плотности клеток приблизительно 3-5×10⁶ клеток/мл.

Клетки трансфицируют тремя плазмидами: (1) плазмидой-помощником, которая обеспечивает вспомогательные вирусные функции, необходимые для продуктивной инфекции AAV, (2) repcap-плазмидой, которая несет всю информацию, касающуюся образования капсида, репликации и упаковки вируса, и (3) плазмидой, содержащей представляющий интерес ген (GOI), который упакован в полученную частицу rAAV. Например, GOI может представлять собой векторную ДНК Падуи фактора IX (одноцепочечную (~2,6 т.п.н.) или двухцепочечную (~4,8 т.п.н.)) или одноцепочечную векторную ДНК фактора VIII (~4,8 т.п.н.).

Временную трансфекцию клеток НЕК293 осуществляют с использованием катионного полимера полиэтиленимина (PEI). Вкратце, PEI и плазмидную ДНК инкубируют в течение более чем 10 минут при температуре от 4 до 37°С до смешивания смеси для трансфекции с клеточной культурой, чтобы имело место предварительное образование PEI и плазмидной ДНК. Предварительно образованные комплексы добавляют к клеточной культуре вместе со смесью для трансфекции и инкубируют в течение приблизительно 3-4 часов при температуре от 30°С до 40°С, например, приблизительно 37°С. Трансфекцию останавливают добавлением в трансфицированную культуру известной стоп-среды, содержащей, например, среду, например, Hyclone™ CDM4HEK293, среду с химически определенным составом для культивирования клеток без животных компонентов и белков, включая в себя 0,6 г/л глутамина.

Частицы rAAV, несущие GOI, находятся в клеточной линии HEK293 в течение 3-5 дней после трансфекции. Как показано на фиг. 2 и 3, клеточная культура HEK293 демонстрирует высокую плотность клеток (например, более чем приблизительно 5×10⁶ клеток/мл) с жизнеспособностью >50% в то время, которое составляет приблизительно 5 дней после трансфекции.

Пример 2

В следующем примере описан иллюстративный способ сбора супернатанта трансфицированной культуры клеток HEK293.

Как обсуждалось в примере 1, производство rAAV происходит в течение первых 3-5 дней после трансфекции. По истечении этого периода времени культура клеток HEK293 демонстрирует высокую плотность клеток (например, более чем приблизительно 5×10⁶ клеток/мл) с жизнеспособностью >50%. Супернатант клеточной культуры собирали в это время с помощью глубинной фильтрации. Частицы AAV отделяли от клеток и клеточного дебриса путем фильтрации приблизительно 200 л (±20 л) AAV-содержащей клеточной суспензии через глубинный фильтрующий элемент на основе целлюлозы (например, Pall, STAX K900P; 4 м²) и полиэфирсульфоновый фильтрующий элемент 0,2 мкм (PES) (например, Pall, ECV; 2×5 дюймов, параллельно). Типичная скорость потока через фильтры составляла 160±100 кг/час, а общее давление было <1,7 бар. Два фильтра промывали приблизительно 10-30 л трис-буферным солевым буфером (TBS) (20 мМ Трис, 8 г/л NaCl, рН 7,4±0,2 при температуре 25°С). Вместе с промывкой фильтра отфильтрованный ферментативный бульон собирают в мешок объемом 500 л и называют сбором. Параметры стадии сбора и характеристика сбора (выхода) после стадии сбора представлены в таблицах 1 и 2, соответственно. На фиг. 4 представлена непрерывная запись давления и скорости потока на стадии сбора.

Как показано выше в таблице 2, более чем 70% белка и более чем 62% ДНК HEK, обнаруженных в клеточной суспензии до фильтрации, удалялись на этой стадии фильтрации. Количество нуклеиновой кислоты AAV с инвертированным концевым повтором (ITR) в объединенной фракции, содержащей сбор и промывку фильтра (Р), измеренные с помощью количественной ПЦР (кПЦР), составляло приблизительно половину от количества, обнаруженного в суспензии клеток до фильтрации. Кроме того, по данным ИФА, более чем 65% AAV суспензии клеток предварительной фильтрации сохранялось при фильтрации.

Пример 3

В следующем примере описан иллюстративный способ концентрирования и кондиционирования сбора с помощью системы фильтрации с тангенциальным потоком (TFF) ультрафильтрации/диафильтрации (UF/DF).

Сбор, полученный в примере 2, подвергали системе UF/DF TFF для концентрирования и кондиционирования сбора. На первой стадии сбор концентрировали приблизительно в 16 раз до целевого объема 12 л с помощью TFF с использованием мембран 3×0,5 м² Omega Centramate серии Pall 100 кДа (номер детали: OS100T06). Концентрированный сбор затем подвергали двум стадиям диафильтрации, чтобы уменьшить компоненты среды и довести концентрированный сбор до рН 8,5 и проводимости 15 мСм/см. Первую стадию диафильтрации осуществляли посредством 5-кратного объемного обмена с буфером 1 для диафильтрации (DB1: 50 мМ трис/500 мМ NaCl/pH 8,5±0,2 при температуре 25°С). Вторую стадию диафильтрации проводили с помощью 5-кратного объемного обмена с буфером 2 для диафильтрации (DB2: 50 мМ трис/125 мМ NaCl/pH 8,5±0,2 при температуре 25°С). Каждую стадию диафильтрации проводили с использованием мембран Omega Centramate серии Pall серии Т размером 3×0,5 м² 100 кДа (номер детали: OS100T06). После второй стадии диафильтрации ретентат концентрировали до конечного целевого объема 10 л с помощью TFF, как описано выше. Затем 10 л концентрата фильтровали через фильтрующий элемент 0,2 мкм (5 дюймов, фильтр Pall ECV, номер детали: NP5LUECVP1S). Чтобы увеличить выход AAV8, мембраны UF/DF, система UF/DF и фильтр 0,2 мкм промывали приблизительно 2 л DB2. Ретентат и промывочный фильтр собирали и смешивали в мешке, чтобы подготовить его к последующей стадии захвата. На фиг. 7 показаны промежуточные стадии TFF в окрашивании серебром (слева) и вестерн-блоттинге (справа). Параметры стадий UF/DF TFF и характеристика полученного кондиционированного концентрата [стадий UF/DF TFF] приведены в таблицах 3 и 4, соответственно.

Описание окрашивания серебром

NuPAGE 4-12% бис-трис миди гель 1,0 мм, 20 лунок, № в каталоге WG1402BX10

Подвижный буфер MES SDS, Invitrogen, № в каталоге NP0002

Инкубация SB + DTT 10 мин при 70°С, 10 мин охлаждение JAA.

Описание вестерн-блоттинга

NuPAGE 4-12% бис-трис миди гель 1,0 мм, 20 лунок, № в каталоге WG1402BX10

Подвижный буфер MES SDS, Invitrogen, № в каталоге NP0002

Инкубация SB + DTT 10 мин при 70°С, 10 мин охлаждение JAA.

