СПОСОБ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ АНАЛИТОВ В ОБРАЗЦЕ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/558 G01N33/53 

Известны многочисленные примеры использования иммунохроматографических тест-систем для детектирования аналитов (ЕР 0890103 В1; ЕР 1046913 А2; US 50968375238; US 5238652…). Подобные примеры описаны также в книге "Lateral flow immunoassay" R.C.Wong, H.Y. Tse, eds., Humana Press N-Y, 2009. В этих примерах в качестве дисперсной фазы для конъюгирования антител (антигенов) используют наночастицы (диаметр 5-80 нм) золота, окрашенные или флуоресцирующие полимерные частицы субмикронного размера (СА 2049919), наночастицы полупроводниковых материалов, способных к люминесценции (US 2006/0008921).

Наиболее близкий аналог (прототип) предлагаемого изобретения описан в патенте ЕР 0890103 В1 "Quantitative immunochromatographic assay". В приспособлении, для проведения иммунохроматографического анализа, описанном в прототипе, предполагается, что мембрана для конъюгата содержит привнесенные в нее искусственно микрочастицы, такие как: коллоидные частицы металлов, молекулы органических соединений, липосомы, или органические полимерные латексные частицы. Указанные частицы связаны с детектирующим антителом, способным к связыванию с аналитом.

В процессе иммунохроматографического анализа жидкая проба, содержащая аналит, взаимодействует с антителами микрочастиц, образованные комплексы аналита и микрочастиц капиллярным током жидкости увлекаются по аналитической мембране к узкой аналитической зоне, в которой находятся антитела захвата, останавливающие микрочастицы, связанные с аналитом, образуя при этом окрашенный или люминесцирующий комплекс.

Указанный метод анализа на наш взгляд имеет, по меньшей мере, два недостатка.

I. Коллоидные частицы металлов, молекулы органических соединений и, особенно, липосомы или органические полимерные латексные частицы дороги в изготовлении, требуют сложных методик синтеза самих частиц, трудоемких химических методик привнесения функциональных групп на поверхность для последующего связывания с антителами (антигенами).

II. Скорость миграции по аналитической мембране комплекса аналит-микрочастицы и скорость формирования аналитического сигнала лимитируется конвекцией и диффузией в мембране [S.Qian, H.H.Bau. A mathematical model of lateral flow bioreactions applied to sandwich assays. / Analytical Biochemistry 2003, v.333, pp.89-98]. Коэффициент диффузии в мембранах с идентичными физическими свойствами зависит от гидродинамического радиуса комплекса микрочастиц с аналитом и вязкости элюирующего растворителя. Типичные времена формирования аналитической зоны при использовании микрочастиц коллоидного золота средним диаметром 35 нм, в мембранах с различной скоростью капиллярного течения (например, Millipor HF120 и Millipor HF240), при комнатной температуре, составляют от 20 до 45 мин.

Кроме того, микрочастицы (особенно частицы полимерных латексов и липосом) обладают способностью к агрегации, что вызывает уменьшение скорости миграции последних. Об этой проблеме и способах ее преодоления говорится в патенте СА 2049919.

При проведении иммунохроматографии фронт элюирующего растворителя на мембране опережает фронт распространения комплекса микрочастиц с аналитом, что приводит к неравномерному движению окрашенных (люминесцирующих) комплексов и их агрегатов по аналитической мембране, понижая контраст между микрочастицами на мембране и микрочастицами в аналитической зоне, понижая тем самым и чувствительность анализа. Предлагаемая нами дисперсная фаза гидрозоль гексацианферрата (II) железа (III) лишена указанных недостатков. Указанная дисперсная фаза обладает следующими преимуществами:

- Стоимость исходных материалов для ее получения и сам конечный продукт менее дорогостоящи, чем окрашенные или флуоресцирующие полимерные латексы, коллоиды металлов (золота), липосомы.

- Процесс синтеза гидрозоля гексацианферрата (II) железа (III) весьма прост, нетрудоемок и хорошо воспроизводим.

