Способ повышения чувствительности иммунохроматографических тест-систем лактатом серебра и гидрохиноном Российский патент 2020 года по МПК G01N33/53 

Данное изобретение относится к области иммунохроматографического анализа и может быть использовано с целью повышения чувствительности разрабатываемых иммунохроматографических тест-систем.

Иммунохроматографическая тест-система представляет собой мультимембранный композит, состоящий из нитроцеллюлозной мембраны, мембраны с иммобилизованным конъюгатом моно- или поликлональных антител к детектируемому антигену с маркером, мембраны для внесения образца и адсорбирующей мембраны. В качестве маркера в иммунохроматографии чаще всего используют наночастицы коллоидного золота.

Существуют различные методики усиления оптического сигнала, генерируемого наночастицами коллоидного золота в тест-системах.

Из уровня техники известна методика, основанная на применении ферментов [Parolo, C. Enhanced lateral flow immunoassay using gold nanoparticles loaded with enzymes / C. Parolo, A. de la Escosura-Muñiz, A. Merkoçi // Biosensors and Bioelectronics. – 2013. – V. 40. – P. 412-416.]. Предложена иммунохроматографическая тест-система, в которой наночастицы золота конъюгированы с антителами и пероксидазой. После проведения иммунохроматографического анализа тест-полоску отмывают от несвязавшихся реагентов и погружают в раствор субстрата пероксидазы (тетраметилбензидина), дающего ярко-синий нерастворимый продукт окисления. Усиление окрашивания позволило снизить предел обнаружения с 5 нг×см^-3 до 200 пг×см^-3.

Дрыгин Ю.Ф. и соавторы предложили другой способ усиления аналитического сигнала в иммунохроматографии, который состоит в использовании наночастиц серебра диаметром 20 нм, агрегирующих на поверхности наночастиц коллоидного золота (НчКЗ) и в
10 раз увеличивающих интенсивность окрашивания [Дрыгин, Ю.Ф. Высокочувствительный иммунохроматографический экспресс-метод определения зараженности растений вирусом табачной мозаики / Ю.Ф. Дрыгин, А.Н. Блинцов и соавт. // Биохимия. — Т. 74. – № 9. – 2009. — С. 986-993].

Методика усиления серебром основана на реакции физического проявления, используемой в фотографии. Помимо восстановителя «физический» проявитель содержит ионы или комплексы металлов. Из таких растворов происходит осаждение металлов на центры скрытого изображения. При гистохимическом серебрении в качестве подобных центров выступают НчКЗ. Наночастицы катализируют восстановление ионов серебра из соли до металлического серебра. Оболочка металлического серебра вокруг частицы золота, в свою очередь, ускоряет восстановление, и реакция становится автокаталитической. Впервые эта методика была использована для гистохимического анализа в 1981 г. В качестве восстановителя автор использовал гидрохинон, а из солей серебра отдал предпочтение лактату [Дыкман, Л.А. Золотые наночастицы. Синтез, свойства, биомедицинское применение [Текст] / Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев, С.Ю. Щеголев, Н.Г. Хлебцов // М: Наука. – 2008. – С. 195-196].

Наиболее близкой к изобретению является иммунохроматографическая тест-система для детекции белка CagA H. pylori [Богачева, Н.В. Иммунохроматографическая тест-система для выявления патогенных штаммов Helicobacter pylori / Н.В. Богачева, И.В. Дармов, Д.Н. Смирнова // Патент на изобретение RU 2642588 C1, МПК G01N33/543, G01N33/577, заявка №2017108557 от 14.03.2017, опубл.: 25.01.2018 в Бюл. № 3]. Данная тест-система представляет собой мультимембранный композит, состоящий из мембраны для образца, адсорбирующей мембраны, нитроцеллюлозной мембраны, на поверхность которой наклеена мембрана, пропитанная конъюгатом моноклональных антител, клон НР-387 («Биалекса», Россия), с наночастицами колодного золота со средним диаметром 30 нм, и нанесены в поперечном направлении моноклональные антитела, клон HP-1811 («Биалекса», Россия), в тестовой и антивидовые антитела козы против Ig мыши («Биалекса», Россия) – в контрольной зонах.

Авторами предложен способ повышения чувствительности иммунохроматографических тест-систем с применением лактата серебра и гидрохинона на примере тест-системы для детекции белка CagA H. pylori.