1-е антитело: моноклональное антитело к VP1, VP2 и VP3 AAV (аденоассоциированный вирус)

Аффинная хроматография белка А

PROGEN61058

2-е антитело: GOAT к мышиному ALP

SIGMA А4656 1:2000 1 ч

Как показано в таблице 4, объем полученного кондиционированного концентрата составлял приблизительно 6% от первоначального объема, однако процентное содержание AAV в концентрате составляло 74%, как измерено способом ИФА.

Пример 4

Этот пример демонстрирует иллюстративный способ отрицательной хроматографии с анионообменником.

После концентрирования и диафильтрации сбора с помощью TFF, как описано в примере 3, буфер, содержащий AAV, кондиционируют до 125 мМ NaCl/50 мМ трис-HCl/рН 8,5 для отрицательной хроматографии с использованием мембраны анионообменника Mustang (№ в каталоге Pall XT5000MSTGQP1). При этом условии AAV не связывается с мембраной анионита и вместо этого протекает через колонку. После загрузки колонки два полных объема (равных 2-кратному количеству мембранной капсулы) промывочного буфера (125 мМ NaCl/50 мМ трис-HCl; рН 8,5) использовали для вымывания любого количества несвязанных AAV8 из колонки. На фиг. 5 представлена хроматограмма потока через продукт хроматографии АЕХ Mustang Q в отрицательном (не связывающем) режиме. Элюирование проводили для изучения связанных белков. В таблице 5 подробно представлена схема стадий отрицательной хроматографии, а в таблице 6 - выход.

Как показано в таблице 6, стадия отрицательной хроматографии успешно удаляла значительное количество общего белка, сохраняя при этом значительное количество AAV. Это повышение чистоты также проиллюстрировано окрашиванием серебром и вестерн-блоттингом на фиг. 6. Проточная фракция составляла приблизительно 65% от исходного количества AAV, тогда как в элюированной фракции присутствовало менее чем 6% AAV. Кроме того, общее количество белка в проточной фракции было значительно снижено. Только приблизительно 34% общего белка осталось во фракции FT.

Описание серебряного окрашивания

NuPAGE 4-12% бис-трис миди гель 1,0 мм, 20 лунок, № в каталоге WG1402BX10

Подвижный буфер MES SDS, Invitrogen, № в каталоге NP0002

Инкубация SB + DTT 10 мин при температуре 70°С, 10 мин охлаждение JAA.

Описание вестерн-блоттинга

NuPAGE 4-12% бис-трис миди гель 1,0 мм, 20 лунок, № в каталоге WG1402BX10

Подвижный буфер MES SDS, Invitrogen, № в каталоге NP0002

Инкубация SB + DTT 10 мин при температуре 70°С, 10 мин охлаждение JAA.

1-е антитело: моноклональное антитело к VP1, VP2 и VP3 AAV (аденоассоциированный вирус)

Аффинная хроматография белка А

PROGEN61058

2-е антитело: GOAT к мышиному ALP

SIGMA А4656 1:2000 1 ч

Пример 5

Этот пример демонстрирует иллюстративный способ второй стадии TFF.

AAV8-содержащую проточную фракцию (FT), полученную с помощью отрицательной хроматографии (пример 4), концентрировали и подвергали диафильтрации против диафильтрационного буфера (DB1), содержащего 500 мМ NaCl/50 мМ трис-HCl; рН 8,5, чтобы подготовить продукт для следующей стадии ультрацентрифугирования (UC) (например, пример 6, 7, 9, 14 или 16). Вторую стадию TFF (TFF2) выполняли с использованием мембран 4×0,1 м² Omega Centramate серии Pall Т 100 кДа (4× Pall, № в каталоге: OS100T12) и UF/DF-системы Pall СМ500. После ультрацентрифугирования/диафильтрации продукт концентрировали до целевого объема 1200 мл и сливали из системы. Для увеличения выхода AAV8 мембрану и систему UF/DF затем промывали приблизительно 400 мл буфера для диафильтрации (10-минутная рециркуляция на стороне ретентата при давлении подачи 1 бар). Промывку мембраны и концентрированный продукт объединяли и фильтровали с использованием фильтра 0,2 мкм (PALL № в каталоге: KA02EAVP2S) для уменьшения бионагрузки. В таблице 7 детально представлена схема TFF2, а в таблице 8 детально представлен выход этой стадии.

Как показано в таблице 8, стадия TFF2 успешно уменьшила объем приблизительно до 7,5% от первоначального объема (объема загрузки), сохранив при этом 88% исходного AAV.

Пример 6

Этот пример демонстрирует иллюстративный способ отделения пустых частиц AAV от полных ультрацентрифугированием с использованием 50% (в массовом отношении) забуференного раствора этиленгликоля и 50% (в массовом отношении) градиента сахарозы. На этой стадии дополнительно удаляют белки клетки-хозяина (например, HSP70). На этой стадии также удаляют связанные с продуктом примеси, такие как «пустые капсиды» и белки клеток-хозяев, такие как HSP70 и LDH.

50% (в массовом отношении) забуференный этиленгликолем раствор в 50 мМ трис-HCl/750 мМ NaCl при рН 8,0, содержащий образец AAV8, содержащий векторную ДНК человеческого фактора свертывания крови IX Падуи в одноцепочечной самокомплементарной форме (2,6 т.п.н.), загружали в ультрацентрифугу (UC), с последующей загрузкой двух разных растворов сахарозы, которые различаются по концентрации сахарозы. Раствор сахарозы, загруженный в UC, сначала характеризовался концентрацией сахарозы 55%. Раствор сахарозы, загруженный в UC сразу после первого раствора сахарозы, характеризовался концентрацией сахарозы 60%. Соотношение загруженного образца и градиента сахарозы составляет 1:1, а растворы сахарозы характеризовались равными объемами. Общий объем сердечника составляет 1600 мл.

Один килограмм забуференного раствора сахарозы с концентрацией сахарозы 55% готовили смешиванием 2,42 г трис(гидроксиметил)аминометана (трометамола) с 8,00 г хлорида натрия и 550,00 г сахарозы. WFI добавляли к 1 кг, используя 1 М NaOH и 25% HCl, чтобы откорректировать рН при необходимости. WFI затем добавляли к 1 кг.

Один килограмм забуференного раствора сахарозы с концентрацией сахарозы 60% готовили смешиванием 2,42 г трис(гидроксиметил)аминометана (трометамола) с 8,00 г хлорида натрия и 600,00 г сахарозы. WFI добавляли к 1 кг, используя 1 М NaOH и 25% HCl, чтобы откорректировать рН при необходимости. WFI затем добавляли к 1 кг.