- Обладает хорошо развитой поверхностью и способностью к адсорбционному связыванию антител и антигенов, как белкового, так и липополисахаридного характера.

- Движение комплекса микрочастиц с аналитом по иммунохроматографической мембране происходит равномерно, одновременно с фронтом элюирующего растворителя. Типичное время прохождения иммунохроматографического процесса на мембранах Millipor HF120 составляет от 2 до 15 мин. Это в несколько раз быстрее, чем для иммунохроматографии с применением других микрочастиц. Из-за равномерного движения дисперсной фазы иммунохроматографическая мембрана вне аналитической зоны практически не окрашивается, в аналитической зоне образуются высококонтрастные полосы ярко-синего цвета, делая анализ чувствительнее.

Цель изобретения - детектирование аналитов в исследуемом образце за более короткое время и с более высокой чувствительностью.

Технический результат: обеспечивается ускорение процедуры иммунохроматографического анализа, по сравнению с используемыми традиционно в качестве дисперсной фазы золями золота, окрашенных полимерных латексов или квантовых точек, обеспечивается повышение контраста между аналитической зоной и белой поверхностью мембраны.

Заявленный технический результат достигается за счет того, что способ проведения иммунохроматографического анализа для детектирования аналитов в образце, включающий создание мультимембранного композита, состоящего из мембраны для нанесения образца, мембраны для конъюгата, аналитической мембраны и мембраны для впитывания образца, содержащего сухой конъюгат дисперсной фазы с антителом (антигеном) к одному из антигенных эпитопов аналита, нанесение иммунореагента (второго антитела к другому антигенному эпитопу аналита, либо антигена) на аналитическую мембрану в виде узкой зоны, проведение иммунохимической реакции и отделение иммунохимического комплекса одновременно в процессе хроматографической миграции на поверхности аналитической мембраны, отличается тем, что в качестве дисперсной фазы для конъюгирования первого антитела (антигена) используют гидрозоль гексацианферрата (II) железа (III).

Сущность изобретения заключается в том, что в иммунохроматографическом анализе используют в качестве дисперсной фазы гидрозоль гексацианферрата (II) железа (III), конъюгированную с антителами (антигенами) к искомому аналиту. Проводят иммунохроматографический анализ, о наличии аналита судят по появлению на аналитической мембране окрашенной в ярко-синий цвет полосы.

Способ осуществляется следующим образом.

При осуществлении способа получают конъюгат частиц гидрозоля гексацианоферрата (II) железа (III) (ГЦФЖ; другое наименование этого соединения - «берлинская лазурь») с антителами к аналиту (антигену), либо с антигеном к исследуемому аналиту (антителам), наносят конъюгат на конъюгатную мембрану с последующим высушиванием, наносят второе антитело к антигенному эпитопу аналита, либо антигена на аналитическую мембрану, в виде узкой полосы в аналитической зоне, формируют мультимембранный композит, проводят иммунохимическую реакцию на поверхности аналитической мембраны, с последующим определением исследуемого аналита (антигена, либо антител) по появлению окрашенной полосы в аналитической зоне. Содержание аналита в исследуемом образце пропорционально количеству образовавшихся комплексов конъюгата частиц гидрозоля ГЦФЖ с аналитом, захваченных в аналитической зоне. Частицы гидрозоля ГЦФЖ окрашены в ярко-синий цвет, интенсивность окраски полосы аналитической зоны пропорциональна количеству аналита в образце.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение конъюгатов гидрозоля ГЦФЖ с антителами, либо с антигенами

Гидрозольные препараты ГЦФЖ получают при смешивании растворов хлорного железа и железисто-синеродистого калия в воде.