Технический результат изобретения – разработка способа повышение чувствительности иммунохроматографических тест-систем, предначначенных для детекции как инфекционных, так и неинфекционных агентов, не менее чем в четыре раза.

Технический результат достигается путем отработки вариантов нанесения лактата серебра на компоненты мультимембранного композита, выбора концентрации лактата серебра, оценки влияния гидрохинона на усиление оптического сигнала в аналитической зоне тест-системы, с последующим определением порога чувствительности усиленного вышеуказанными иммунохимическими компонентами экспериментального образца иммунохроматографической тест-системы при теститровании с музейными культурами H.pylori и антигеном AGHPY-0100.

Способ повышения чувствительности иммунохроматографических тест-систем заключается в предварительной подготовке двух мембран – нитроцеллюлозной, пропитанной 0,075 % раствором лактата серебра, и мембраны, обработанной 3 % раствором гидрохинона, приготовленном на 0,5 М цитратном буфере с рН 4,0; сборке готового мультимемранного композита иммунохроматографической тест-системы с нанесенными на мембраны иммунохимическими компонентами; тестировании готовой имунохроматографической тест-системы путем внесения 100 мкл пробы на мембрану для образца; наложении через 10 минут после внесения пробы на детектируемую зону тест-системы мембраны, пропитанной 3 % гидрохиноном; нанесении на наложенную мембрану 30 мл буфера разгона, экспозиции в течении 5 мин, удалении мембраны с гидрохиноном и определении в тестовой зоне детектируемого антигена.

Полученное повышение чувствительности иммунохроматографической тест-системы в четыре раза подтверждено примерами тестирования разработанной иммунохроматографической тест-системы, для выявления белка CagA H.pylori, как при тестировании с культурой микроорганизма, так и при тестировании антигена AGHPY-0100, в состав которого входят внутриклеточные белки H. pylori, ассоциированные с генами cagA (120 kd) и vacA (87 kd) и уреазой.

В работе использовали моноклональные антитела к белку cagA H.pylori, клоны НР-1811 и НР-387 («Биалекса», Россия); антивидовые антитела козы против IgG мыши («Биалекса», Россия); соляную кислоту (ГОСТ 3118-77); лактат серебра («Sigma Aldrich», США); гидрохинон (Россия); антиген AGHPY-0100 («Arista Biologicals»); цитрат натрия («Реахим», Россия); лимонную кислоту («Реахим», Россия); трис(гидроксиметил)аминометан C4H11NO3 («Sigma», США); трис гидрохлорид C4H12ClNO3 («Panreac», Испания); Tween-20 («AppliChem», Германия).

В состав мультимембранного комплекса вошли мембраны фирмы «MDI», Индия: нитроцеллюлозные мембраны TYРЕ-СNРF-SN12-L2-Р25 8μ и 10μ; мембраны для нанесения образцов TYPE-GFB-R4(0.35); мембраны из стекловолокна для конъюгата PT-R5; мембраны для абсорбента TYPE-AP 045.

Все растворы готовили на деионизированной воде. Для получения деионизированной воды применяли систему UF Arium 611 UF («Sartorius», Германия).

Этапы разработки способа повышения чувствительности иммунохроматографических тест систем лактатом серебра и гиброхиноном рассмотрим на примере совершенствования иммунохроматографтической тест-системы для детекции белка CagA H.pylori [Богачева, Н.В. Иммунохроматографическая тест-система для выявления патогенных штаммов Helicobacter pylori / Н.В. Богачева, И.В. Дармов, Д.Н. Смирнова // Патент на изобретение RU 2642588 C1, МПК G01N33/543, G01N33/577, заявка №2017108557 от 14.03.2017, опубл.: 25.01.2018 в Бюл. № 3].

Получение экспериментального образца иммунохроматографтической тест-системы для детекции белка CagA H.pylori.

Готовили конъюгат наночастиц коллоидного золота размером 30 нм с МкАТ НР-387 согласно методике, указанной в патенте на изобретение RU 2642588 C1.

Раствор конъюгата методом пропитывания наносили на мембраны для конъюгата с плотностью нанесения 30 мкл на 1 см² и высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение 24 часов.