Градиент плотности образуется во время первой фазы UC, в которой скорость вращения устанавливали на 4000 об/мин, а температуру поддерживали на уровне 2-10°С. После первой фазы скорость вращения увеличивали до 35000 об/мин, а температуру увеличивали до 22°С. Во время этой второй фазы при более высокой скорости и температуре полные частицы AAV отделялись от пустых капсидов. Через 20 часов ультрацентрифугу останавливали и собирали фракции, содержащие большинство полных частиц AAV. Дополнительные подробности, относящиеся к выполненной стадии UC, включая подробности о входных параметрах для построения градиента, сбора фракции, содержащей полные частицы, скорости элюирования и т.д., представлены ниже в таблице 9.

Результаты показаны на фиг. 17, на которой пустые капсиды (во фракции 15) отделяются от полных капсидов (во фракции 11).

На фиг. 18 показаны результаты проведения четырех различных анализов для каждой из фракций, показанных на фиг. 17. кПЦР относится к количественной ПЦР ITR AAV8 (ITR-кПЦР). AAV8:AG относится к анализу ИФА против антигена AAV8. WAX% относится к проценту полных капсидов, количественно определяемых по слабому анионному обмену. Отношение ДНК/AAV (иногда упоминаемое в настоящем документе как Spec. Act. или специфическая активность) относится к отношению общих векторных геномов (ITR-кПЦР) к общему количеству частиц rAAV8 (AAV8:AG), которое дает указание как на долю ДНК-содержащих капсидов, а также полных капсидов. Более высокое отношение ДНК/AAV коррелирует с большим количеством полных капсидов. Переход от полных капсидов к пустым виден по резкому снижению Spec. Act. от фракции 13 к фракции 15. Значения для каждого анализа нормировали друг к другу, как показано осью Y.

Пример 7

Этот пример демонстрирует иллюстративный способ отделения пустых частиц AAV от полных ультрацентрифугированием с использованием градиента сахарозы. На этой стадии дополнительно удаляли белки клетки-хозяина (например, HSP70). Примеси, связанные с продуктом, такие как «пустые капсиды» (как определено выше), также удаляли на этой стадии.

Концентрированную фракцию, содержащую векторную ДНК, содержащую одноцепочечную ДНК, кодирующую фактор VIII коагуляции человека с делецией В-домена, полученный с помощью TFF2 из примера 5, загружали в ультрацентрифугу (UC) с последующим добавлением трех разных растворов сахарозы, которые различаются по концентрации сахарозы. Раствор сахарозы, загруженный в UC, сначала характеризовался концентрацией сахарозы 50%. Раствор сахарозы, загруженный в UC сразу после первого раствора сахарозы, характеризовался концентрацией сахарозы 55%, и раствор сахарозы, загруженный в UC последним, характеризовался концентрацией сахарозы 60%.

Один килограмм забуференного раствора сахарозы с 50%-ной концентрацией сахарозы готовили смешиванием 2,42 г трис(гидроксиметил)аминометана (трометамола) с 8,00 г хлорида натрия и 500,00 г сахарозы. WFI добавляли к 1 кг, используя 1 М NaOH и 25% HCl, чтобы откорректировать рН при необходимости. WFI затем добавляли к 1 кг.

Один килограмм забуференного раствора сахарозы с концентрацией сахарозы 55% готовили путем смешивания 2,42 г трис(гидроксиметил)аминометана (трометамола) с 8,00 г хлорида натрия и 550,00 г сахарозы. WFI добавляли к 1 кг, используя 1 М NaOH и 25% HCl, чтобы откорректировать рН при необходимости. WFI затем добавляли к 1 кг.

Один килограмм забуференного раствора сахарозы с концентрацией сахарозы 60% готовили путем смешивания 2,42 г трис(гидроксиметил)аминометана (трометамола) с 8,00 г хлорида натрия и 600,00 г сахарозы. WFI добавляли к 1 кг, используя 1 М NaOH и 25% HCl, чтобы откорректировать рН при необходимости. WFI затем добавляли к 1 кг.

Градиент плотности образовывали во время первой фазы UC, в которой скорость вращения устанавливали на 4000 об/мин, а температуру поддерживали на уровне 2-10°С. После первой фазы скорость вращения увеличивали до 35000 об/мин, а температуру увеличивали до 22°С. Во время этой второй фазы при более высокой скорости и температуре полные частицы AAV отделяли от пустых капсидов. Приблизительно через 5 часов ультрацентрифугу останавливали и собирали фракции, содержащие большинство полных частиц AAV. Дополнительные подробности, относящиеся к выполненной стадии UC, включая в себя подробности о входных параметрах для построения градиента, сбора фракции, содержащей полные частицы, скорости элюирования и тд., представлены ниже в таблицах 11 и 12.

Схема элюирования представлена на фиг. 8, а серебряное окрашивание и вестерн-блоты загрузки и отдельных фракций представлены на фиг. 9. Как показано в таблице 12, 82% частиц в пиковом пуле считаются полными частицами.

Описание серебряного окрашивания

NuPAGE 4-12% бис-трис миди гель 1,0 мм, 20 лунок, № в каталоге WG1402BX10

Подвижный буфер MES SDS, Invitrogen, № в каталоге NP0002

Инкубация SB + DTT 10 мин при температуре 70°С, 10 мин охлаждение JAA.

Описание вестерн-блоттинга

NuPAGE 4-12% бис-трис миди гель 1,0 мм, 20 лунок, № в каталоге WG1402BX10

Подвижный буфер MES SDS, Invitrogen, № в каталоге NP0002

Инкубация SB + DTT 10 мин при температуре 70°С, 10 мин охлаждение JAA.

1-е антитело: моноклональное антитело к VP1, VP2 и VP3 AAV (аденоассоциированный вирус)

Аффинная хроматография белка А

PROGEN61058

2-е антитело: GOAT к мышиному ALP

SIGMA А4656 1:2000 1 ч

Пример 8

Этот пример демонстрирует иллюстративный способ инактивации вирусов с липидной оболочкой и стадию завершающей очистки.

ААУ8-содержащие фракции, полученные на стадии UC в примере 7, объединяли и разводили 1:2,5 буфером для уравновешивания (50 мМ трис; рН 8,5±0,2). Проводили обработку растворителем-детергентом (0,3% три-н-бутилфосфат; 1,0% Triton Х100; 0,3% полисорбат 80). Проводимость растворителя впоследствии доводили до 3,6±0,2 мСм/см с дальнейшим разведением 1:2. Полученный раствор загружали в хроматографическую колонку, содержащую Fractogel® EMD ТМАЕ (М) (Merck-Millipore, № в каталоге: 116881), высота слоя 22 мм, 57 мм (Merck-Millipore Vantage VL 22×250. № в каталоге: 96220250), а затем промывали с уравновешивающим буфером (50 мМ трис, рН 8,5±0,2). Вторую стадию промывки проводили буфером (8,09 мМ Na₂HPO₄; 1,47 мМ KH₂PO₄; 2,68 мМ KCl; 5% сорбита). Элюирование в колонке проводили с градиентом NaCl 12 объемов колонки - из первого буфера для элюирования, содержащего 8,09 мМ Na₂HPO₄; 1,47 мМ KH₂PO₄; 2,68 мМ KCl; 5% сорбита к последнему элюирующему буферу, содержащему 8,09 мМ Na₂HPO₄, 1,47 мМ KH₂PO₄; 2,68 мМ KCl; 5% сорбит + 600 мМ NaCl. Основное количество AAV8 элюируется в виде отчетливого острого пика и собирается в виде Е2 (элюат2), который представляет собой очищенный продукт AAV8. В конце колонку десорбируют с 2М хлоридом натрия с последующей процедурой регенерации. В таблицах 13 и 14 подробно описаны эти стадии и выход, полученный после выполнения этих стадий. Фиг. 10 представляет собой завершающую очистку AAV8 на Fractogel ТМАЕ.