Для сенсибилизации поверхности частиц гидрозоля ГЦФЖ антителами, либо антигенами к препарату гидрозоля добавляют водный раствор, содержащий иммунный компонент, смесь инкубируют на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре и добавляют бычий сывороточный альбумин (БСА) до конечной концентрации 0,1%. Через 2 мин инкубации при тех же условиях смесь центрифугируют при 50000-60000 xg в течение 30 мин. Осадок суспендируют в 0,1% растворе БСА. Суспензию повторно центрифугируют в тех же условиях. Осадок суспендируют в 0,1% растворе БСА. Определяют длину волны поглощения в максимуме и величину оптической плотности (ОП) в максимуме на спектрофотометре. С помощью раствора состава 5% сахарозы, 0,25% БСА готовят суспензии гидрозоля с плотностью (ОП), равной 3,0 в максимуме поглощения, и наносят ее на мембрану для конъюгата. Указанную мембрану высушивают не менее суток в помещении с относительной влажностью воздуха от 20 до 30% и температуре плюс 20°C - плюс 25°C.

Пример 2. Создание мультимембранного композита

Сборку композита (фиг.1) осуществляют при относительной влажности воздуха в пределах от 20 до 30% при температуре от 20 до 25°C.

На нитроцеллюлозную мембрану (3) в область аналитической зоны в виде узкой полосы (4) наносят растворы антител к антигенным эпитопам аналита, либо антигена (при определении в качестве аналита антител). В область контрольной зоны (5) наносят антивидовые поликлональные, либо моноклональные антитела.

На ламинатную подложку нитроцеллюлозной мембраны (6) наклеивают высушенную конъюгатную мембрану (2) с нанесенным конъюгатом с ОП=3,0 и мембрану (1) для нанесения образца. С противоположной стороны, на ламинатную подложку нитроцеллюлозной мембраны наклеивают мембрану для впитывания образца (7). Собранный мультимембранный композит нарезают на полоски шириной 5 мм, и длиной 60 мм, которые помещают в пластиковые оправки (фиг.2), верхняя поверхность которых имеет отверстие для нанесения образца (S) и отверстие для считывания результатов анализа, обозначенное буквами Т и С.

Пример 3. Определение холерного экзотоксина (XT)

Используют мультимембранный композит (пример 2), в аналитическую зону которого нанесены поликлональные кроличьи антитела к XT, в контрольную зону нанесены козьи антикроличьи антитела, конъюгатная подложка содержит конъюгат частиц гидрозоля ГЦФЖ с антителами к XT. В отверстие для нанесения образца вносят 120 мкл раствора, содержащего 1% твин 20 и 1% БСА, или XT, в том же растворе.

Введение в отверстие для нанесения образца 120 мкл раствора 1% твин 20 и 1% БСА приводит к появлению интенсивной полосы синего цвета в контрольной зоне и ее отсутствию в зоне аналитической полосы (фиг.3А), что свидетельствует об отсутствии неспецифического взаимодействия конъюгатов частиц гидрозоля ГЦФЖ, содержащих антитела к XT, с антихолерогенными антителами и компонентами сыворотки крови, нанесенными в аналитическую зону.

Введение в исследуемый образец XT (источник - холерная вакцина) приводит к появлению на мембране двух полос синего цвета: в области аналитической (8) и контрольной (9) зон (фиг.3Б). Интенсивность сигнала в аналитической зоне повышается с увеличением концентрации аналита в пробе и времени анализа. Диапазон измеряемых концентраций XT от 2,0 до 500 мкг/мл исходного раствора по белку. График зависимости интенсивности окрашивания контрольной зоны от концентрации XT в пробе приведен на фиг.4. Время анализа 2-15 мин. Оценку интенсивности сигнала в аналитической зоне проводят визуально или регистрируют с помощью анализатора видеоцифрового «Рефлеком».

Если при введении в отверстие для нанесения образца анализируемых растворов не образуется окрашенных линий (фиг.2В), то такая тест-система считается непригодной, а результаты ее не учитываются.