Для формирования тестовой зоны использовали МкАТ НР-1811, для формирования контрольной зоны – антивидовые антитела козы против иммуноглобулинов мыши в концентрации 10 мг×см^-3. Тест-системы высушивали при комнатной температуре в течение суток.

Склеивание тест-систем проводили последовательно: на нитроцеллюлозную мембрану наклеивали мембрану с иммобилизованным конъюгатом, мембрану для образца и мембрану для адсорбента. Затем полученный мультимембранный композит нарезали при помощи резака («Rahmenlos® Katze Geschenk Shirt», CША) на отдельные полоски шириной 3,5 ÷ 4,0 мм.

Разработанный экспериментальный образец иммунохроматографической тест-системы поясняется фиг. 1, на которой представлен состав мультимембранного композита и основные иммунохимические компоненты тест-системы:

1 – мембрана для нанесения образца TYPE-GFB-R4(0.35);

2 – конъюгат НчКЗ с МкАТ НР-387, нанесенный на мембрану РТ-R5;

3 – МкАТ НР-1811 в концентрации 12 мг×см^-3;

4 – нитроцеллюлозная мембрана TYРЕ-СNРF-SN12-L2-Р25 10μ;

5 – антивидовые козьи АТ против Ig мыши в концентрации 10 мг×см^-3;

6 – адсорбирующая мембрана TYPE-AP 045.

Усиление тест-системы лактатом серебра и гидрохиноном

На нитроцеллюлозную (рабочую) мембрану иммунохроматографической тест-системы наносили 0,075 % раствор лактата серебра. Оставляли сушиться в темноте на сутки. Полученную мембрану использовали для изготовления иммунохроматографических тест-систем.

На мембрану из стекловолокна PT-R5 наносили 3 % раствором гидрохинона, приготовленный на 0,5 М цитратном буфере с рН 4,0. Мембрану сушили при комнатной температуре в темном месте.

При тестировании иммунохроматографической тест-системы после нанесения на мембрану для образца исследуемого материала ждали 10 мин до появления сигнала в контрольной и, при наличии в пробе белка CagA H. pylori, в аналитической зоне, а затем накладывали поверх нитроцеллюлозной мембраны, в область детекции, мембрану из стекловолокна PT-R5, пропитанную 3 % раствором гидрохинона. Поверх мембран капали 30 мкл буфера разгона (0,01 М Трис-HCl буфер с 1 М NaCl с
0,1 % Tween-20, pH 7,5). Через 10 мин снимали мембрану с гидрохиноном и учитывали результат.

Изобретение иллюстрируется примерами сранительной оценки чувствительности немодифицированного и модифицированного, усиленного лактактом серебра и гидрохиноном, вариантов тест-системы с cag+ штаммом H. pylori и антигеном AGHPY-0100 («Arista Biologicals», США).

Пример 1. Тестирование немодифицированного и модифицированного вариантов иммунохроматографической тест-системы со штаммом H. pylori.

Для оценки чувствительности использовали cag+ штамм H. pylori. Данный штамм был выделены из биологических материалов лиц, имеющих в анамнезе гастрит и язвенную болезнь желудка (содержимое зубодесневых карманов и биоптаты слизистой оболочки желудка). Принадлежность культур к H.pylori подтверждена бактериологическим и биохимическим методами, а к cag+ штамму H. pylori – путем постановки ПЦР при использовании коммерческих тест-систем («Хеликопол VA», «Хеликопол CA», «Хеликопол IA», «Хеликопол BA» (Россия), «ДНК-технологии», Россия) и методом иммунохроматографии при использовании коммерческой тест-системы («NovaMed», Израиль).

Для тестирования использовали культуру H.pylori, разведенную буфером разгона начиная с концентрации 10×10⁹ с «шагом два» до концентрации 0,31×10⁹ м.к.×см^-3. В качестве контроля использовали буфер разгона.

На мембрану для образца немодифицированной и модифицированной тест-систем наносили 100 мкл исследуемой пробы в определенной концентрации. В случае с модифицированным вариантом, после нанесения культуры через 10-15 минут поверх тестовой и контрольной зон тест-систем накладывали мембрану PT-R5, пропитанную 3 % раствором гидрохинона.