L Dil: представляет собой разведенный пул после ультрацентрифугирования перед воздействием SD и конечной степенью разведения; Е представляет собой элюат из колонки АЕХ; Bulk представляет собой разведенный 1:2 элюат из колонки АЕХ. Bulk представляет собой составленный продукт перед разведением до конечного продукта-лекарственного средства (FDP).

Пример 9

Этот пример демонстрирует иллюстративный способ очистки AAV от неочищенных фракций, предусматривающий стадию ультрацентрифугирования, во время которой образуется градиент плотности.

Фиг. 11 представляет собой схему стадий, выполняемых в иллюстративном способе. Стадию ультрацентрифугирования выполняли с использованием сердечника объемом 3,2 л (1,6 л продукта + 1,6 л градиента/буфер TBS).

Когда UC находится в состоянии покоя, исходный материал объемом 1,6 л (промежуточный продукт из предыдущей стадии процесса = UFB) загружали в ротор с постоянной скоростью потока 6 л/ч, а затем загружали 3 раствора сахарозы различной плотности. Растворы сахарозы загружали с постоянной скоростью потока 1,5 л/ч в следующем порядке: 800 мл 50% сахарозы, 400 мл 55% сахарозы и 400 мл 60% сахарозы.

Заполненный ротор ускоряли от 0 до 4000 об/мин, чтобы достичь зонального режима для построения градиента сахарозы с увеличением плотности, после чего следовало второе ускорение от 4000 до 35000 об/мин. UC работает со скоростью 35000 об/мин (приблизительно 90000 г-силы) в течение 5 часов. Как только конечная скорость была достигнута, температуру изменяли с +4°С до +22°С. Частицы AAV8, содержащиеся в исходном материале, перемещаются в градиент сахарозы до тех пор, пока они не достигнут точки, в которой их плотность совпадает с плотностью окружающего градиента. Поскольку полные и пустые капсиды различаются по своей плотности, эта функция используется для отделения полных и пустых вирусных капсидов. За один час до завершения стадии центрифугирования температуру вручную сдвигали с +22°С до +4°С. Остановка UC от 35000 до 0 об/мин выполнялась в 2 стадии: от 35000 до 4000 об/мин путем замедления и от 4000 об/мин до 0 об/мин, позволяя ротору постепенно останавливаться.

Продукт извлекали со скоростью потока 6 л/ч путем сбора фракций по 25 мл, а также фракции отхода в конце элюирования.

Сбор фракций по 25 мл каждая начинается с фракции 7 и заканчивается в начале пика отходов. Первый пик на фиг. 12 при более высокой плотности сахарозы представляет собой «полные капсиды». Второй пик представляет собой «в основном пустые капсиды».

Фракции с F10 по F14 объединяли и дополнительно очищали на Fractogel® EMD ТМАЕ (М) в качестве стандартных «полных капсидов» AAV8 таким же образом, как и другие фракции, содержащие AAV8. В таблице 15 приведены подробности стадии хроматографии ТМАЕ, а в таблице 16 приведены используемые буферы.

Приблизительно 25 мл одной фракции ультрацентрифугирования вносили отдельно в колонку ТМАЕ объемом 4 мл с разведением 1:2,5 уравновешивающим буфером 50 мМ трис, рН 8,5±0,2. После обработки растворителем в присутствии 0,3% три-н-бутилфосфата, 1% Triton Х-100 и 0,3% полисорбата 80 проводимость доводили до 3,6±0,2 мСм/см с последующим разведением 1:2, и содержащий AAV8 раствор вносили в хроматографическую колонку, содержащую Fractogel® EMD ТМАЕ (М) (Merck-Millipore, № в каталоге 116881) ID 10 мм, высота слоя 50 мм±5 мм (Merck-Millipore Vantage VL 10×250 или аналогичная) с последующей стадией первой промывки уравновешивающим буфером 50 мМ трис, рН 8,5±0,2 и стадией второй промывки 8,09 мМ Na₂HPO₄, 1,47 мМ КН₂РО₄, 2,68 мМ KCl, 5% сорбита, рН 7,4. Элюирование проводят градиентом 12 объемов колонки от 8,09 мМ Na₂HPO₄, 1,47 мМ KH₂PO₄, 2,68 мМ KCl, 5% сорбита, рН 7,4, до 8,09 мМ Na₂HPO₄, 1,47 мМ KH₂PO₄, 2,68 мМ KCl, 5% сорбита + 600 мМ NaCl, рН 7,4. Основное количество AAV8 элюирует в виде отчетливого острого пика и собирается в виде Е2 (элюат2), который представляет собой очищенный продукт AAV8. Полученный элюат Е2, содержащий AAV8 (элюат2), разводили 1:2 8,09 мМ Na₂HPO₄, 1,47 мМ KH₂PO₄, 2,68 мМ KCl, 5% сорбит + 600 мМ NaCl, рН 7,4 для доведения до матрицы буфера для состава (8,09 мМ Na₂HPO₄, 1,47 мМ KH₂PO₄, 2,68 мМ KCl, 5% сорбит + 350 мМ NaCl, рН 7,4). В конце колонку очищают 2 М хлоридом натрия с последующей процедурой регенерации. Хроматографическую систему помещали при температуре окружающей среды от +18°С до +25°С.

Фракции с 10 по 21 анализировали с помощью аналитического ультрацентрифугирования (AUC), а ДНК-анализ AAVS-векторов (содержащих двухцепочечный фактор IX Падуи (4,8 т.п.н.)) проводили с помощью электрофореза в нативном агарозном геле и электрофореза в щелочно-агарозном геле. На фиг. 13-16 показаны аналитические данные отдельных фракций, полученных с помощью UC после завершающей очистки на ТМАЕ. Фиг. 14 представляет собой фотографию агарозы с 1% нативом, а фиг. 15 представляет собой фотографию агарозы с 0,8% щелочью. Как показано на фиг. 15, объединенные фракции X10-Х 14 пика УФ, полученные при более высокой плотности сахарозы при ультрацентрифугировании, содержали высокочистую одиночную полосу ДНК без какого-либо дополнительного указания на меньшие варианты ДНК векторной ДНК.