Пример 4. Определение в образце сыворотки крови титра антител к возбудителю сальмонеллеза

Используют мультимембранный композит (полученный по примеру 2), в аналитическую зону которого нанесен препарат липополисахарида (ЛПС) Salmonella typhimurium, в контрольную зону нанесены моноклональные антитела к O-антигену сальмонелл группы В, конъюгатная подложка содержит конъюгат частиц гидрозоля ГЦФЖ с сорбированным ЛПС к S. typhimurium с ОП=3,0. Для получения конъюгата используют растворы ЛПС с концентрацией 50 нг/мл и 200 нг/мл.

На растворе, содержащем 1% твин 20 и 1% БСА, готовят ряд последовательных рабочих разведений антисыворотки kS.typhimurium от 1:20 до 1:10 240.

Введение в отверстие для образца 120 мкл раствора, состоящего из 1% твин 20 и 1% БСА, приводит к появлению в области контрольной зоны полосы синего цвета при отсутствии окрашенной полосы в области аналитической зоны.

Введение в указанную выше смесь AT к возбудителю сальмонеллеза, приводит к появлению в аналитической зоне полосы синего цвета, интенсивность которой зависит от уровня специфических AT и времени реакции. Диапазон измеряемых титров AT к возбудителю сальмонеллеза от 1:20 до 1:5120. На фиг.5 приведен график зависимости интенсивности окрашивания аналитической зоны от разведения антител к возбудителю сальмонеллеза. Время анализа 1-15 мин. Оценку интенсивности сигнала в аналитической зоне проводят визуально или регистрируют с помощью анализатора видеоцифрового «Рефлеком».

Пример 5. Определение в образце сыворотки (плазмы) крови человека антител к возбудителю туберкулеза

Используют мультимембранный композит (полученный по примеру 2), в аналитическую зону которого нанесен препарат рекомбинантного антигена - гликопротеинового комплекса Mycobacterium tuberculosis H37Rv, в контрольную зону нанесены козьи кроличьи антитела, конъюгатная подложка содержит конъюгат частиц гидрозоля ГЦФЖ с ОП=3,0 с сорбированными кроличьими антителами к сумме иммуноглобулинов человека классов (IgG+IgM+IgA). На растворе, содержащем 1% твин 20 и 1% БСА, готовят ряд последовательных рабочих разведений сыворотки (плазмы) крови человека от 1:2 до 1:10, предположительно содержащих антитела к возбудителю туберкулеза

Введение в отверстие для образца 120 мкл раствора, состоящего из 1% твин 20 и 1% БСА, приводит к появлению в области контрольной зоны полосы синего цвета при отсутствии окрашенной полосы в области аналитической зоны (фиг.2Б), что свидетельствует об отсутствии в исследуемом образце антител к возбудителю туберкулеза. Введение в отверстие для образца 120 мкл раствора, состоящего из 1% твин 20 и 1% БСА и содержащего сыворотку (плазму) крови человека, больного туберкулезом, приводит к появлению в аналитической зоне двух полос синего цвета (фиг.2А), интенсивность которых зависит от уровня специфических AT и времени реакции. Время анализа 1-15 мин. Регистрацию результатов проводят визуально, либо при помощи прибора «Рефлеком». Если при введении в отверстие для нанесения образца анализируемых растворов не образуется окрашенных линий (фиг.2В), то такая тест-система считается непригодной, а результаты ее не учитываются.

Пример 6. Определение времени достижения максимального аналитического сигнала при использовании в качестве дисперсной фазы гидрозоля ГЦФЖ и коллоидного золота на примере регистрации XT.

Пример иллюстрирует уменьшение времени анализа одного и того же аналита, при прочих равных условиях.

Получали мультимембранный композит с ГЦФЖ (как описано в примере 2) и мультимембранный композит с коллоидным золотом.