Результаты определяли визуально в течение 20-25 мин. При наличии белка СagA H.pylori в пробе, при нанесении ее в объеме 100 мкл на подложку для образца, антиген взаимодействует с конъюгатом МкАТ с НчКЗ, образуя окрашенный иммунокомплекс «антиген-антитело», который движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозной мембраны, пересекает тестовую зону и взаимодействует с иммобилизованными на указанной тестовой зоне специфическими МкАТ – тестовая зоны окрашивается в розовый цвет. Далее несвязавшийся в тестовой зоне конъюгат продолжает движение вдоль хроматографической мембраны и взаимодействует с иммобилизованными в контрольной зоне антивидовыми кроличьим антителами против иммуноглобулинов мыши. В результате контрольная зона также окрашивается в розовый цвет, что является внутренним контролем теста. Если анализ проведен правильно, она должна проявляться всегда, независимо от присутствия антигена в исследуемом образце.

Результаты тестирования разработанных вариантов тест-систем с культурой H. pylori, представленные на фиг. 2, свидетельствуют о снижении порога детекции в четыре раза – с 2,5×10⁹ м.к.×см^-3 до 6,25×10⁸ м.к.×см^-3.

Пример 2. Тестирование иммунохроматографической тест-системы с антигенным препаратом AGHPY-0100 («Arista Biologicals», США)

В состав антигенного препарата AGHPY-0100 («Arista Biologicals», США) входят внутриклеточные белки H. pylori, ассоциированные с генами cagA (120 kd) и vacA (87 kd) и уреазой.

Исследование чувствительности иммунохроматографической тест-системы с антигенным препаратом AGHPY-0100 проводили аналогично, с использованием немодифицированного и модифицированного лактатом серебра вариатов тест-систем. Антиген разводили буфером разгона от 0,5 до 0,062 мг×см^-3 и наносили по 100 мкл на мембрану для образца. Результат оценивали через 20-25 мин.

Результаты анализа разработанных вариантов тест-систем с антигенным препаратом, представленные на фиг. 3, свидетельствуют о снижении порога детекции также в четыре раза – с 0,5 мг×см^-3 до 0,125 мг×см^-3.

Изобретение относится к области иммунохроматографического анализа. Способ повышения чувствительности иммунохроматографических тест-систем лактатом серебра и гидрохиноном заключается в том, что предварительно подготавливают две мембраны - нитроцеллюлозную, пропитанную 0,075 % раствором лактата серебра, и мембрану, обработанную 3 % раствором гидрохинона, приготовленным на 0,5 М цитратном буфере с рН 4,0; собирают готовый мультимембранный композит иммунохроматографической тест-системы путем наклеивания на нитроцеллюлозную мембрану с иммобилизованным конъюгатом, мембраны для образца и мембраны для абсорбента; тестируют готовую иммунохроматографическую тест-систему путем внесения 100 мкл пробы на мембрану для образца; накладывают через 10 минут после внесения пробы на детектируемую зону тест-системы мембрану, пропитанную 3 % раствором гидрохинона; наносят на наложенную мембрану 30 мл 0,01 М Трис-НСl буфера с 1 М NaCl с 0,1 % Tween-20, рН 7,5, через 5 мин удаляют мембрану с гидрохиноном и определяют в тестовой зоне детектируемый антиген. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности иммунохроматографических тест-систем, предназначенных для детекции как инфекционных, так и неинфекционных агентов, не менее чем в четыре раза. 3 ил., 2 пр.

Способ повышения чувствительности иммунохроматографических тест-систем лактатом серебра и гидрохиноном, заключающийся в том, что предварительно подготавливают две мембраны - нитроцеллюлозную, пропитанную 0,075 % раствором лактата серебра, и мембрану, обработанную 3 % раствором гидрохинона, приготовленным на 0,5 М цитратном буфере с рН 4,0; собирают готовый мультимембранный композит иммунохроматографической тест-системы путем наклеивания на нитроцеллюлозную мембрану с иммобилизованным конъюгатом, мембраны для образца и мембраны для абсорбента; тестируют готовую иммунохроматографическую тест-систему путем внесения 100 мкл пробы на мембрану для образца; накладывают через 10 минут после внесения пробы на детектируемую зону тест-системы мембрану, пропитанную 3 % раствором гидрохинона; наносят на наложенную мембрану 30 мл 0,01 М Трис-НСl буфера с 1 М NaCl с 0,1 % Tween-20, рН 7,5, через 5 мин удаляют мембрану с гидрохиноном и определяют в тестовой зоне детектируемый антиген.