Данные аналитического UC представлены в таблице 17.

Фракции №22, 23 и 24 не анализировали

Как показано в таблице 17, фракции 10-15 содержали самые высокие количества полных капсидов AAV. Хотя существенные количества полных капсидов обнаружены во фракциях 16 и 17, количества были немного меньше, и количество пустых капсидов увеличивается по сравнению с фракциями 10-15. Дальнейшее уменьшение количества полных капсидов и дальнейшее увеличение пустых капсидов наблюдали во фракциях 19 и 20.

На фиг. 16 показаны данные для одной BDS из указанных фракций UC. Эти результаты показывают гомогенный продукт AAV8 из фракции UC от 10 до 15 без обнаружения неполного содержания векторной ДНК в AUC и электрофореза в агарозном геле. Неполная векторная ДНК появляется из фракции 17 и обнаруживается в более поздних фракциях зоны «в основном пустых капсидов». Обнаружение неполных векторов было удивительным, потому что никто не ожидал получить такой широкий диапазон разрешения. Таким образом, разработанный способ разделения не ограничивается разделением капсидов, которые являются полностью пустыми (то есть без ДНК), и капсидов, являющихся «полными», но он неожиданно также позволяет отделить векторную ДНК различной длины, которая не может быть разделена друг от друга. Это также указывает на то, что существует значимое разделение «полных капсидов» от «пустых капсидов» независимо от длины ДНК в популяции «пустых капсидов». Другими словами, этот способ позволяет истощать пустые векторы (включая усеченную и неполную ДНК) для получения AAV с высоким содержанием полных капсидов AAV.

Пример 10

Этот способ описывает иллюстративный способ нанофильтрации для удаления вирусов, больших, чем AAV, и больших, чем размер пор применяемого нанофильтра.

Фильтр Asahi PLANOVA 35 нм, который содержит пучки микропористых полых волокон, изготовленных из натуральной гидрофильной регенерированной целлюлозы купраммония с узким диапазоном размеров пор 35 нм +/- 2 нм, исследуют с помощью теста на утечку целостности, чтобы убедитесь, что на фильтре отсутствуют отверстия или крупные дефекты, и предварительно промывают буфером для состава. Затем анионообменный элюат отбирают и фильтруют при постоянном давлении, не превышающем 0,1 МПа, в тупиковом режиме через нанофильтр. В качестве альтернативы фильтр может быть запущен также способом тангенциального потока. Анионообменный элюат может быть предварительно разведен элюирующим буфером (PBS + 600 мМ NaCl) для корректировки концентрации вирусных частиц. Чтобы извлечь все вирусные частицы, нанофильтр промывают буфером (например, буфером для состава). Исследование нанофильтра после исследования целостности выполняют с помощью теста на утечку и теста с частицами золота, чтобы доказать, что распределение пор по размерам нанофильтра не изменилось и нанофильтр сохранил свою целостность во время фильтрации. Чем выше загрузка образца, тем выше выход. Поэтому, как правило, применяется более 50 л раствора на м² площади фильтра.

Пример 11

Этот способ описывает иллюстративный способ нанофильтрации для удаления вирусов, больших, чем AAV, и больших, чем размер пор применяемого нанофильтра.

Фильтр Asahi PLANOVA 35 нм, который содержит пучки микропористых полых волокон, сконструированных из природной гидрофильной регенерированной целлюлозы купраммония с узким диапазоном размеров пор 35 нм +/- 2 нм, исследовали с помощью теста на утечку целостности, чтобы убедиться, что на фильтре отсутствуют отверстия или крупные дефекты, и предварительно промывали буфером для состава. Затем 4,05 мл объединенных фракций, содержащих 2870,98 мкг/мл AAV-8 (концентрация, определенная способом ИФА), сначала разводили в 4,05 буфера 1,47 мМ KH₂PO₄, 2,68 мМ KCl, 8,09 мМ Na₂HPO₄, 600 мМ NaCl и 5% сорбита при рН 7,4. Коэффициент разведения составлял 1:2. Затем 8,10 г первого разведения разводили в 61,57 г буфера из 1,47 мМ KH₂PO₄, 2,68 мМ KCl, 8,09 мМ Na₂HPO₄, 350 мМ NaCl и 5% сорбита при рН 7,4 с получением загрузочного буфера. Коэффициент разведения загрузочного буфера составлял 1:8,6 по сравнению с первым разведением и 1:17,2 по сравнению с объединенными фракциями.

Нанофильтр кондиционировали с помощью 25 мл буфера, содержащего 1,47 мМ KH₂PO₄, 2,68 мМ KCl, 8,09 мМ Na₂HPO₄, 350 мМ NaCl и 5% сорбита, при рН 7,4. Во время кондиционирования 10 мл буфера использовали для продувки фильтра без давления и с открытым выходным отверстием для ретентата. Затем приблизительно 15 мл буфера отфильтровывали через полые волокна, применяли постоянное давление 0,9 бар и закрывали выход ретентата.

Затем 9 мл промывочного буфера наносили на резервуар-накопитель при постоянном давлении 0,9 бар. Промывочный буфер содержал 1,47 мМ KH₂PO₄, 2,68 мМ KCl, 8,09 мМ Na₂HPO₄, 350 мМ NaCl и 5% сорбита при рН 7,4. Образцы отбирали после промывки. После отбора образцов 60 г вышеуказанного загрузочного буфера затем фильтровали при постоянном давлении 0,9 бар в тупиковом режиме через нанофильтр.

Данные фильтрации представлены в таблице 18 ниже. Выход AAV после фильтрации составляет не менее 77%.

Пример 12

В следующем примере описан иллюстративный способ исследования биоактивности продукта AAV8.

В анализе биоактивности in vitro вирусный вектор AAV8-FIX трансфицирует печеночную целевую клеточную линию, которая впоследствии секретирует функциональный, измеряемый белок FIX в среду.

На первой стадии целевые клетки HepG2 трансдуцируют AAV8-FIX. Во время инкубации FIX высвобождается в клеточный супернатант. На второй стадии активность фактора IX супернатанта клеточной культуры непосредственно измеряют с помощью хромогенного анализа FIX. Измерение образца AAV8-FIX приведено в процентах относительно контрольного материала. Способ позволяет количественно оценить биологическую функцию вектора генной терапии AAV8-FIX.

Пример 13

Этот пример демонстрирует AAV-специфический ИФА.

В вышеприведенных примерах AAV-специфический ИФА проводили после стадий процесса по настоящему раскрытию для идентификации AAV-содержащих фракций и для вычисления отношения ДНК/AAV или «специфической активности» AAV, который представлен соотношением кПЦР к мкг AAV8. Отношение ДНК/AAV отражает векторную ДНК, инкапсулированную в частицах AAV.