Для получения конъюгатов частиц коллоидного золота с антителами к XT к препарату коллоидного золота добавляют водный раствор, содержащий антихолерогенные антитела, смесь инкубируют на магнитной мешалке в течение 10 мин при комнатной температуре и добавляют БСА до конечной концентрации 0,1%. Через 1 мин инкубации в тех же условиях смесь центрифугируют при 50000 × g в течение 30 мин. Суспензию два раза промывают раствором, содержащим 10% сахарозу и 0,25% БСА, каждый раз осаждая частицы центрифугированием в тех же условиях. Осадок суспендируют в 0,02 М фосфатном буфере pH 7,9, содержащем 10% сахарозу и 0,25% БСА. Определяют длину волны поглощения в максимуме и величину ОП в максимуме на спектрофотометре. С помощью того же буферного раствора готовят суспензию золя золота с ОП, равной 3,0 в максимуме поглощения, и наносят ее на мембрану для конъюгата. Мембрану высушивают, как описано в примере 1. Сборку мультимембранного композита осуществляют, как описано в примере 2.

В отверстие для нанесения образца оправки, содержащей конъюгат частиц коллоидного золота с антихолерогенными антителами, вносят 120 мкл раствора XT, приготовленного на 0,1 М фосфатном буферном растворе pH 7,9, содержащем 0,5% БСА и 0,4% твин 20.

XT определяют, как описано в примере 3. Интенсивность сигналов в аналитической зоне регистрируют с помощью видеоцифрового анализатора «Рефлеком». График зависимости интенсивности сигнала в аналитической зоне от времени анализа приведен на фиг.6. При использовании в качестве дисперсной фазы гидрозоля ГЦФЖ максимальный сигнал в зоне аналитической полосы появляется через 5 мин после внесения образца. При применении конъюгатов золя золота для достижения максимального аналитического ответа требуется более длительное время (более 40 мин).

Для всех описанных выше примеров характерна быстрота перемещения частиц конъюгата гидрозоля ГЦФЖ по нитроцеллюлозной мембране и появления окрашенных полос в аналитической и контрольной зонах, что отличает иммунохроматографические тесты с использованием гидрозольных препаратов ГЦФЖ от иммунохроматографических тестов на основе золей золота, для которых время анализа составляет 15-40 мин. При высоких концентрациях аналита видимый глазом сигнал появлялся через 1-2 мин после введения образца. Частицы гидрозоля ГЦФЖ, сенсибилизированные антителами или антигеном, проходили через аналитическую мембрану ровным фронтом, практически не давая «подтеков» и «наплывов». Фон аналитической мембраны был от белого до светло-голубого, сформированные линии в аналитической и контрольной зонах отличались хорошим контрастом.

Повышение контраста между аналитической зоной и белой поверхностью мембраны обеспечивается за счет более полного удаления окрашивающего гидрозоля гексацианферрата (II) железа (III) и, как следствие, улучшение визуальной или приборной регистрации результатов анализа.

Изобретение относится к иммунологии, а именно к иммунохроматографическому анализу. Сущность способа иммунохроматографического анализа для детектирования аналитов в образце заключается в том, что используют в качестве дисперсной фазы гидрозоль гексацианферрата (II) железа (III), конъюгированный с антителами (антигенами) к искомому аналиту. О наличии аналита судят по появлению на аналитической мембране окрашенной в ярко-синий цвет полосы. Использование заявленного способа обеспечивает ускорение процедуры иммунохроматографического анализа, по сравнению с используемыми традиционно, при этом обеспечивается повышение контраста между аналитической зоной и белой поверхностью мембраны. 6 ил.

Способ проведения иммунохроматографического анализа для детектирования аналитов в образце, включающий создание мультимембранного композита, состоящего из мембраны для нанесения образца, мембраны для конъюгата, аналитической мембраны и мембраны для впитывания образца, содержащего сухой конъюгат дисперсной фазы с антителом (антигеном) к одному из антигенных эпитопов аналита, нанесение иммунореагента (второго антитела к другому антигенному эпитопу аналита либо антигена) на аналитическую мембрану в виде узкой зоны, проведение иммунохимической реакции и отделение иммунохимического комплекса одновременно в процессе хроматографической миграции на поверхности аналитической мембраны, отличающийся тем, что в качестве дисперсной фазы для конъюгирования первого антитела (антигена) используют гидрозоль гексацианферрата (II) железа (III).