ИФА AAV8 проводили с помощью набора ИФА для титрования AAV-8 (артик. № PRAAV8; Progen (Heidelberg, Germany)) на системе TECAN Roboter. Вкратце, моноклональное антитело, специфическое для конформационного эпитопа на собранных капсидах AAV8 (ADK8) наносили на полоски для микротитрования и использовали для захвата частиц AAV8 из фракции AAV. Захват частиц AAV8 обнаруживали в две стадии. На первой стадии биотин-конъюгированное моноклональное антитело, специфическое к антителу ADK8, связывалось с иммунным комплексом (ADK8 и антитело ADK8). Конъюгаты стрептавидинпероксидазы добавляли к иммунным комплексам, связанным с биотин-конъюгированным моноклональным антителом, и конъюгаты стрептавидинпероксидазы реагировали с биотином. Добавляли раствор субстрата пероксидазы, и происходила цветная реакция, которая пропорциональна количеству связанных частиц AAV. Цветную реакцию измеряют фотометрически при 450 нм.

ИФА определяет количество частиц AAV8, присутствующих в исследуемой фракции.

Пример 14

Этот пример демонстрирует иллюстративный способ отделения пустых частиц AAV от полных ультрацентрифугированием с использованием забуференного 50% раствора этиленгликоля и 50% градиента сахарозы (т.е., соотношение 1:1). На этой стадии удаляют связанные с продуктом примеси, такие как «пустые капсиды» и белки клеток-хозяев, такие как HSP70 и LDH.

Забуференный раствор этиленгликоля (50% (в массовом отношении) в трис-HCl/NaCl), содержащий AAV8, с фактором VIII свертывания крови человека (полная длина ~4,8 т.п.н.), загружали в ультрацентрифугу (UC) с последующим градиентом сахарозы, образованным из двух разных растворов сахарозы, которые различаются по концентрации сахарозы. Соотношение загруженного образца и градиента сахарозы составляет 1:1. Раствор сахарозы, загруженный в UC первым, характеризовался концентрацией сахарозы 55%. Раствор сахарозы, загруженный в UC сразу после первого раствора сахарозы, характеризовался концентрацией сахарозы 60%.

Один килограмм забуференного раствора сахарозы с концентрацией сахарозы 55% готовили смешиванием 2,42 г трис(гидроксиметил)аминометана (трометамола) с 8,00 г хлорида натрия и 550,00 г сахарозы. WFI добавляли к 1 кг, используя 1 М NaOH и 25% HCl, чтобы откорректировать рН при необходимости. WFI затем добавляли к 1 кг.

Один килограмм забуференного раствора сахарозы с концентрацией сахарозы 60% готовили смешиванием 2,42 г трис(гидроксиметил)аминометана (трометамола) с 8,00 г хлорида натрия и 600,00 г сахарозы. WFI добавляли к 1 кг, используя 1 М NaOH и 25% HCl, чтобы откорректировать рН при необходимости. WFI затем добавляли к 1 кг.

В этом примере использовали сердечник объемом 3200 мл, причем 50% забуференный раствор этиленгликоля, содержащий AAV8, составлял 1600 мл, 55% (в массовом отношении) раствор сахарозы составлял 800 мл и 60% (в массовом отношении) раствор сахарозы составлял 800 мл.

Градиент плотности образуется во время первой фазы UC, в которой скорость вращения устанавливали на 4000 об/мин, а температуру поддерживали на уровне 2-10°С. После первой фазы скорость вращения увеличивали до 35000 об/мин, а температуру увеличивали до 22°С. Во время этой второй фазы при более высокой скорости и температуре полные частицы AAV отделяли от пустых капсидов. Через 20 часов ультрацентрифугу останавливали и собирали фракции, содержащие большинство полных частиц AAV.

Результаты показаны на фиг. 19, на которой полные капсиды (фракции 1-6) отделяются от пустых капсидов (фракции 8-17).

Фиг. 20 представляет собой наложение графиков коэффициентов седиментации из фракций 8-10, демонстрирующих разделение подвидов (т.е. неполной векторной ДНК). Стрелка обозначает сдвиг в сторону AAV8 с меньшей массой от фракций с более высокой плотностью к более низкой плотности в градиенте UC (т.е. плотность: фракция 8> фракция 9> фракция 10). Это еще одна демонстрация того, что векторная ДНК может быть разделена на основе размера с соответствующим разрешением по этому протоколу. Смотрите также таблицу 19.

Пример 15

Этот пример демонстрирует ультрацентрифугирование с использованием градиента сахарозы с использованием способа раствора сахарозы 50-55-60. Способ такой же, как указано в примере 7, за исключением того, что частицы AAV8 содержали одноцепочечную векторную ДНК человеческого фактора свертывания крови IX Падуи (2,6 т.п.н.). Как показано на фиг. 21, разделение между полными и пустыми капсидами решено не так, как указано наложением кПЦР ITR и ИФА AAV.

Пример 16

Этот пример демонстрирует ультрацентрифугирование с использованием градиента сахарозы с использованием способа раствора сахарозы 55-60, как описано в примере 6, за исключением того, что используют общий объем сердечника 7700 мл. Таким образом, объем загрузки составлял 6100 мл в 50% забуференном растворе этиленгликоля трис-HCl, объем 55% раствора сахарозы составлял 800 мл, и 60% раствора сахарозы также составлял 800 мл. Профиль элюирования ультрацентрифугирования показан на фиг. 22. В настоящем документе нет «пиков отходов», потому что AAV является высокоочищенным. Полные AAV8 собирают из фракций 1-8 (по 50 мл каждая). «Пустые» AAV собирают из фракций 9-15 (по 50 мл каждая). Далее собирают фракции 15-21 (по 100 мл каждая). Первый пик на фиг. 22 при более высокой плотности сахарозы представляет собой «полные капсиды». Второй пик представляет собой «пустые капсиды».

Все ссылки, включая в себя публикации, заявки на патенты и патенты, цитированные в настоящем документе, тем самым включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была индивидуально и конкретно указана для включения посредством ссылки и была полностью изложена в настоящем документе.

Использование терминов единственного и множественного числа и аналогичных ссылок в контексте описания настоящего раскрытия (особенно в контексте следующей формулы изобретения) должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в настоящем документе или явно не противоречит контексту. Термины «содержащий», «имеющий» и «включающий в себя» следует истолковывать как открытые термины (то есть означающие «включающий в себя, без ограничения»), если не указано иное.

Перечисление диапазонов значений в настоящем документе просто предназначено для того, чтобы служить кратким способом индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в диапазон, и каждую конечную точку, если в настоящем документе не указано иное, и каждое отдельное значение и конечная точка включены в настоящее описание как если бы это было индивидуально указано в настоящем документе.

Все способы, описанные в настоящем документе, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если иное не указано в настоящем документе или иное явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или иллюстративных формулировок (например, «таких как»), представленных в настоящем документе, предназначено просто для лучшего освещения настоящего раскрытия и не налагает ограничений на объем настоящего раскрытия, если не заявлено иное. Ни одна формулировка в настоящем описании не должна быть истолкована как указывающая на любой не заявленный элемент как существенный для практики настоящего раскрытия.

Предпочтительные варианты осуществления настоящего раскрытия описаны в настоящем документе, включая в себя лучший режим, известный авторам настоящего изобретения для осуществления настоящего раскрытия. Изменения этих предпочтительных вариантов осуществления могут стать очевидными для специалистов в настоящей области техники после прочтения предшествующего описания. Авторы настоящего изобретения ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие варианты в зависимости от обстоятельств, и авторы настоящего изобретения предполагают, что настоящее раскрытие будет осуществляться на практике иначе, чем конкретно описанное в настоящем документе. Соответственно, настоящее раскрытие включает в себя все модификации и эквиваленты предмета, изложенного в прилагаемой формуле настоящего изобретения, как это разрешено применимым законодательством. Кроме того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех возможных их вариациях охватывается настоящим раскрытием, если иное не указано в настоящем документе или иное явно не противоречит контексту.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ очистки полных капсидов аденоассоциированного вируса (AAV) от концентрированной фракции AAV, содержащей пустые капсиды AAV и полные капсиды AAV, предусматривающий: (i) загрузку в зональный ротор а) концентрированной фракции AAV и b) по меньшей мере двух растворов сахара, каждый из которых характеризуется различной концентрацией сахара и каждый из которых содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 45% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы, (ii) работу ультрацентрифуги, содержащей зональный ротор, в периодическом режиме, после чего образуется градиент сахара, (iii) получение фракции градиента сахара для получения фракции AAV, причем по меньшей мере или приблизительно 60% частиц AAV во фракции AAV представляют собой полные капсиды AAV, причем общий объем растворов сахара и концентрированной фракции AAV меньше или равен объему зонального ротора и отношение объема растворов сахара к объему концентрированной фракции AAV меньше или равно единице. Способ позволяет получить высокочистый, эффективный продукт, подходящий для клинического применения. 63 з.п. ф-лы, 22 ил., 19 табл., 16 пр.

1. Способ очистки полных капсидов аденоассоциированного вируса (AAV) от концентрированной фракции AAV, содержащей пустые капсиды AAV и полные капсиды AAV, предусматривающий:

(i) загрузку в зональный ротор а) концентрированной фракции AAV и b) по меньшей мере двух растворов сахара, каждый из которых характеризуется различной концентрацией сахара и каждый из которых содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 45 % (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы,

(ii) работу ультрацентрифуги, содержащей зональный ротор, в периодическом режиме, после чего образуется градиент сахара,

(iii) получение фракции градиента сахара для получения фракции AAV, причем по меньшей мере или приблизительно 60% частиц AAV во фракции AAV представляют собой полные капсиды AAV, причем общий объем растворов сахара и концентрированной фракции AAV меньше или равен объему зонального ротора и отношение объема растворов сахара к объему концентрированной фракции AAV меньше или равно единице.

2. Способ по п. 1, при котором каждый раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 50% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы.

3. Способ по п. 1 или п.2, при котором каждый раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 55% (в массовом отношении) до приблизительно 60% (в массовом отношении) сахарозы.

4. Способ по любому из пп. 1-3, при котором по меньшей мере один из растворов сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, превышающей приблизительно 50% (в массовом отношении) сахарозы.

5. Способ по любому из пп. 1-4, при котором по меньшей мере один из растворов сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, превышающей приблизительно 55% (в массовом отношении) сахарозы.

6. Способ по любому из пп. 1-5, при котором по меньшей мере один из растворов сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 60% (в массовом отношении) до приблизительно 65% (в массовом отношении) сахарозы.

7. Способ по любому из пп. 1, 2 или 4-6, при котором один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, причем второй раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы.

8. Способ по п.7, причем третий раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 47% (в массовом отношении) до приблизительно 53% (в массовом отношении) сахарозы.

9. Способ по любому из пп. 1-8, при котором два раствора сахара загружают в зональный ротор.

10. Способ по любому из пп. 1, 2 или 4-9, при котором два раствора сахара загружают

в зональный ротор и при котором один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, и второй раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы.

11. Способ по любому из пп. 1-8, при котором по меньшей мере три раствора сахара загружают в зональный ротор.

12. Способ по любому из пп. 1-8 или 11, при котором три раствора сахара загружают в зональный ротор.

13. Способ по любому из пп. 1, 2, 4-8, 11 или 12, при котором три раствора сахара загружают в зональный ротор и при котором один раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 47% (в массовом отношении) до приблизительно 53% (в массовом отношении) сахарозы, второй раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, и третий раствор сахара содержит сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы.

14. Способ по любому из пп. 1, 2 или 4-13, при котором на стадии (i) концентрированную фракцию AAV загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, и причем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы.

15. Способ по любому из пп. 1, 2, 4-8 или 11-14, при котором на стадии (i) концентрированную фракцию AAV загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы от приблизительно 47% (в массовом отношении) до приблизительно 53% (в массовом отношении) сахарозы, причем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы, находится в диапазоне от приблизительно 47% (в массовом отношении) до приблизительно 53% (в массовом отношении) сахарозы, загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, и причем раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 52% (в массовом отношении) до приблизительно 58% (в массовом отношении) сахарозы, загружают перед раствором сахара, содержащим сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы в диапазоне от приблизительно 57% (в массовом отношении) до приблизительно 63% (в массовом отношении) сахарозы.

16. Способ по любому из пп. 1-15, при котором каждый раствор сахара загружают в зональный ротор в равных объемах.

17. Способ по любому из пп. 1-15, при котором раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, в два раза превышающем объем по меньшей мере одного из других растворов сахара в зональном роторе.

18. Способ по любому из пп. 1-15 или 17, при котором раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, равном по меньшей мере объему всех других растворов сахара, объединенных в зональном роторе.

19. Способ по пп. 1-15, 17 или 18, при котором раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, который по меньшей мере вдвое превышает объем раствора сахара с наибольшей концентрацией сахара, необязательно, причем объем раствора сахара с наибольшей концентрацией сахара равен объему раствора сахара с промежуточной концентрацией сахара.

20. Способ по любому из пп. 1-15 или 17-19, при котором по меньшей мере два раствора сахара загружают в зональный ротор, причем раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, который по меньшей мере вдвое больше объема по меньшей мере одного другого раствора сахара в зональном роторе.

21. Способ по любому из пп. 1-20, при котором по меньшей мере два раствора сахара загружают в зональный ротор, причем раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, равном объему по меньшей мере одному другому раствору сахара в зональном роторе.

22. Способ по любому из пп. 1-21, при котором раствор сахара с наименьшей концентрацией сахара загружают в зональный ротор в объеме, который составляет половину объема концентрированной фракции AAV.

23. Способ по любому из пп. 1-22, при котором отношение объема общего градиента сахара к объему концентрированной фракции AAV, загруженной в зональный ротор, составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:5.

24. Способ по любому из пп. 1-23, при котором концентрированная фракция AAV, загруженная в зональный ротор, содержит забуференный раствор.

25. Способ по любому из предыдущих пунктов, при котором каждый раствор сахара содержит дисахарид или трисахарид.

26. Способ по п. 25, при котором дисахарид содержит сахарозу, мальтозу, лактозу и их комбинации.

27. Способ по любому из предыдущих пунктов, при котором каждый раствор сахара содержит сахарозу.

28. Способ по любому из предыдущих пунктов, при котором каждый из растворов сахара и/или фракции AAV содержит трис-HCl и NaCl.

29. Способ по п. 28, при котором концентрация трис-HCl составляет от приблизительно 10 до приблизительно 100 мМ, а концентрация NaCl составляет от приблизительно 100 мМ до приблизительно 1 М.

30. Способ по п. 29, при котором концентрация трис-HCl составляет от 20 до 50 мМ.

31. Способ по п. 29 или п.30, при котором концентрация NaCl составляет от 150 до 750 мМ.

32. Способ по любому из пп. 29-31, при котором концентрация NaCl составляет от 150 до 500 мМ.

33. Способ по любому из пп. 29-32, при котором каждый из растворов сахара и/или фракции AAV характеризуется рН от 7,0 до 9,0.

34. Способ по любому из пп. 29-33, при котором каждый из растворов сахара и/или фракции AAV характеризуется рН от приблизительно 7,4 до приблизительно 8,5.

35. Способ по любому из пп. 1-34, при котором каждый из растворов сахара и/или фракции AAV содержит 45-55% (в массовом отношении) этиленгликоля.

36. Способ по любому из пп. 1-34, при котором каждый из растворов сахара и/или фракции AAV содержит 40%, 41 %, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% или 60% (в массовом отношении) этиленгликоля.

37. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий работу ультрацентрифуги на первой скорости вращения менее чем 10000 об/мин в течение менее чем 60 минут и на второй скорости вращения в диапазоне от приблизительно 30000 до приблизительно 40000 об/мин в течение минимум 4 часов.

38. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий работу ультрацентрифуги на первой скорости вращения менее чем 10000 об/мин в течение менее чем 60 минут и второй скорости вращения в диапазоне от приблизительно 30000 до приблизительно 40000 об/мин в течение минимум 12 часов.

39. Способ по п. 37 или 38, при котором первая скорость вращения составляет от приблизительно 3000 до приблизительно 6000 об/мин, необязательно, приблизительно 4000 об/мин.

40. Способ по п. 37 или 39, при котором вторая скорость вращения составляет приблизительно 35000 об/мин и, необязательно, поддерживается в течение от приблизительно 4 до приблизительно 6 часов.

41. Способ по любому из пп. 37-39, при котором вторую скорость вращения поддерживают в течение по меньшей мере приблизительно 16 часов или по меньшей мере 20 часов.

42. Способ по любому из пп. 37-39 или 41, при котором вторая скорость вращения составляет приблизительно 35000 об/мин и, необязательно, поддерживается в течение от приблизительно 16 до приблизительно 20 часов.

43. Способ по любому из предыдущих пунктов, при котором концентрированная фракция AAV, загруженная в зональный ротор, содержит по меньшей мере 1х10¹² капсидов AAV на мл.

44. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий сбор супернатанта из клеточной культуры, содержащей клетки HEK293, трансфицированные тройной плазмидной системой.

45. Способ по п. 44, предусматривающий сбор супернатанта через приблизительно от 3 до приблизительно 5 дней после трансфекции клеток HEK293 или, когда клеточная культура характеризуется плотностью клеток более чем или приблизительно 5х10⁶ клеток/мл и жизнеспособностью клеток более чем 50%.

46. Способ по п. 44 или 45, предусматривающий фильтрацию собранного супернатанта с помощью глубокой фильтрации.

47. Способ по п. 46, предусматривающий фильтрацию собранного супернатанта через фильтр, содержащий целлюлозу и перлит и характеризующийся минимальной проницаемостью приблизительно 500 л/м².

48. Способ по п. 47, предусматривающий фильтрацию собранного супернатанта через фильтр с минимальным размером пор приблизительно 0,2 мкм.

49. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий (i) внесение концентрированной фракции AAV в колонку для анионообменной хроматографии (AEX) в условиях, которые позволяют AAV проходить через хроматографическую колонку AEX, и (ii) сбор потока, содержащего AAV.

50. Способ по п. 49, при котором концентрированную фракцию AAV вносят в хроматографическую колонку AEX с загрузочным буфером, содержащим от приблизительно 100 мМ до приблизительно 150 мМ NaCl, необязательно, причем рН загрузочного буфера составляет от приблизительно 8 до приблизительно 9.

51. Способ по п. 50, при котором загрузочный буфер содержит от приблизительно 115 мМ до приблизительно 130 мМ NaCl, необязательно, причем загрузочный буфер содержит от приблизительно 120 мМ до приблизительно 125 мМ NaCl.

52. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий концентрирование концентрированной фракции AAV с использованием системы ультра/диафильтрации.

53. Способ по п. 52, предусматривающий концентрирование концентрированной фракции AAV с использованием системы ультра/диафильтрации до, после или до и после стадии, предусматривающей внесение концентрированной фракции AAV в колонку для анионообменной хроматографии (AEX) в условиях, которые позволяют AAV протекать через хроматографическую колонку AEX.

54. Способ по любому из предыдущих пунктов, при котором удаляют белки клетки-хозяина.

55. Способ по п. 54, при котором белки клетки-хозяина представляют собой HSP70 и/или LDH.

56. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно предусматривающий инактивацию вирусов с липидной оболочкой фракции AAV растворителем и/или детергентом.

57. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно предусматривающий нанофильтрацию фракции AAV для удаления вирусов размером более чем 35 нм.

58. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно предусматривающий стадию завершающей очистки, предусматривающей проведение AEX-хроматографии с колонкой, содержащей гель типа «щупальца».

59. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий исследование фракции AAV с помощью AAV-специфического ИФА.

60. Способ по п. 59, при котором способ не предусматривает стадию измерения активности с помощью количественной ПЦР.

61. Способ по п. 59 или 60, при котором AAV-специфический ИФА представляет собой специфический для AAV сэндвич-ИФА.

62. Способ по любому из предыдущих пунктов, причем способ предусматривает первый раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы приблизительно 55%, второй раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы приблизительно 60%, и, необязательно, третий раствор сахара, содержащий сахар в концентрации, эквивалентной концентрации сахарозы приблизительно 50%.

63. Способ по любому из предыдущих пунктов, при котором AAV представляет собой AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 или AAV10.

64. Способ по любому из предыдущих пунктов, при котором AAV представляет собой AAV8.